GCTTACGACTCAAGACAGTACTGAAGAATTCGCTGCTTTTCTACGAGGCTCAGCGATCGGGACAATTGCCC

Transkripsi

1 HASIL Amplifikasi DNA Gen Endoglukanase C. curvignathus Pita DNA gen endoglukanase C. curvignathus hasil amplifikasi menggunakan pasangan primer CfF2 dan CfR3 menghasilkan dua pita yaitu pita tebal berukuran sekitar 900 pasang basa (pb) (Gambar 7a) dan pita tipis yang berukuran sekitar 2000 pb. Berdasarkan panjang ekson CfEG (AB058670) yang berukuran 281 pb dan ketebalan pita DNA, target yang benar adalah pita yang berukuran 900 pb yang selanjutnya dilakukan sekuen DNA. Pasangan primer CfF3 dan CfR4 menghasilkan pita DNA sekitar 1100 pb dan pasangan primer CfF4 dan CfR5 sekitar 500 pb (Gambar 7b). pb M 1 2 pb M pb pb (a) Gambar 7 Pita DNA hasil amplifikasi gen endoglukanase C. curvignathus pada gel poliakrilamid dengan menggunakan (a) pasangan primer CfF2 dan CfR3; (b) pasangan primer CfF3 dan CfR4 (no 3-4) dan pasangan primer CfF4 dan CfR5 (no 5-6). M = penanda 100 pb DNA ladder (Promega). Sekuen dan Alignment DNA dan Asam Amino Gen Endoglukanase C. curvignathus Hasil sekuen DNA gen endoglukanase C. curvignathus dengan menggunakan pasangan primer CfF2 dan CfR3, CfF3 dan CfR4, CfF4 dan CfR5 masing-masing sebesar 856, 1077, dan 484 pb (Gambar 8, Lampiran 1-6). 500 pb a. Hasil sekuen DNA gen endoglukanase C. curvignathus dengan menggunakan pasangan primer CfF2 dan CfR3 CfF2 CfF GCTTACGACTCAAGACAGTACTGAAGAATTCGCTGCTTTTCTACGAGGCTCAGCGATCGGGACAATTGCCC GCTGATCAGAAGGTCACGTGGAGGAAGGATTCCGCCCTTAACGACAAGGGAAACAACGGCGAGGATCTGAC AGGGGGATATTATGACGGTAAGACTACATACACAAATTTCAAATTCAAAGATTCAAAAATCTGCGTGCACA CCATTCTCATAATATCATTCATACGTTAGTGTGGTGAGCCTATAGCATCTGTAAACTTTTGCAGCTGGTGA TTTTGTGAAATTCGGCTTTCCAATGGCGTACACGGCCACCGTCCTGGCTTGGGGCCTGGTGGACTATGAAG CGGGCTACTCCTCAGCAGGTACGTACATCACAGTGACGGTGCAGGTGTAGGGACAGAATATGTGATTTAGA ACACAAGGTGTCGCTTCAGGTTATGAGCGACCTGCTGATTTGTGAAGTTATGCTAATTCTGTGAACGATTT GATATAAGAATCTGTGTAATACAAGCCTCCATTAGAGACCCGAAATGCAATGTGCATCATTAACTGAAATA TAATCAAGGACACACGTGTTTAAGATTCTACAAATGCAGTTGCGAAAACTCATTGTTTAAACACTTCGGTT GCTCAGTAGTGGAGATTTCTAATTTAATACTCTATGAGAAGTTATTCAATGACAAGAAATGAAATACACTC ATTAGTACGAAATGCTTCTTCGTCTCATCTCGTAGAGTAACCTAATATCATACTCATTATCCAATCGCGAA TTCAGTGTCCATGACCAAATCCAGATAACATGTTCAATACCCAACCAATGCTTGCAGCGCTCTGGGATGAT GGTC CfR3 (b) CfR2

