PERBANYAKAN SPORA T. asperellum T 13 dana. niger A 1 DALAMMEDIA PADAT DAN CAIR ABSTRAK

Transkripsi

1 41 PERBANYAKAN SPORA T. sperellum T 13 dna. niger A 1 DALAMMEDIA PADAT DAN CAIR ABSTRAK Tujun penelitin dlh mendptkn medi pdt dn ir terik untuk pernykn spor A. niger A 1 dn T. sperellumt 13. Di smping itu dilkukn nlisis pementukn sm sitrt, mlt, okslt dn α-ketoglutrt sert IAA, GA dn ABA selm ms inkusi. Sedng pemektn spor dri kpng uji dilkukn dengn eerp keeptn sentrifugsi. Dilkukn pr-inokulsi dn seleksi wl dengn perendmn medi uji dlm kudes senyk 5, 10 dn 15 ml, msing-msing selm 1 dn 2 jm seelum medi disterilissi. Hsil yng diperoleh menunjukkn hw pr-perlkun terik dlh penmhn 5 ml kudesdengn perendmn selm 2 jm. Medi pernykn pdt terpilih dlh jgung, ers dn milet, medi irt. sperellum T 13 terpilih dlht 1-2, T 3-4, T 5-6, T 7-8, T 9 dnt 10 dn untuk A. niger A 1 dlh A 1-2, A 3, A 4, A 5, A 6, A 7-8, A 9, dn A 10. Spor T. sperellum T 13 ternyk 5,34 x spk/ml diperoleh dri medi milet dn 3,1x10 10 spk/ml dri medi ir T 3-4. Spor A. niger A 1 ternyk 3,03 x spk/ml diperoleh dri medi ers merh, dn 1,6 x spk/ml dri medi ir A 5. Produksi spor erkorelsi nyt positif dengn penurunn ph dn produksi sm sitrt, mlt, okslt dn α-ketoglutrt. Asmsm orgnik diproduksi tinggi pd hri ketig. Produksi sm sitrt pd medi pdt leih tinggi pd hri ketig sementr medi ir pd hri ke 6 untuk kedu kpng uji. Asm sitrt ternyk 2.533,27 ppm dihsilkn pd medi T 1-2untuk T. sperellumt 13 dn 872,46 ppm pd media 3 untuk A. niger A 1. Produksi fitohormon pd hri ke enm inokulsi sngt fluktutif dn sngt rgm.t. sperellum T 13 memproduksi IAA tertinggi5.445,01 ppm pd medi milet, ABA 764,65 ppm pd T 7-8 dn763,58 ppm pd medi T 3-4 dn produksi 445,01 ppm GA pd milet. A. niger A 1 memproduksi IAA tertinggi 1.588,32 ppm pd medi milet, ABA173,61 ppm pd medi A 4 dnaba 2.617,14 ppm pd ers merh.pemektn spor terik dlh sentrifugsi pd kondisi suhu 4 o C selm 5 menit dengn keeptn g untuk T. sperellum T 13 dn g untuk A. niger A 1. Kt kuni :Aspergillus niger,trihoderm sperellum, sm indol sett, sm gierelt, sm sist, sm mlt, sm sitrt, sm okslt, sm α-ketoglutrt, pemektn spor. PENDAHULUAN Produksi iofertilizer dn iofungisid yng ersis mikro pd umumny dikemsdlm entuk spor dengn hn pemw. Mslh yng dihdpi dlm produk hyti ersis mikro dlh teknik pernykn spor

2 42 yng produktif dn efisien, r pengemsn yng mmpu memperthnkn viilits spor dlm jngk wktu tertentu, sert r pengemsn yng efisien. Pernykn spor dlh proses penggndn jumlh spor kpng yngdpt dilkukn menggunkn medipdt mupun ir. Bhn dlm entuk pdt mupun ir yng mengndung spor dn ditmhkn pd sustrt diseut inokulum.medi pernykn spor dpt menggunkn hn lmi mupun sintetik.fktor yng menentukn pertumuhn dlh kndungn ir, kron, nitrogen, minerl, vitmin dn hn tmhn linny. Pertumuhn mikro dpt dilkukn dlm kultur dim tu goyng, yng kn memedkn ersi. Bnykny udr yng tersedi untuk kultur menentukn peredn pertumuhn mupun hsil metolisme yng dihsilkn oleh setip jeniskpng. Kpng memerlukn wktu 3-5 hri untuk pertumuhn di medi medi pdt.kpng menghsilkn enzim ser optimum pd hri ke tig. Pertumuhn kpng dpt digi dlm 6 fse, dn produksi spor ternyk erlngsung pd fse eksponensil, dimn dihsilkn enzim yng menghmt pertumuhn, sehingg spor kpng sudh dientuk ser optiml untuk dpt erthn hidup. Sustrt merupkn hn yng kn dimetolisme oleh kpng gr erthn hidup. Untuk produksi mssl, medi pernykn spor umumny menggunkn limh pertnin.hl yng perlu diperhtikn dlm penggunn medi dlh komposisi hn yng menkup kemurnin hn, rsio C/N, tersediny nutrisi. Selin itu perlu diperhtikn pengruh penmpurn hn, ph, efek sterilissi pd minerl dn grm dn dny peruhn pd medi seelum dns setelh inokulsi seperti suhu, ersi, dn ntifom. Selm proses pernyknkpng melkukn reksi metolisme dn hsil metolismediekskresikn ke dlm medi, ik erup metolit primer seperti sm-sm orgnik sitrt, okslt, mlt dn α-ketoglutrt. Dismping itu dihsilkn jug fitohormon sm indol sett (IAA), sm gierelt (GA) dn sm ist (ABA). Reksi yng terjdi merupkn proses peruhn kimi yng diktlis oleh enzim-enzim kpng, dn mengkitkn peruhn krkteristik medi, dintrny penurunn ph.

