Jagung merupakan salah satu komponen penting dalam

Transkripsi

1 Bulein 28 Teknik Peranian Vol. 15, No. 1, 2010: Heny Yusrini: Teknik pengujian kadar aflaoksin B1 pada jagung menggunakan ki ELISA TEKNIK PENGUJIAN KADAR AFLATOKSIN B1 PADA JAGUNG MENGGUNAKAN KIT ELISA Heny Yusrini Teknisi Likayasa Nonkelas pada Balai Besar Peneliian Veeriner Jalan R.E. Maradinaa No. 30, Koak Pos 52, Bogor 16114, Telp. (0251) , Faks. (0251) , Jagung merupakan salah sau komponen pening dalam pakan ernak. Keperluan jagung unuk pakan dan indusri pangan lebih besar dibanding unuk konsumsi langsung. Kebuuhan jagung unuk pakan diproyeksikan meningka dari 3,34 jua on pada ahun 2005 menjadi 4,90 jua on pada ahun 2010 (Direkora Jenderal Pengolahan dan Pemasaran Hasil Peranian 2007). Komposisi jagung pada pakan ernak mencapai 60%. Oleh karena iu, penggunaan jagung yang berkualias baik sanga pening unuk menghasilkan pakan yang bermuu baik. Masalah yang sering imbul dalam pemanfaaan jagung sebagai bahan pangan maupun pakan adalah konaminasi senyawa aflaoksin. Senyawa ini dihasilkan oleh kapang Aspergilus flavus yang umumnya umbuh pada jagung yang berkadar air inggi (>15%) akiba cara penyimpanan yang kurang benar (Rachmawai 2004). Secara kasa maa, kandungan aflaoksin pada jagung dapa erliha pada biji maupun ongkol yang berwarna semu ungu sampai ungu, dan bila diliha pada lampu florescens, warna ungu ersebu akan berpendar. Namun, cara ersebu hanya dapa digunakan bila kandungan aflaoksin pada jagung sudah inggi. Berdasarkan Sandar Nasional Indonesia (SNI 2000), kadar aflaoksin maksimal pada jagung unuk pakan adalah 50 ppb (par per billion). Unuk mengeahui kadar aflaoksin pada jagung secara epa, diperlukan meode yang ersandar, anara lain Enzyme Linked Immunosorben Assay (ELISA). Meode ELISA dapa dipilih sebagai meode skrining karena dapa menganalisis sampel jagung secara cepa, sensiif, dan relaif murah (Sanker dan Beier 1995). Balai Besar Peneliian Veeriner (Bbalive) elah berhasil mengembangkan perangka analisis aflaoksin meode ELISA berupa ki yang berisi pereaksi analisis dilengkapi dengan program pengolah daa (Rachmawai 2005). Percobaan berujuan unuk mengeahui eknik pengujian aflaoksin pada jagung dengan ki ELISA. BAHAN DAN METODE Percobaan dilaksanakan di laboraorium oksikologi Bbalive, Bogor, pada bulan Juni sampai November Kegiaan pengujian diawali dengan pengumpulan sampel jagung dari bagian diagnosik Bbalive dengan sampel jagung berasal dari pasaran. Selanjunya, sampel dianalisis unuk mengeahui kadar aflaoksinnya. Bahan yang digunakan unuk pengujian kadar aflaoksin adalah sampel jagung, bahan unuk eksraksi sampel yaiu meanol 60%, dan bahan unuk analisis aflaoksin yaiu perangka ki ELISA yang erdiri aas seri sandar aflaoksin B1 (AFB1) 0,12 ppb sampai dengan 30 ppb, pla pencampur, pla yang