2 19 b. Hasil sekuen DNA gen endoglukanase C. curvignathus dengan menggunakan pasangan primer CfF3 dan CfR4 CfF3 GTACACCGTCACCGTCCTGGCTTGGGGCCTTGTAGACACGATTCGGCGTATTCTACAGCAGGTACGTACAT TACGGCGATGTTGAATCTGTAGTCCTGCAACTCGGGAATTTATTTACATCACCGCAATAAGGTAAGCACAC AGCCTACATACAGCGTGCTTGCCATAGGAACAATTACTTCGCTTAGAGTAGAGGCGACTCATCACGAAGGA TAGAACTCTTAACACCAAAGGCAGCACCAATAATGCTCCAACAAATCAAGCAAAAGATTCCATCACACGGC TACGTTGGCCGAACAAAAATCTTACCTCTTGAGGGACTAACAACGATACTTCTGAATTCGTGGTGCTGAGG TAAATGGCATCATGTTACATTTAGTTTAAAATTTATCCCTTACTTTAACATTTGTCACCTACGTCACAATC GAGACTACATATAGGCTTACACAACTGTTCGTGTCCGATTTACGGTCATACCGAAGACACATAACTGATAA TATGTCTCAGACACACACACAGATACGTAAGCACATGGAAACACACTGTACACAGTCGGTCCCTTCATGAT TATCAGCAAATACGGACCGAGAACATTATTATTTCATAATTTTATGCTAATTCTGTGTGAAAGGATGAGAT ACAGGAAGCAGTAAAATGCAGATCGCTCTTACAGACCTGAAATACAATGTATATAATTCGTCAGAGAAAAA TCTGTGGCTCACGTCATGAGGGTGCTACACAGCAAAGTTAATAGAACTCCTCCACTACACTTCCGCTTACC AGTATTCGGAACTTCCTGACATCTTCGCCCGTAAACAGCTATGCAAATACAATCACTGAAACACTCTCAGT CfR3 TTCCTTCAACACAAACGGCTTACACATCCAACATCCAACCAATGCTTGCAGGCGCTCTGGATGATGGTCGG CfF4 AAGGCTCTTAAATGGGGCACGGACTACTTCCTCAAGGCCCACACGGCCGCCTCAGAATTCTACGGACAAGT GGGTCAGGGAGATGTGGACCACGCCTACTGGGGACGTCCAGAAGACATGACGATGTCCAGACCTGCCTACA AGATCGACACGC CfR4 c. Hasil sekuen DNA gen endoglukanase C. curvignathus dengan menggunakan pasangan primer CfF4 dan CfR5 CfF4 GATGGTCGCAAGGCTCTTAAATGGGGCACGGACTACTTCCTCAAGGCCCACACGGCCGCCTCAGAATTCTAC GGACAAGTGGGTCAGGGAGATGTGGACCACGCCTACTGGGGACGTCCAGAAGACATGACGATGTCCAGACCT GCCTACAAGATCGACACGTCCAAACCAGGTAAGCTTGCATCACGTTCATTCTTTCCGGCACGCAGGAGTGTC CfR4 AACACCCTCACTGCAACATGTCCTCGTCATCCTCAAATCTGAGACCTCCATTTTGAAGTCAGTTACGACATC CfF5 ATGCAATTCCAAACATCTCATCTTCAACTTTCTTGGTCACAGAGACAAAAATTTCTCTCTGCTGTTTCAAGG GTCGGACCTTGCCGCCGAGACAGCCGCCGCCCTCGCTGCAACTGCCATCGTCTACAAGAGTGTTGACTCCAC TTATTCCAACAACTTGATCACCCACGCCAAGCAGCTTTTCGACTTCGCCAAC CfR5 Gambar 8 Hasil sekuen gen endoglukanase C. curvignathus dengan menggunakan pasangan primer (a) CfF2 dan CfR3, (b) CfF3 dan CfR4, dan (c) CfF4 dan CfR5. Basa yang digaris bawahi menunjukkan posisi primer. Hasil sekuen tersebut kemudian dilakukan alignment untuk mengetahui posisi dan panjang ekson dan intron serta untuk menganalisis homologi sekuen DNA gen endoglukanase C. curvignathus. Berdasarkan hasil alignment didapatkan panjang ekson 2, intron 2, ekson 3, intron 3, ekson 4, intron 4, dan ekson 5 masing-masing sebesar 160, 118, 96, 842, 183, 187, dan 125 pb (Gambar 9). Alignment dengan NtEG menunjukkan posisi ekson dua sampai lima gen endoglukanase C. curvignathus berada pada ekson tiga sampai enam NtEG dan ekson dua sampai lima CfEG. Sedangkan intron dua sampai empat gen