3 43 Asm sitrt merupkn slh stu metolit primer yng dihsilkn oleh kpnga. niger, dn ert huungnny dengn ktivits pelrutn fosft dlm tnh yng erlngsung kit dri efek penurunn ph dn pengkeltn ktionktion. Fitohormon merupkn hsil metolit sekunder yng dihsilkn pd kondisi tertentu. Bilkyet l. (2010) menytkn produksi IAA A. niger tertinggi dihsilkn pd hri ke enm, sedngkn GA pd hri ke 12. Selin itu, kultur dengn pengookn dilporkn menghsilkn fitohormon leih tinggi dindingkn dengn kultur sttis. Thpn setelh spor diproduksi dlh penyimpnn dlm hn pemw. Semkin esr jumlh spor yng diproduksi, kn semkin nyk diperlukn hn pemw yng mungkin kn menimulkn mslh trnsportsi ke lpng untuk dipliksikn.pemektn spor merupkn slh stu lterntif untuk efisiensi kemsn dn pengirimn. Beerp teknik yng sudh dikenl dintrny sentrifugsi yng telh diteliti oleh Chrvt (2007) untuk spor mikoriz, Bssel dn Miller (1982) memektkn spor pkis Onole sensiilis L., Zhou et l. (2006) memektkn Billus thuringiensis dn d Enfert dn Mol (2005) memektkn A.fumigtus. Teknik kering eku yng isny digunkn untuk preservsi jngk pnjng dpt jug dijdikn lterntif segi pemektn spor kren irn yng menyerti spor kn diupkn pd teknik L-drying tu disulimsi pd teknik kering eku tu liofilissi (Ilys 2007). Tujun penelitin ini dlh untuk mendptkn medi terik untuk pernykn spor, sert teknik sentrifugsi untuk pemektn spor yng optimum untuk kpngt. sperellum T 13 dn A.niger A 1. BAHAN DAN METODE Peron terdiri dri lim kegitn, yitu (i) optimsi perlkun prinokulsi medi pdt pernykn spor, (ii) seleksi wl medi pernykn spor, (iii) optimsi medi pernykn spor, (iv) nlisis sm-sm orgnik dn fitohormon dn (v) penetpn teknik pemektn spor dengn sentrifugsi.

4 44 Optimsi Perlkun Pr-inokulsi Medi Pdt Pernykn Spor Du kpngindigenusyng diuji, yitut.sperellum T 13 dn A.niger A 1. Peron didisin erdsrkn rnngn lingkungn k lengkp (RAL) dengn du fktor, yitu fktor perendmn selm 1 dn 2 jm. Fktor kedu, yitu volume kudes yng ditmhkn dlm medi dengn tig trf, yitu 5,10 dn 15 ml. Medi pdt yng digunkn,yitu ers merh, ers menir, jgung, jgung menir dn milet. Perlkun diulng senyk enm kli. Medi pdt direndm sempurn selm stu dn du jm dlm ir pns. Medi yng sudh direndm selnjutny ditimng senyk 10 g dlm kemsn plstik thn pns ukurn 0,5 kg dn ditmhkn 5, 10 dn 15mL kudes llu disterilissi dengn utoklf pd suhu 121 o C, 30 menit dn dikeringnginkn dlm iosfety inet (Lmpirn 12). Suspensi kpng disipkn dengn menmhkn 100 ml NCl 0,85% steril pd du wn Petri yng erisi ikn kpng erumur 2 smpi 3 minggu, dn dikook selm 15 menit dengn keeptn 150 rpm (Lmpirn 11). Selnjutny senyk 1 ml suspensi spor diinokulsikn ke dlm kntong erisi medi pdt llu ditutup menggunkn plsti seler mementuk prism segitig. Medi diinkusi selm 6 hri dlm kotk dlm kondisi gelp. Spor dipnen dengn r menmhkn 100 ml lrutn NCl 0,85% steril ke dlm otol seli erisi medi spor, mengookny di ts pengook dengn keeptn 150 rpmselm 15 menit (Lmpirn 14). Penghitungn jumlh spor dilkukn dengn menggunkn hemsitometer(jiswl 2005) dengn modifiksi. Spor visul, kemudhn pnen dn kepdtn miseli dinili ser ktegorik pd sklskor 1-5 selnjutny diuji erdsrkn uji non-prmetrik Kruskl-Wlis.

5 45 Seleksi Awl Medi Pernykn Spor Seleksi Awl Medi pdt Medi pdt direndm sempurn selm 2 jm dlm ir pns. Medi yng sudh direndm selnjutny ditimng senyk 10 g dlm kemsn plstik thn pns ukurn 0,5 kg dn ditmhkn 5mL kudes llu disterilissi dengn utoklf pd suhu 121 o C, 30 menit dn dikeringnginkn dlm iosfety inet. Selnjutny perlkun sm dengn peron pr-inokulsi. Seleksi Awl Medi ir Untuk pernykn spora. niger A 1 digunkn enm jenis medi dn delpn jenis medi T. sperellum T 13. Senyk 200 µlsuspensi spor diinokulsikn ke dlm lu Erlenmeyer erukurn 250 ml, yng msingmsing erisi 50 ml medi ir yng digunkn, yitu T 1-2, T 3-4, T 5-6, T 7-8, T 9 dn T 10 (Tel 4) untuk T. sperellum T 13 dn delpn medi ir, yitu A 1-2, A3, A 4, A 5, A 6, A 7-8, A 9 dn A 10 untuk A. niger A 1 (Tel 5). Inkusi dilkukn dlm inkutor 28 o C selm enm hri. Perlkun diulng senyk enm kli. Peuh yng diukur dlh kemmpun menghsilkn spor pd hri ke 6 ser visul. Medi yng mmpu memenuhipermukn medi dengn spor digunkn selnjutny (Jiswl et l. 2005) dengn modifiksi. Optimsi Medi untuk Pernykn Spor Peron dilkukn untuk memperoleh jenis medi terik untuk pernykn spor T. sperellum T 13 dn A. niger A 1. Peron terdiri dri du kegitn, yitu pernyknspor dlm medi pdt dn medi ir terseleksi. Optimsi Medi Pdt untuk Pernykn Spor Bers merh, milet, jgung dn ers putihdigunkn dlm peron optimsi yng msing-msing diulng senyk enm kli. Senyk 1 ml suspensi kpng uji diinokulsikn ke dlm 10 g medi pdt pernykn steril dlm kntong plstik. Medi disipkn erdsrkn hsil peron prinokulsi. Inkusi dn penghitungn spor dilkukn sm seperti perlkun seleksi wl (Lmpirn 13).Peuh lin yng diukur dlh ph wl dn hri