sudah dilapis anibodi (coaed anibody plae), konjuga AFB1 HRPO peka (1/100), pengencer konjuga laruan BSA/PBS, subsra A (bufer asea), subsra B (erameilbenzidin/dmso), dan laruan pengheni H 2 SO 4 1,25 M. Peralaan yang digunakan yaiu pipe mikro 1-10 µl, µl, dan µl, mulichannel pipe µl, reservoir, isu, pipe ip, effendorf, rak abung, imbangan, pla pencampur, pengocok, senrifuse, dan ELISA reader. Bagan alir analisis aflaoksin menggunakan ki ELISA yang dilakukan di laboraorium Bbalive dapa diliha pada Gambar 1. Preparasi Sampel Cara Kerja Sampel yang berupa biji jagung digiling dengan menggunakan penggiling Resel Muhle dan disaring dengan saringan 0,75 mesh, kemudian diambil subsampel. Preparasi Eksrak Sampel Unuk mengeksrak sampel, dibua 100 ml meanol 60% dengan cara mencampur 60 ml meanol pa dengan 40 ml akuades. Selanjunya, diimbang 25 g sampel jagung lalu dimasukkan ke dalam erlenmeyer 250 ml, dan diambahkan 50 ml meanol 60% lalu digoyang selama 30 meni. Campuran lalu disenrifuse pada rpm selama 15 meni. Laruan yang jernih diambil unuk digunakan sebagai bahan analisis. Pla mikro, baik pla pencampur maupun pla berlapis anibodi erdiri aas lubang-lubang (sumur), lubang ke bawah

2 Heny Yusrini: Teknik pengujian kadar aflaoksin B1 pada jagung menggunakan ki ELISA 29 Gambar 1. Dalam pla pencampuran 100 µl laruan sandar AFB1 aau eksrak sampel µl AFB1-HRPO (konjuga) Kocok Pipe 75 µl 75 µl Dimasukkan ke dalam lubang pada pla berlapis anibodi Inkubasi selama 5 meni Pla dicuci dengan akuades 3 kali + Subsra TMB, biarkan 10 meni + Laruan pengheni reaksi (50 µl), berubah warna kuning Baca pada ELISA reader (450 nm) Bagan alir analisis aflaoksin menggunakan ki ELISA, laboraorium Bbalive, Bogor, 2008 mulai dari A sampai H, ke samping mulai dari No 1 sampai 12, sehingga jumlahnya 96 lubang. Unuk memudahkan pelaksanaan analisis, dibua skesa Bagan I dan II sebagai acuan, (Tabel 1 dan 2).. Preparasi Konjuga Encer Unuk keperluan analisis, konjuga yang digunakan adalah konjuga encer, dibua dengan menambahkan 25 µl konjuga peka yang ersedia ke dalam seiap ml pengencer konjuga aau 200 µl ke dalam 8 ml pengencer konjuga (BSA/PBS 1%). Preparasi Laruan Subsra Unuk pengembangan warna pada mikropla sebelum ahap penambahan subsra, ke dalam bool berisi laruan subsra A masing-masing 11 ml diambahkan 330 µl laruan subsra B (erameilbenzidin/dalam DMSO). Tahapan kerjanya adalah sebagai beriku: Semua bahan dikondisikan pada suhu kamar. Pada pla pencampuran, dilakukan pencampuran anara sandar AFB1 dan konjuga encer sera eksrak sampel dan konjuga encer. Tabel 1. Bagan I: Posisi sandar AFB1 dan sampel pada pla pencampur, laboraorium Bbalive, Bogor, 2008 Sumur 1 2 A 100 µl sandar µl sd µl eksrak sampel 1 + konjuga B 100 µl sandar 1 (30 ppb) + konjuga 100 µl eksrak sampel 2 + konjuga C 100 µl sandar 