3 20 endoglukanase C. curvignathus berada pada intron tiga sampai lima pada NtEG (Gambar 10). Panjang ekson tiga dan empat gen endoglukanase C. curvignathus sama dengan ekson empat dan lima NtEG serta ekson tiga dan empat CfEG. Sedangkan panjang ekson dua dan lima gen endoglukanase C. curvignathus berbeda dengan panjang ekson tiga dan enam NtEG dan ekson dua dan lima CfEG. Perbedaan panjang juga terdapat pada masing-masing intron gen endoglukanase C. curvignathus dengan intron NtEG (Gambar 10). GCTTACGACT ACAAGACAGT ACTGAAGAAT TCGCTGCTTT TCTACGAGGC 50 TCAGCGATCG GGACAATTGC CCGCTGATCA GAAGGTCACG TGGAGGAAGG 100 ATTCCGCCCT TAACGACAAG GGAAACAACG GCGAGGATCT GACAGGGGGA 150 TATTATGACG gtaagactac atacacaaat ttcaaattca aagattcaaa 200 aatctgcgtg cacaccattc tcataatatc attcatacgt tagtgtggtg 250 agcctatagc atctgtaaac ttttgcagct GGTGATTTTG TGAAATTCGG 300 CTTTCCAATG GCGTACACGG CCACCGTCCT GGCTTGGGGC CTGGTGGACT 350 ATGAAGCGGG CTACTCCTCA GCAGgtacgt acattacggc gatgttgaat 400 ctgtagtcct gcaactcggg aatttattta catcaccgca ataaggtaag 450 cacacagcct acatacagcg tgcttgccat aggaacaatt acttcgctta 500 gagtagaggc gactcatcac gaaggataga actcttaaca ccaaaggcag 550 caccaataat gctccaacaa atcaagcaaa agattccatc acacggctac 600 gttggccgaa caaaaatctt acctcttgag ggactaacaa cgatacttct 650 gaattcgtgg tgctgaggta aatggcatca tgttacattt agtttaaaat 700 ttatccctta ctttaacatt tgtcacctac gtcacaatcg agactacata 750 taggcttaca caactgttcg tgtccgattt acggtcatac cgaagacaca 800 taactgataa tatgtctcag acacacacac agatacgtaa gcacatggaa 850 acacactgta cacagtcggt cccttcatga ttatcagcaa atacggaccg 900 agaacattat tatttcataa ttttatgcta attctgtgtg aaaggatgag 950 atacaggaag cagtaaaatg cagatcgctc ttacagacct gaaatacaat 1000 gtatataatt cgtcagagaa aaatctgtgg ctcacgtcat gagggtgcta 1050 cacagcaaag ttaatagaac tcctccacta cacttccgct taccagtatt 1100 cggaacttcc tgacatcttc gcccgtaaac agctatgcaa atacaatcac 1150 tgaaacactc tcagtttcct tcaacacaaa cggcttacac atccaacatc 1200 caaccaatgc ttgcaggcgc TCTGGATGAT GGTCGGAAGG CTCTTAAATG 1250 GGGCACGGAC TACTTCCTCA AGGCCCACAC GGCCGCCTCA GAATTCTACG 1300 GACAAGTGGG TCAGGGAGAT GTGGACCACG CCTACTGGGG ACGTCCAGAA 1350 GACATGACGA TGTCCAGACC TGCCTACAAG ATCGACACGT CCAAACCAGg 1400 