6 46 keenm inkusi (Lmpirn 3), di smping itu dilkukn nlisis terentukny sm sitrt, mlt dn α-ketoglutrt sert sm indol sett (IAA), sm gierelt (GA) dn sm sist(aba) menggunkn UPLC (Lmpirn 15 dn 16). Optimsi Medi Cir untuk Pernykn Spor Jenis medi yng diuji terdiri dri enmjenis medi T. sperellumt 13 dn delpnjenis medi A. niger A 1 dengn peredn komposisi erdsrkn sumer kron, nitrogen dn minerl mkro mupun mikro (Tel 4 dn 5). Tel 4 Komposisi medi ir T. sperellum T 13 Komposisi T 1-2 T 3-4 T 5-6 T 7-8 T 9 T 10 g/l Yest extrt 2,80 20,00 5,00 Glukos 30,00 KH 2 PO 4 1,00 1,00 MgSO 4,7H 2 O 0,50 0,50 KCl 0,50 0,50 FeSO 4.7H 2 O 0,01 0,01 ZnSO 4 0,01 0,01 CuSO 4 0,005 0,005 (NH 4 ) 2 SO 4 10,00 Sukros 20,00 10,00 5,00 5,00 5,00 Jgung 60,00 Kentng 60,00 Bers putih 60,00 Tel 5Komposisi medi ir A. niger A 1 Komposisi A 1-2 A 3 A 4 A 5 A 6 A 7-8 A 9 A 10 g/l Al(PO 4 ) 5,00 5,00 5,00 C 3 (PO 4 ) 2 5,00 5,00 NCl 0,20 0,20 0,20 0,10 0,10 MnSO 4.7H 2 O 0,0025 0,0025 0,0025 0,0025 0,0025 MgSO 4,7H 2 O 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 KCl 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 FeSO 4.7H 2 O 0,0025 0,0025 0,0025 0,0025 0,0025 (NH 4 ) 2 SO 4 0,50 1,00 1,00 1,00 1,00 Glukos 10,00 Yest 0,50 0,10 0,10 0,10 0,10 CCl 2 0,200 0,200 0,200 0,400 Sukros 10,00 5,00 10,00 10,00 5,00 5,00 5,00 Jgung 60,00 Kentng 60,00 Bers putih 60,00

7 47 Senyk 50 ml medi ir diinokulsi dengn 200 µl suspensi spor. Medi diinkusi selm 6 hri dlm inkutor 28 o C (Lmpirn 13). Perlkun diulng senyk enm kli dn peuh yng dimti dlh jumlh spor, penurunn ph, produksi sm-sm orgnik sert kndungnfitohormon(lmpirn 15). Anlisis Asm Sitrt, Mlt, α-ketoglutrt, IAA, GA dn ABA Senyk 2 ml dri msing-msing ikn uji hsil inokulsi erumur 6 hri disentrifugsi pd keeptn g selm 5 menit. Dri ontoh uji kemudin dinlisis kndungn sm sitrt, sm mlt dn sm α-ketoglutrt. Di smping itu jug dinlisis kndungn IAA, ABA dn GAdilkukn menggunkn UPLC (Lmpirn 16). Anlisis kromtogrfi menggunkn Aquity UPLC H-Clss. Ekstrk smpel senyk 1 µl diinjeksikn ke dlm kolom Aquity UPLC BEH C 18 (1,7 µm, 2,1 x 50 mm) dengn detektor Aquity UPLC PDA. Anlisis hormon menggunkn elusi isokrtik dengn fse gerk kudes dijdikn ph 4,0 oleh penmhn H 3 PO 4 dn setonitril (74:26) dn lju lir 0,2 ml/menit. Signl komponen dimonitor pd pnjng gelomng 208 nm selm 3 menit. Sedngkn nlisis sm orgnik menggunkn elusi isokrtik dengn fse gerk kudes dijdikn ph 2,5 oleh penmhn H 2 SO 4 dn lju lir 0,1 ml/menit. Signl komponen dimonitor pd pnjng gelomng 210 nm selm 4,5 menit. Stndr hormon (sm indol-3- sett, sm gierellt, dn sm sist) dn sm orgnik (sm okslt, sm sitrt, sm mlet, dn sm α-ketoglutrt) dilrutkn dlm fse gerk msingmsing. Metode Anlisis Dt Penentun medi optimum dilkukn erdsrkn nlisis LSD. Apil terdpt peuh yng memerikn pengruh nyt (F hitung >F tel ), mk dilnjutkn dengn uji Dunn (DMRT) pd selng keperyn 95% untuk menguji ed ntr perlkun. Huungn korelsi di ntr ph, spor dn smsm orgnik diukur erdsrkn koefisien korelsi Person.

8 48 Penetpn Teknik Pemektn Spor dengn Sentrifugsi Senyk 2 ml 1,7x10 9 stun pementuk koloni (spk)/ml suspensi spor T. sperellum T 13 dn 3,9x10 8 spk/ml A. niger A 1 dimsukkn ke dlm tung mikro 2 ml, selnjutny disentrifugsi untuk pemektn spor uji (Lmpirn 17). Sentrifugsi dilkukn pd suhu 4 o C selm 5 menit dengn enm keeptn yng diuji, yitu : g, g, g, g, g dn g. Keeptn sentrifugsi terik disimpulkn erdsrkn keeptn yng menghsilkn jumlh spor terendh yng tertinggl dlm superntn. Spor dihitung menggunkn hemsitometer. Jumlh terseut merupkn nili kehilngn yng hrus diminimlissi. Setip perlkun diulng senyk enm kli. Frksi pelet hsil sentrifugsi diresuspensi dengn menmhkn 1 ml NCl 0,85% dn senyk 1 ml ditumuhkn dlm medi PDB gr dengn teknik tung wn. Spor dihitung menggunkn olony ounter. HASIL DAN PEMBAHASAN Optimsi Perlkun Pr-inokulsi pd Medi Pernykn Pdt Hsil yng diperoleh menunjukkn hw pengmtn spor ser visul dn kemudhn pnen tidk ered nyt ntrperlkun perendmn selm 1 jm dlm 10 ml kudes dengn perlkun perendmn selm 2 jm dlm 5 ml kudes, dengn sedikit leih tinggi pd 2 jm 5 ml. Produksi spor terik dlh pd kondisi perendmn 1 jm dlm kudes 10 mlnmun tidk ered nyt dengn perlkun 2 jm dlm 5 ml(tel 6). Kondisi optimum prinokulsi yng ditetpkn dlh 2 jm perendmn dlm ir pns (60 o C) dengn penmhn kudes 5 ml dn sterilissi utoklf 121 o C 30 menit. Kondisi ini dimil erdsrkn tidk dny peredn kemudhn pnen, miseli dn spor ser visul. Selin itu, tidk terdpt ed nyt pd jumlh spor perlkun 1 jm 10 ml dn 2 jm 5 ml. Penetpn 2 jm perendmn didsri ts pertimngn memerikn ketersedin ir yng leih nyk untuk mendukung pertumuhn spor dn perendmn dlm ir pns