2 (10 ppb) + konjuga 100 µl eksrak sampel 3 + konjuga D 100 µl sandar 3 (3,30 ppb) + konjuga 100 µl eksrak sampel 4 + konjuga E 100 µl sandar 4 (1,10 ppb) + konjuga 100 µl eksrak sampel 5 + konjuga F 100 µl sandar 5 (0,37 ppb) + konjuga 100 µl eksrak sampel 6 + konjuga G 100 µl sandar 6 (0,12 ppb) + konjuga 100 µl eksrak sampel 7 + konjuga H 100 µl sandar 0 + konjuga 100 µl eksrak sampel 8 + konjuga Tabel 2. Bagan II: Posisi sandar AFB1 dan sampel pada pla berlapis anibodi, laboraorium Bbalive, Bogor, 2008 Sumur A Blanko Blanko Spl 1 Spl 1 Spl 9 Spl 9 Spl 17 Spl 17 Spl 25 Spl 25 Blanko Blanko B Sd. 30 ppb Sd. 30 ppb Spl 2 Spl 2 Spl 10 Spl 10 Spl 18 Spl 18 Spl 26 Spl 26 Sd. 30 ppb Sd. 30 ppb C Sd. 10 ppb Sd. 10 ppb Spl 3 Spl 3 Spl 11 Spl 11 Spl 19 Spl 19 Spl 27 Spl 27 Sd. 10 ppb Sd. 10 ppb D Sd. 3,30 ppb Sd. 3,30 ppb Spl 4 Spl 4 Spl 12 Spl 12 Spl 20 Spl 20 Spl 28 Spl 28 Sd. 3,30 ppb Sd. 3,30 ppb E Sd. 1,10 ppb Sd. 3,30 ppb Spl 5 Spl 5 Spl 13 Spl 13 Spl 21 Spl 21 Sd. 1,10 ppb Sd. 3,30 ppb F Sd. 0,37 ppb Sd. 0,37 ppb Spl 6 Spl 6 Spl 14 Spl 14 Spl 22 Spl 22 Sd. 0,37 ppb Sd. 0,37 ppb G Sd. 0,12 ppb Sd. 0,12 ppb Spl 7 Spl 7 Spl 15 Spl 15 Spl 23 Spl 23 Sd. 0,12 ppb Sd. 0,12 ppb H Konrol Konrol Spl 8 Spl 8 Spl 16 Spl 16 Spl 24 Spl 24 Konrol Konrol Blanko (sandar 0): idak ada konjuga Spl 1 = sampel no. 1 kode J1 dan seerusnya Baris ke 11-12: diisi dengan dere sandar kembali Sd = sandar

3 30 Heny Yusrini: Teknik pengujian kadar aflaoksin B1 pada jagung menggunakan ki ELISA Laruan sandar 0 dipipe 100 µl lalu dimasukkan ke dalam sumur dere A 1 (unuk blanko) dan 100 µl pada sumur H 1 (unuk konrol). Selanjunya dimasukkan sandar AFB1, dimulai pada konsenrasi erkecil agar dapa menggunakan pipe ip yang sama. Laruan sandar 6 (0,12 ppb) dipipe 100 µl ke dalam sumur dere G 1, 100 µl laruan sandar 5 (0,37 ppb) ke dalam sumur dere F1, 100 µl laruan sandar 4 (1,10 ppb) ke dalam sumur dere E1, 100 µl laruan sandar 3 (3,30 ppb) ke dalam sumur dere D1, 100 µl laruan sandar 2 (10 ppb) ke dalam sumur dere C1, dan 100 µl laruan sandar 1 (30 ppb) ke dalam sumur dere B1. Unuk eksrak sampel jagung, ahapan kerjanya adalah sebagai beriku: Eksrak sampel 1 dipipe 100 µl lalu dimasukkan ke dalam sumur A2, selanjunya eksrak sampel 2 ke dalam sumur B 2, dan seerusnya. Pipe ip digani unuk seiap sampel. Laruan konjuga encer AFB1 HRPO 100 µl diambahkan ke dalam dere sumur 1 (B-H), kecuali sumur A1 (unuk blanko, sandar 0 idak diambah konjuga), dan ke dalam sumur yang berisi eksrak sampel (A2 sampai H2, A3 sampai H3, dan seerusnya). Ke dalam sumur A1 diambahkan lagi 100 µl sandar 0. Ke dalam pla yang erlapis anibodi, cara kerjanya adalah sebagai beriku: Dengan menggunakan mulichannel pipe, dilakukan pencampuran sandar dan konjuga aau eksrak sampel dan konjuga, dipipe dan keluarkan kembali dalam lubang