9 49 ertujun untuk menyipkn tekstur medi yng leih lunk ps utoklf untuk memudhkn pelektn miseli. Tel 6 Interksi wktu perendmn dn penmhn ir terhdp spor visul, miseli, kemudhn pnen dn jumlh spor Prendmn 1 Jm 2 jm Vol. Air (ml) SporVisul tn Miseli tn Kemudhn Pnen tn Jumlh Spor (10 8 spk/ml) * ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± 4.18 Keterngn : tn : tidk ered nyt (P>0.05), * : ered nyt (p<0.05) menurut uji lnjut LSD pd selng keperyn 95%.Angk yng diikuti oleh huruf yng sm tidk ered nyt pd uji lnjut LSD dengn selng keperyn 95%. Seleksi Awl Medi Pernykn Spor Medierpengruh nyt terhdp produksi spor, produksi miseli dn tingkt kemudhn pnen. Produksi spor tertinggi diperoleh dri medi ers merh, yitu senyk 8,13 x10 8 spk/ml suspensi. Bers merh mengndung leih nyk minerl seperti Mn, Fe, N dn Mg dindingkn dengn medi linny. Hsil spor tidk ered nyt terdpt pd medi jgung. Umumny elemen-elemen ini erpern segi kofktor dlm reksi-reksi metolisme iokimiwi. Sedngkn produksi spor pd medi milet, jgung menir dn ers menir leih rendh (Gmr 8). Menurut Sntik (2010) kemmpun ers merh menghsilkn spor ternyk didug disekn ph yng tidk sm, kndungnprotein,zn, Fe, dn timin yng leih tinggi. Kemudhn pnen tertinggi diperoleh pd milet dn jgung (Tel 7).Milet erup utirn iji erentuk ult reltif keil, tidk hnur oleh persn, dn tidk lengket. Spor tumuh erup lpisn tipis di ts permukn ser mert sehingg mudh diils pd st pnen. Sporkpng enderung tumuh semkin nyk pd permukn medi semkin lus dn oksigen ukup nyk. Pnen yng reltif leih sulit terjdi pd medi menir, hl ini disekn struktur medi leih ir dn lengket (Tel 7). Medi menir tidk digunkn untuk peron selnjutny.pertumuhn miseli ernding terlik dengn

10 50 spor. Umumny miseli dihsilkn melimph pd kondisi menguntungkn gi kpngseperti pd medi yng ky kn nutrisi. Ser umum, produksi spor oleh T.sperellum T 13 dri hsil perhitungn hemsitometer dn pengmtn visul leih tinggi dengn peredn nyt dindingkn dengn A.niger A 1. Produksi miseli ernding terlik dengn spor (Tel 8). Tidk terdpt peredn nyt untuk kemudhn pemnenn spor pd kedu kpng uji. Gmr 8Kemudhn pnen, produksi spor, dn produksi miseli pd medi pdt. Keterngn :Jumlh spor dinytkn dlm 10 8 spk/ml. Tel 7 Produksi spor, miseli dn tingkt kemudhn pnen pd medi pernykn pdt Jenis Medi Jumlh spor Produksi miseli (x10 8 spk/ml) Tingkt Kemudhn pnen Bers Menir 2,85 ± 2,84 1,88 ± 1,36 1,13 ± 0,35 Bers Merh 8,13 ± 2,67 1,50 ± 0,92 2,50 ± 0,53 Jgung 5,41 ± 5,35 1,00 ± 0,53 2,75 ± 0,71 Jgung Menir 2,42 ± 1,79 2,88 ± 1,55 2,13 ± 0,83 Milet 3,46 ± 2,12 1,38 ± 0,92 3,00 ± 0,00 Keterngn: : ered sngt nyt (P<0.01),menurut uji lnjut LSD pd selng keperyn 95%. Angk yng diikuti oleh huruf yng sm tidk ered nyt pd uji lnjut LSD dengn selng keperyn 95%. Tel 8 Produksi spor, kemudhn pnen, produksi miseli dn spor visul pd du kpng uji Medium Spor Kemudhn Pnen tn Miseli SporVisul Aspergilus 2,36±2,09 2,02±1,08 2,20±1,65 2,10±1,79 Trihoderm 6,81±3,70 1,87±0,87 1,43±0,56 4,10±1,00 Keterngn: * * : ered sngt nyt (P<0.01), *tn : tidk erednyt (P>0.05)menurut uji lnjut LSD pd selng keperyn 95%. Angk yng diikuti oleh huruf yng sm tidk ered nyt pd uji lnjut LSD dengn selng keperyn 95%.

11 51 Optimsi Medi Pernykn Spor Produksi Spor pd Medi Pernykn Pernykn spor dlm medium milet memerikn hsil tertinggi untuk T. sperellum T 13. Produksi spor tidk ered nyt ik pdmilet, medi ers putih, ers merh dn jgung (Tel 9). ph yng idel untuk T. sperellum T 13 dlh netrl. Hsil yng diperoleh didukung penurunn ph yng minim pd medi milet dn medi ini jug memiliki kndungn protein yng leih tinggi dindingkn dengnmedi yng lin(gmr 9). Gmr 9Produksi spor dn selisih ph T.sperellumT 13 (kiri) dn A.niger A 1 (knn) dlm medi pdt. Produksi spor T. sperellum T 13 dlm medi ir T 3-4 tidk ered nyt dengn T 1-2 (Gmr 10). Medi T 3-4 yng terdiri dri ekstrk khmir dn sukros mmpu menghsilkn spor senyk medi lengkp T 1-2. Medi T 9, dengn kentng dn gul psir msih termsuk dlm kelompok yng sm (Tel 10). T 9 dengn sukros segi sumer kron, dn kentng krohidrt leih rendh, lemk dn protein, nmun tinggi kn vitmin dn minerl (Mg, K, C, Fe). Hsil menunjukkn tidk dny peredn nyt produksi spor umum pd empt medi pdt uji (Tel 9). Produksi spor ternyk nmun tidk ered nyt dlh pd medi milet untuk T. sperellum T 13 ( 5,34 x spk/ml)dn ers merh untuk A. niger A 1 ( 3,03 x spk/ml).

12 52 Tel 9 Produksi spor dn penurunn ph du kpng uji pd medi pdt Kpng Jenis Medi ph 0 tn T. sperellum T 13 A. niger A 1 ph 6 Bers Putih 6,75 ± 0,04 4,58 ± 0,67 Bers Merh 6,68 ± 0,03 5,57 ± 0,43 Milet 6,72 ± 0,01 5,88 ± 0,10 Jgung 6,64 ± 0,02 5,92 ± 0,10 Bers Putih 6,73 ± 0,01 5,13 ± 0,61 Bers Merh 6,66 ± 0,06 5,12 ± 0,32 Milet 6,71 ± 0,01 5,35 ± 0,50 ΔpH 6 2,16 ± 0,68 1,11 ± 0,45 0,84 ± 0,10 0,72 ± 0,11 1,60 ± 0,61 1,54 ± 0,32 1,36 ± 0,51 Jumlh Spor tn 352,20 ± 251,76 362,07 ± 242,55 534,17 ± 157,04 475,00 ± 278,11 41,27 ± 20,04 302,57 ± 205,37 193,57 ± 62,86 Jgung 6,64 ± 0,03 5,20 ± 0,66 1,44 ± 0,66 229,57 ± 142,31 Keterngn: * * : ered sngt nyt (P<0.01), *tn : tidk erednyt (P>0.05)menurut uji lnjut LSD pd selng keperyn 95%. Angk yng diikuti oleh huruf yng sm tidk ered nyt pd uji lnjut LSD dengn selng keperyn 95%. Tel 10Produksi spor dn penurunn ph medi ir T. sperellum T 13 Jenis Medi ph 0 d ph 6 ΔpH 6 Jumlh Spor T 1-2 5,39 3,08 2,31 298,40±182,04 T 3-4 5,76 4,26 1,50 310,20±155,23 T 5-6 5,46 2,90 2,56 6,00±5,70 T 7-8 6,18 4,54 1,64 44,30±31,54 T 9 6,16 6,07 0,09 d 253,00±120,40 T 10 6,17 4,80 1,37 42,50±33,63 Keterngn: * * : ered sngt nyt (P<0.01)menurut uji lnjut LSD pd selng keperyn 95%. Angk yng diikuti oleh huruf yng sm tidk ered nyt pd uji lnjut LSD dengn selng keperyn 95%. Jumlh spor dlm 10 8 spk/ml. Tel 11 Produksi spor dn penurunn ph medi ir A. niger A 1 Jenis Medi ph 0 ph 6 ΔpH 6 Jumlh Spor A 1-2 5,70 4,18 1,52 62,35±50,42 A 3 6,13 4,32 1,81 19,57±10,83 A 4 5,91 4,55 1,36 22,27±33,25 A 5 4,79 d 3,05 1,74 159,43±96,18 A 6 4,46 d 3,00 1,46 98,33±77,82 A 7-8 5,87 4,43 1,44 64,43±57,23 A 9 6,17 6,50 0,33 48,10±34,04 A 10 6,32 4,48 1,84 25,07±16,04 Keterngn: * * : ered sngt nyt (P<0.01)menurut uji lnjut LSD pd selng keperyn 95%. Angk yng diikuti oleh huruf yng sm tidk ered nyt pd uji lnjut LSD dengn selng keperyn 95%. Jumlh spor dlm 10 8 spk/ml. Ser umum, penurunn ph keempt medi pdt yng diuji selm inkusi dn jumlh spor yng diproduksi jug tidk ered nyt. Penurunn ph pd medi ir ers putih A 10 seesr1,84 menghsilkn produksi spor

13 53 yng leih rendh dindingkn dengn tig medi linny, menunjukkn dny huungn ntr penurunn ph dn produksi spor (Tel11). Medi pernykn pdt terik untuk A. niger A 1 dlh ers merh. ph ers merh sesui dengn ph optimum kpng ini, yitu 5,0-5,5, dn mengndungfe 3+, Zn 2+, Mn 2+. Menurut Guilherme et l. (2008)minerl terseut dlm kultur A. niger dpt meningktkn pertumuhn dn produksi sm sitrt. Medi pernykn ir terik untuk A. niger A 1 dlh A 5 (Gmr 10) yng ered nyt dengn medi linny. Medi A 5 menggunkn luminium fosft segi sustrt, dn sukros menggntikn glukos, leih nyk kndungn grm NCl dn ion monium, pengurngn ekstrk khmir dn penggunn CCl 2, dindingkn dengn komposisi yng digunkn dlm medi A 1. Medi A 6 dengn stu peredn pd CCl 2 du kli leih nyk dindingkn dengn A 5 menghsilkn spor leih sedikit menunjukkn dny ion C erleih kemungkinn mengkelt fosft yng terlrut. Gmr 10 Produksi spor dn selisih pht. sperellum T 13 (kiri) dn A. niger A 1 (knn)dlm medi ir. Penggunn Al-P dlm medi menghsilkn pertumuhn spor tertinggi, yng terliht dlm produksi spor A 1-2, A 5 dn A 6.Kpng efektif dlm melrutkn P terikt luminium. Brosso dn Nhs (2008) melporkn hw pelrutn C-P meningkt oleh glukos dn Al-P oleh sukros. Amonium leih mmpu melrutkn P dindingn dengn ekstrk khmir. Hl ini disekn metolisme monium kn menyekn ph medium menglmi penurunn