yang sama sebanyak empa kali, kemudian dipindahkan sebanyak 75 µl laruan yang elah dicampur dalam pla pencampur ke dalam pla yang sudah dilapis anibodi sumur A1 sampai H1, dilakukan dua kali unuk duplikanya (A2 sampai H2). Unuk sampel, 75 µl laruan sampel eksrak (A2-H2) yang sudah dicampur dengan konjuga dimasukkan ke dalam pla pencampuran lalu dimasukkan ke dalam sumur pla yang erlapis anibodi A3 sampai H3, dilakukan duplikanya (A4- H4), dan seerusnya. Seelah selesai lalu diinkubasi dan biarkan selama 5 meni. Laruan dibuang dan pla dicuci iga kali dengan air. Laruan subsra disiapkan dengan mencampurkan subsra B (330 µl ) ke dalam sau bool laruan subsra A (11 ml). Selanjunya, diambahkan 100 µl laruan subsra yang sudah dicampur (subsra A + subsra B) dan dibiarkan 10 meni. Pada ahap ini akan erbenuk warna hijau; makin inggi konsenrasi AFB1 pada pla mikro aau makin inggi konsenrasi AFB1 pada sampel, warna yang erbenuk makin pudar. Tambahkan 50 µl laruan pengheni, warna laruan pada pla mikro berubah menjadi kuning. Inensias warna dibaca pada ELISA reader (450 nm). Pencaaan Daa Pembacaan pla mikro pada ELISA reader diperoleh nilai serapan warna (opical densiy, OD aau absorban, A) unuk masing-masing sumur ( blanko sandar, sandar, dan sampel). Selanjunya dihiung nilai persenase inhibisinya unuk masing-masing sandar dan sampel dengan rumus sebagai beriku: {1 - (A sandar - A blanko sandar)} % inhibisi sandar = x 100 A konrol - A blanko sandar {1 - (A sampel - A blanko sandar)} % inhibisi sampel = x 100 A konrol - A blanko sandar Persenase inhibisi sandar dan sampel dihiung dengan program yang disediakan dan kurva kalibrasi sandar, yaiu plo anara persen inhibisi sandar versus log konsenrasi AFB1 akan muncul. Selanjunya, dengan memasukkan nilai OD yang diperoleh ke dalam program pengolahan daa yang disiapkan dapa dikeahui konsenrasi sampel. Jika persenase inhibisi sampel yang diperoleh lebih besar dari persenase inhibisi sandar ppb, berari sampel mengandung AFB1 inggi. Jika persenase inhibisi negaif berari sampel idak mengandung aflaoksin (AFB1 di bawah limi deeksi, < 0,30 ppb) HASIL DAN PEMBAHASAN Tabel 3 menyajikan hasil pembacaan seri sandar AFB1 dari konsenrasi inggi (30 ppb) (B1,2 dan B11,12) sampai rendah (0,12 ppb) (G1,2 dan G11,12). Pembacaan dilakukan duplo (dua kali), yaiu unuk kolom 1 dan 2, sedangkan unuk kolom selanjunya (kolom 3-10) adalah hasil pembacaan OD sampel, sedangkan kolom 11 dan 12 unuk OD sandar. Nilai OD yang diperoleh diraa-raakan seperi disajikan pada Tabel 4. Selanjunya persen inhibisi dihiung berdasarkan rumus (sudah disediakan dalam program) dan hasilnya disajikan pada Tabel 5. Kadar AFB1 pada sampel jagung dapa dikeahui dengan mengacu pada kalibrasi sandar pada Gambar 2 unuk sampel J1- J16 dan kalibrasi sandar (Gambar 3) unuk sampel J17-J28.