14 54 menjdi leih sm dn leih mendukung pertumuhn A.niger. Penurunn ph medi yng ukup tinggi selm ms inkusi diperoleh dri medi A 5 yng menghsilkn spor tertinggi. Penurunn ph yng tinggi erpengruh positif terhdp pernykn spor A. niger A 1, selin ph wl yng rendh (Tel 10). Selin itu, fktor nutrisi dn suhu jug menentukn pertumuhn kpng. Ser umum terdpt peredn produksi spor ntr kedu kpng uji (Tel 12).Tmpk hw T. sperellum T 13 menghsilkn spor leih nyk (4,31x10 10 spk/ml)dindingkn dengn A. niger A 1 1,92x spk/ml. Hsil ini memperkut hsil peron wl. Hsil ini diperoleh dlm kondisi tidk dny peredn penurunn phntr medi uji(tel 13). Tel 12 Produksi spor dn penurunn ph pd du kpng uji Kpng ph 0 tn ph 6 ΔpH 6 tn Jumlh Spor T. sperellumt 13 6,70 5,49 1,21 430,86 A. nigera 1 6,68 5,20 1,48 191,74 Keterngn: * * : ered sngt nyt (P<0.01)menurut uji lnjut LSD pd selng keperyn 95%. Angk yng diikuti oleh huruf yng sm tidk ered nyt pd uji lnjut LSD dengn selng keperyn 95%. Jumlh spor dlm 10 8 spk/ml. ΔpH dlh selisih ph wl dn inkusi hri keenm. Tel 13 Produksi spor dn penurunn ph pd medi pdt yng diuji Jenis Medium ph 0 ph 6 ΔpH 6 Jumlh Spor tn Bers Putih 6,74 4,86 1,88 196,73 Bers Merh 6,67 5,34 1,33 332,32 Milet 6,71 5,62 1,10 363,87 Jgung 6,64 5,56 1,08 352,28 Keterngn: * * : ered sngt nyt (P<0.01)menurut uji lnjut LSD pd selng keperyn 95%. Angk yng diikuti oleh huruf yng sm tidk ered nyt pd uji lnjut LSD dengn selng keperyn 95%. Jumlh spor dlm 10 8 spk/ml. ΔpH dlh selisih ph wl dn inkusi hri keenm. Produksi Asm-sm Orgnik Selm Thp Pernykn Spor Produksi spor erkorelsi positif dengn produksi sm sitrt, nmun tidk erkorelsi dengn pementukn sm mlt dn sm α-ketoglutrt sert penurunn ph medi(tel 14). Penurunn ph medi selm ms inkusi erkorelsi sngt nyt dengn produksi sm sitrt, sm mlet dn okslt, keuli sm α-ketoglutrt.

15 55 Kultur dlm medi pdt dn ir A. niger A 1 memproduksi sm-sm orgnik pd hri ke 3. Ser umum, sm-sm orgnik totl diproduksi pling tinggi pd hri ke tig, dn tertinggi pd medi pdt A. niger A 1 dn medi T 3-4T. sperellum T 13 (Gmr 11).Kpngmenghsilkn sm-sm orgnik mellui jlur siklus sm sitrt. Bnykny sm α-ketoglutrt yng terkumulsi, menunjukkn lju iosintesis tidk terhenti pd jlur produksi sm sitrt nmun erlnjut ke produksi sm α-ketoglutrt untuk menghsilkn energi. Tel 14 Huungn korelsi Person ntr produksi spor, penurunn ph dn produksi sm-sm orgnik pd medi ir Spor ΔPH6 As. α-ketoglutrt Asm Sitrt Asm Mlet DPH6-0,053 tn Asm α-keto -0,152 tn -0,007 tn Asm Sitrt 0,484 0,445 0,353 * Asm Mlet -0,087 tn 0,343 * 0,016 tn 0,201 tn Asm Okslt -0,024 tn 0,358 * 0,525 0,358 tn 0,296 tn Keterngn: tn:tidk erkorelsi ser nyt(p>0.05). * erkorelsi nyt(p<0.05), sngt nyt (P<0.01) menurut uji korelsi Person. ΔPH6:selisih ph wl dn inkusi hri ke Asm Orgnik Totl Asm Sitrt , , , , , , ,00 727,16 207,77 534,54 461,48 810,18 50,25 405,00 399,71 164,01 222,89 104,83 128,49 160,09 T 1-2 T 3-4 T 5-6 T 7-8 T 9 T 10 B M B P Jg Mil T 1-2 T 3-4 T 5-6 T 7-8 T 9 T 10 Konsentrsi (ppm) B M B P Jg Mil Hri 3 Hri 6 Jenis Medi Asm Orgnik Totl Asm Sitrt Konsentrsi (ppm) , ,00 0 A ,72 180,87 77, ,42 931,54 136, , , , ,72 315, , , ,08 803, ,78 538,85 539, ,96 336,28 34,73 97,28 A 3 A 4 A 5 A 6 A 7-8 A 9 A 10 B M B P Jg Mil A 1-2 A 3 A 4 A 5 A 6 A 7-8 A 9 A 10 B M B P Jg Mil Hri 3 Hri 6 Jenis Medi