4 Heny Yusrini: Teknik pengujian kadar aflaoksin B1 pada jagung menggunakan ki ELISA 31 Tabel 3. Hasil pembacaan opical densiy (OD) sampel jagung pada ELISA reader, laboraorium Bbalive, Bogor, 2008 Sumur Kolom A 0,085 0,080 0,432 0,783 0,196 0,186 0,367 0,370 0,075 0,080 0,076 0,075 B 0,179 0,175 0,391 0,469 0,219 0,184 0,460 0,467 0,074 0,074 0,103 0,114 C 0,274 0,225 0,207 0,186 0,245 0,196 0,502 0,470 0,075 0,080 0,148 0,163 D 0,369 0,369 0,579 0,555 0,661 0,391 0,389 0,376 0,280 0,348 0,193 0,230 E 0,438 0,432 0,379 0,609 0,703 0,572 0,077 0,079 0,341 0,341 F 0,536 0,489 0,192 0,194 0,416 0,681 0,077 0,079 0,408 0,399 G 0,557 0,564 0,166 0,159 0,474 0,561 0,310 0,316 0,460 0,432 H 0,602 0,601 0,167 0,197 0,170 0,148 0,561 0,424 0,574 0,587 Kolom 1 dan 2 sera kolom 7 dan 8 adalah nilai OD sandar AFB1, dari A sd 0 (blanko), B sd 30 ppb, C 10 ppb, D 3,30 ppb, E 1,10 ppb, F 0,37 ppb, G 0,12 ppb, dan H konrol posiif Kolom 3-6 dan kolom 9-12 adalah nilai OD sampel jagung masing-masing dianalisis duplo (3, 4), (5, 6), (9, 10), dan (11, 12) Tabel 4. Raa-raa nilai opical densiy (OD) sandar aflaoksin B1 (AFB1) dan sampel jagung, laboraorium Bbalive, Bogor, 2008 Sandar AFBI OD Sampel OD Sampel OD Sampel OD Sampel OD Sandar AFB1 OD Sd 0 0,085 J1 0,608 J9 0,191 J17 0,369 J25 0,078 Sd 0 0, ppb 0,177 J2 0,430 J10 0,202 J18 0,464 J26 0, ppb 0, ppb 0,250 J3 0,197 J11 0,221 J19 0,486 J27 0, ppb 0,156 3,30 ppb 0,369 J4 0,567 J12 0,526 J20 0,383 J28 0,314 3,30 ppb 0,212 1,10 ppb 0,435 J5 0,494 J13 0,638 J21 0,078 1,10 ppb 0,341 0,37 ppb 0,513 J6 0,193 J14 0,548 J22 0,078 0,37 ppb 0,404 0,12 ppb 0,561 J7 0,163 J15 0,518 J23 0,313 0,12 ppb 0,446 Konrol 0,602 J8 0,182 J16 0,519 J24 0,493 Konrol 0,581 Tabel 5. Persen inhibisi sandar aflaoksin B1 (AFB1) dan sampel jagung, laboraorium Bbalive, Bogor, 2008 Sandar AFB1 % inhibisi Sampel % inhibisi Sampel % inhibisi Sampel % inhibisi Sampel % inhibisi Sandar % inhibisi J1-1 J9 68,2 J17 36,5 J25 86, ,6 J2 28,5 J10 66,5 J18 20,2 J26 87, , ,5 J3 67,3 J11 63,3 J19 16,3 J27 86, ,2 3,30 38,7 J4 5,7 J12 12,6 J20 34,1 J28 45,9 3,30 63,6 1,10 27,7 J5 17,9 J13-6,0 J21 86,6 1,10 41,3 0,37 14,8 J6 67,9 J14 8,8 J22 86,6 0,37 30,5 0,12 6,8 J7 73,0 J15 14,0 J23 46,1 0,12 23,2 J8 69,7 J16 73,6 J24 15,2 % inhibisi y = 12,95Ln(x) + 26,508 R 2 = 0,9916 % inhibisi 100 y = 12,145Ln(x) R 2 = 0, Aflaoksin B1 (ng/ml) Aflaoksin B1 (ng/ml) Gambar 2. Kalibrasi sandar aflaoksin B1 (AFB1) unuk menghiung kadar AFB1 pada sampel jagung (J1-J16), laboraorium Bbalive, Bogor, 2008 Gambar 3. Kalibrasi sandar aflaoksin B1 (AFB1) unuk menghiung kadar AFB1 pada sampel jagung (J17-J28), laboraorium Bbalive, Bogor, 2008