16 56 Gmr 11Profil produksi sm sitrt dn sm orgnik totl T. Asperellum T 13 (ts) dn A. niger A 1 (wh) pd ergi medi pernykn. Keterngn: Jg (jgung), BM (ers merh), BP (ers putih) dn Mil (milet). Produksi sm sitrt dlm medi ir enderung dihsilkn pd inkusi hri ke 6, ik pd T. sperellumt 13 mupun oleh A. niger A 1 (Tel 15), nmun medi pdt leih menghsilkn sm sitrt pd hri ke 6.Ser umum, A. niger A 1 menghsilkn sm sitrt leih nyk dlm medi pdt.produksi sm sitrt dn sm-sm orgnik linny dipengruhi oleh eerp fktor, dintrny jenis glur, lm fermentsi, nutrisi dlm medi, ersi, kdr ir dlm fermentsi pdt dn ph. Asm sitrt merupkn metolit primer, tidk dihsilkn dlm jumlh sngt nyk pd kondisi norml. Upy memperoleh produksi sm sitrt tinggi untuk skl industri dilkukn slh stuny dengn perolehn mutn Aspergillus sp.(andersen et l. 2011). Tel 15 Produksi sm sitrt dn sm orgnik totl selm inkusi T. sperellum T 13 A. niger A 1 Hri ke 3 Hri ke 6 Hri ke 3 Hri ke 6 Medi Sitrt A.org. Sitrt A.org. Sitrt A.org. Sitrt A.org. totl totl Medi totl Totl T 1-2 7, , , ,31 A 1-2 0, ,00 26,34 315,75 T , , ,68 319,65 A 3 0, ,89 872, ,04 T , ,84 763, ,77 A 4 0,00 558,72 190,73 538,85 T 7-8 4,65 207,77 293,39 405,03 A 5 2,45 180,87 0,31 34,73 T 9 1,06 874,99 49,00 104,83 A 6 1,75 77,65 152,97 336,28 T 10 0,70 50,25 126,88 164,01 A 7-8 7, ,42 103,74 539,90 Jgng 3,88 727,16 2,50 222,89 A 9 1,44 931,54 9,82 803,12 Bmer 3,36 534,54 1, A 10 0,73 136,69 0,00 97,28 Bput 0,00 461,48 0,00 399,71 Jgng 5, ,72 1, ,58 Milet 6,92 810,18 5,41 160,09 Bmer 12, ,64 2, ,14 Bput 4, ,45 1, ,08 Milet 7, ,34 1, ,59 Keterngn: konsentrsi sm sitrt dn sm orgnik dlm stun ppm. Brosso et l. (2006) menytkn hw slh stu meknisme yng menjelskn ktivits pelrutn fosft disekn oleh sekresi proton segi kit dri penggunn monium. Nmun, sm sitrt dn glukont tetp kn dihsilkn oleh A. niger meskipun tnp monium nitrt. Penmhn grm ini memiu produksi sm sitrt dn menurunkn ser drstis sm glukont. Hl ini menunjukkn hw pelrutn C-P dn Al-P erhuungn dengn produksi sm dn penurunn ph. Selnjutny, sm-sm orgnik jug sngt penting

17 57 segi fktor pengkelt ktion yng terikt dengn P pd fosft sukr lrut. Pelrutn C-P dijumpi mksimum dlm medi glisin, yng ditunjukkn dengn pertumuhn sngt tinggi. Oleh se itu pelrutn fosft jug erkorelsi dengn pertumuhn A.niger. Meknisme pelrutn fosft dri hn yng sukr lrut oleh ktivits mikro seperti Al-P nyk dikitkn dengn kemmpun mikro dlm menghsilkn enzim fosftse dn sm-sm orgnik hsil metolisme seperti sm sitrt,okslt, suksint dn α-ketoglutrt. Hsil penelitin Ppginni (2007) menunjukkn ergi reksi dn enzim metolik erpern dlm produksi sm sitrt oleh A. niger dlm siklus sm sitrt (Kres). Produksi Fitohormon Selm Thp Pernykn Spor Tig jenis fitohormon ABA, GA dn IAA yng diukur pd hri ke 6 inokulsi menunjukkn produksi sm sist tu ABA tertinggi diperoleh pd medi ir T 5-6 dn A 4. GA tertinggi diproduksi pd medi pdt dn IAA diproduksi oleh T. sperellum T 13 dlm medi T 3-4, jgung dn milet. A. niger A 1 memproduksi ABA, GA dn IAA dlm medi A 3 dn A 9 (Tel 16). Menurut Gemishev et l. (2005) produksi ABA olehkpng didukung oleh keerdn glukos dn kondisi ekmn kekeringn tupun slinits. GA tidk dijumpi hmpir pd seluruh medi pd pengukurn 6 hri. Menurut Bilky et l. (2010) IAA dihsilkn optimum pd hri keenm, sedngkn GA optimum diproduksi pd hri ke 12, yng mungkin menjelskn hsil penelitin ini. Pd eerp medi pdt, GA dihsilkn dlm jumlh esr, seperti milet untuk T. sperellum T 13 dn jgung untuk A. niger A 1. Produksi GA dipengruhi oleh suhu optimum yng leih tinggi dindingkn IAA (30 o C untuk GA dn o C untuk IAA). Peron dilkukn dengninkutor 28 o C untuk medi ir dn dlm li plstik untuk medi pdt yng leih mendukung produksi IAA. Produksi GA pd medi pdt erlngsung leih ept, kemungkinn disekn oleh peningktn suhu selm inkusi. Penemptn medi pdt dlm kntong plstik diseled dn ertumpukn dlm li plstik memungkinkn peningktn suhu.

18 58 Menurut Bilky et l. (2010) produksi spor erkorelsi positif dengn produksi GA, dijumpi pd milet, medi penghsil spor ternyk T. sperellum T 13 dn ers merh untuk A. niger A1. Semu medi menghsilkn ABA dlm jumlh ervrisi hingg 764,65 ppm. Produksi tertinggi dijumpi pd medi ir T 3-4 dn T 7-8 untuk T. sperellum T 13 dn A 4 untuk A. niger A 1, yng erkorelsi dengn ekmn yng dilmi kpng. Medi T 3-4 dn T 7-8 memerikn ekmn kren miskinny elemen minerl, dn kurngny kndungn gul. Pd medi A 4 terutm disekn oleh kurngny gul. Hl ini diperkut oleh pernytn Bilky et l.(2010), yng menytkn ABA diproduksi kit ekmn gul dn grm. Nmr dn Mrion-Poll (2005) menytkn hw kpng mensintesis ABA mellui jlur mevlont MVA ered dengn jlur Emden-Meyerhof- Prns EMP yng erlngsung pd tumuhn. Tel 16 Produksi ABA, GA dn IAA dlm kultur pernykn ir dn pdt T. sperellum T 13 dn A. niger A 1 Keterngn: konsentrsi sm sitrt dn sm orgnik dlm stun ppm. Penetpn Teknik Pemektn Spor dengn Sentrifugsi Keeptn Sentrifugsi Optimum Hsil sentrifugsi untuk pemektn spor dengn eerp keeptn sentrifugsi menunjukkn hw minimum spor yng tertinggl dlm superntn T sperellum T 13 dlh pd g, sedng untuk A. niger A 1 dlh g (Gmr 14). Hl ini menunjukkn hw spor A. niger leih mudh dipektkn dripd sport sperellum T 13. Spor T sperellum T 13 memiliki dimeter spor 10 µm, yng leih esr dindingkn dengn spor A. niger yng erdimeter sekitr 1 µm (Gmr 12), nmun ersift lengket dn

19 59 menempel pd mtriks medi. Hl ini menyekn sport sperellum T 13 leih sukr untukdipektkn dindingkn dengn spor A.niger. Peningktn keeptn sentrifugsi menyekn peningktn kndungn spor dlm frksi superntn, yng errti menurunny retensi spor dlm pelet. Fenomen ketidkstiln leih nyt pd spor T. sperellum yng menpi titik terendh spor superntn, dn menglmi peningktn dengn ertmhny keeptn sentrifugsi smpi g. Pd A.niger, muli dri keeptn g hingg g menunjukkn kestiln, dn menglmi ketidkstiln pd keeptn sentrifugsi di ts g (Gmr 13). Zhou et l. (2006) memektkn spor B. thuringiensis dn mengmti efek kndungn pdtn spor, keeptn sentrifugsi dn lmny sentrifugsi terhdp retensi spor pd frksi pelet. Hsil yng diperoleh menunjukkn hw ketig peuh yng diukur erpengruh nyt terhdp nykny spor yng terthn pd frksi pelet spor Bt. Peningktn keeptn sentrifugsi dn wktu menurunkn retensi spor Bt, nmun persentsi retensi kn meningkt pil oot spor dinikkn. () () Gmr 12Bentuk dn ukurn spora. niger A 1 () dn T. sperellum T 13 (). Keterngn: spor A. niger A 1 enderung erdimeter keil (1 µm), erwrn okelt kehitmn dn erentuk ult. Spor T. sperellum T 13 erdimeter leih esr (10 µm), kehijun dn erentuk ult tu lonjong. Chrvt (2007) melkukn pemektn spor mikoriz ruskul vesikul menggunkn teknik sentrifugsi dengn lt sentrifus Sorvll RC-2B pd keeptn rpm, selm 5 menit. Bginyng dimil dlh pelet yng merupkn hsil pemektn spor. Bssel dn Miller (1982)melporkn pemektn spor pkis dengn teknik sentrifugsi dn memuktikn kestiln polrits spor yng disentrifugsi pd keeptn g selm 30 menit.

20 60 d Enfert dn Mol (2005) menggunkn teknik sentrifugsi dengn keeptn g selm 5 menit pd 4 o C untuk pemektn spor A.fumigtus untuk tujun trnsformsi dengn teknik elektroporsi menunjukkn efisiensi yng tinggi. Perdue et l. (2003) melkukn preprsi spor B. nthris untuk mendeteksi kontminsi penykit ntrks pd susu dn meliht kemungkinn pengruh proses sterilissi terhdp kteri terseut, dn pemektn spor dilkukn dengn sentrifugsi spor pd g selm 10 menit. Konsentrsi spor dlm superntn (x10 6 ) T.sperellum T13 A.niger A Keeptn Sentrifugsi (g) Gmr 13 Profil konsentrsi spor dlm superntn ps sentrifugsi. Viilits Spor Ps Pemektn Viilits spor ps peron diuji mellui (i) pengmtn spor ps pengmtn di wh mikroskop, yng menunjukkn tidk terlihtny gejl lisis kit ekmn teknn osmotik mupun keruskn, erup peruhn entuk, ukurn dn pehny spor kit teknn meknis sentrifugsi (Gmr 14) dn (ii) penghitungn jumlh koloni pd medi PDB gr hsil tung wn spor A. niger A 1 ps pemektn ( 3,18 x10 8 spk/ml) menunjukkn jumlh koloni yng tidk nyk ered dengn konsentrsi spor wl (7,8x10 8 spk/ml). Angk penghitungn pd hsil tung wn tidk sekurt penghitungn spor menggunkn hemsitometer kren dihitung erdsrkn pertumuhn koloni. Dpt disimpulkn hw viilits spor tidk eruh kit pemektn dengn teknik sentrifugsi pd keeptn uji.

21 61 Gmr 14Spor T. sperellum T 13 dn A. niger A 1 seelum dn sesudh pemektndengn r sentrifugsi.keterngn: setelh pemektn (2 dn 4), entuk dn ukurn spor tidk menunjukkn peruhn, menunjukkn hw spor tidk menglmi lisis oleh sentrifugsi pd keeptn uji. SIMPULAN Medi pdt milet dn medi ir T 3-4 dlh medi terik untuk pernykn spor T. sperellum T 13, sedngkn untuka. niger A 1 dlh medi pdt ers merhdn medi ir A 5. Produksi spor erkorelsipositif sngt nyt dengn penurunn ph dn produksi sm sitrt. Produksi sm-sm orgnik totl medi ir dn pdt terjdi pd hri ke tig. Asm-sm orgnik totl yng diproduksi meliputi sm sitrt, mlt, okslt dn sm α-ketoglutrt.produksi sm sitrt, pd medi ir optimum pd hri ke 6 sedngkn medi pdt pd hri ketig. Produksi ABA, IAA dn GA ergm, dn hsil yng kurng optimum disekn oleh tig fktor, wktu yng elum sesui dengn mksimum produksi, terutm GA (12 hri) dn IAA (setelh 6 hri), fktor ersi dn suhu optimum. Semu medi menghsilkn ABA. Pemektn sport. sperellum T 13 terik dlh dengn sentrifugsi pd 4 o C, selm 5 menit erkeeptn g, sedngkn untuk pemektn spor A. niger A 1 terik dlh sentrifigsi erkeeptn g.