5 32 Heny Yusrini: Teknik pengujian kadar aflaoksin B1 pada jagung menggunakan ki ELISA Hasil analisis kadar AFB1 pada sampel jagung disajikan pada Tabel 6. Berdasarkan daa pada Tabel 6 dikeahui bahwa 8 dari 28 sampel jagung (28,60%) yang dianalisis mengandung AFB1 dengan kadar di aas baku muu yang dipersyarakan SNI 2000, yaiu kadar AFB1 > 50 ppb. Kadar AFB1 yang inggi pada jagung akan berpengaruh erhadap kualias pakan yang dihasilkan. Oleh karena iu, diperlukan indakan unuk mengamankan produksi pakan dengan kualias yang baik, eruama dengan kadar AFB1 rendah sesuai dengan yang dipersyarakan SNI. Upaya yang dapa dilakukan melipui pengeringan dan penyimpanan yang epa unuk mendapakan kadar air jagung yang aman. Syara muu kadar air jagung dalam SNI 2000 adalah 5-14%. Tabel 6. Kadar aflaoksin B1 (AFB1) pada sampel jagung, laboraorium Bbalive, Bogor, 2008 Sampel Kadar AFB1 (ppb) J1 J2 2,3 J3 46,8 J4 0,4 J5 1,0 J6 48,9 J7 72,4 J8 56,4 J9 50,2 J10 43,9 J11 34,4 J12 0,7 J13 J14 0,5 J15 0,8 J16 75,7 J17 1,1 J18 0,3 J19 0,2 J20 0,9 J21 > 60 J22 > 60 J23 2,5 J24 0,2 J25 > 60 J26 > 60 J27 > 60 J28 2,5 = idak erdeeksi (kadar AFB1 < limi deeksi yaiu < 0,30 ppb) KESIMPULAN DAN SARAN Sebanyak 8 sampel dari 28 sampel jagung yang dianalisis (28,60%) mengandung aflaoksin B1 melebihi sandar berdasarkan Sandar Nasional Indonesia (SNI 2000). Sebaiknya konrol kualias jagung dari konaminan aflaoksin dapa dibakukan secara ruin sebagai indakan anisipasi unuk menghasilkan pakan berkualias baik, bebas dari aflaoksin, aau mengandung aflaoksinnya maksimal 50 ppb, sesuai acuan dalam SNI. UCAPAN TERIMA KASIH Penulis mengucapkan erima kasih kepada Ibu Sri Rachmawai, BSc, MSc, penelii pada Keli Toksikologi Balai Besar Peneliian Veeriner, aas banuan perangka ki ELISA unuk analisis aflaoksin sera bimbingannya. DAFTAR PUSTAKA Direkora Jenderal Pengolahan dan Pemasaran Hasil Peranian Teknologi pascapanen jagung unuk penanggulangan aflaoksin dalam upaya peningkaan daya saing dan pendapaan peani. Makalah disampaikan pada Aflaoksin Forum II, Yogyakara, Juli Rachmawai, S Uji banding anarlaboraorium, pengujian ELISA ki aflaoksin. Laporan hasil kegiaan kerja sama anara Balai Peneliian Veeriner dengan PT Sina Prima Feedmill, PT Sierad Tbk, Balai Pengujian Muu Pakan Ternak, dan Balai Penyidikan dan Pengujian Veeriner Regional IV. hlm Rachmawai, S Aflaoksin pada pakan di Indonesia: Persyaraan kadar dan perauran perundang-undangannya. Warazoa 4(1): SNI (Sandard Naional Indonesia) Maximum Residue Limi for Microbial and Chemical Conaminaion in Animal Produc. Naional Sandardizaion Agency, Jakara, Indonesia. Sanker, L.H. and R.C. Beier Inroducion o immunoassay for residue analysis: Concep, formas and applicaions in immunoassays for residue analysis. p In. ELISA Workshop. Simple Tes for Monioring Mycooxins and Pesisides in Produce. Posharves Technology Insiue. Ho Chi Minh Ciy, Vienam, November Universiy of Sydney.