taagcttgca tcacgttcat tctttccggc acgcaggagt gtcaacaccc 1450 tcactgcaac atgtcctcgt catcctcaaa tctgagacct ccattttgaa 1500 gtcagttacg acatcatgca attccaaaca tctcatcttc aactttcttg 1550 gtcacagaga caaaaatttc tctctgctgt ttcaagggtc GGACCTTGCC 1600 GCCGAGACAG CCGCCGCCCT CGCTGCAACT GCCATCGTCT ACAAGAGTGT 1650 TGACTCCACT TATTCCAACA ACTTGATCAC CCACGCCAAG CAGCTTTTCG 1700 ACTTCGCCAA C 1711 Ekson 2 Intron 2 Ekson 3 Intron 3 Ekson 4 Intron 4 Ekson 5 Gambar 9 Sekuen DNA gen endoglukanase C. curvignathus. Huruf besar menunjukkan urutan basa ekson dan huruf kecil menunjukkan urutan basa intron. Basa yang digaris bawahi menunjukkan awal dan akhir intron.

4 Nasutitermes takasagoensis (NtEG) Coptotermes formosanus (CfEG) Coptotermes curvignathus (penelitian ini) Gambar 10 Skema posisi ekson dan intron NtEG (AB019146), CfEG (AB058670), dan gen endoglukanase C. curvignathus (hasil penelitian ini). Kotak menunjukkan ekson dan segitiga menunjukkan intron. Angka di bawah kotak menunjukkan posisi ekson dan angka di atas segitiga menunjukkan posisi intron. Angka di dalam kotak dan segitiga menunjukkan panjang basa.

5 22 Intron dua sampai empat gen endoglukanase C. curvignathus didominasi oleh basa AT yaitu masing-masing sebesar 66.06, 58.81, dan 55.96%. Intron dua sampai empat gen endoglukanase C. curvignathus diawali dengan basa GT dan diakhiri dengan basa AG (Gambar 9). Kesamaan intron dua sampai empat gen endoglukanase C. curvignathus dengan intron tiga sampai lima NtEG masingmasing sebesar 8.8, 24.8, dan 46.5%. Panjang ekson dua sampai lima gen endoglukanase C. curvignathus yaitu sebesar 564 pb. Hasil analisis BLASTN ekson dua sampai lima gen endoglukanase C. curvignathus homolog dengan CfEG dengan nomor akses EU (95%) dengan E-value 0.0 (Gambar 11, Lampiran 7). Kandungan GC ekson dua sampai lima gen endoglukanase C. curvignathus adalah 55.82%. C. curvignathus 1 GCTTACGACTACAAGACAGTACTGAAGAATTCGCTGCTTTTCTACGAGGCTCAGCGATCG 60 CfEG EU GCTTACGACTACAAGACAGTACTGAAGAATTCGCTGCTTTTCTACGAGGCTCAGCGATCG 141 C. curvignathus 61 GGACAATTGCCCGCTGATCAGAAGGTCACGTGGAGGAAGGATTCCGCCCTTAACGACAAG 120 CfEG EU GGAAAATTGCCCGCTGATCAGAAGGTCACGTGGAGGAAGGATTCCGCCCTTAACGACAAG 201 C. curvignathus 121 GGAAACAACGGCGAGGATCTGACAGGGGGATATTATGACGCTGGTGATTTTGTGAAATTC 180 CfEG EU GGCCAGAAGGGCGAGGACCTGACAGGGGGATACTATGACGCTGGTGATTTTGTGAAGTTC 261 C. curvignathus 181 GGCTTTCCAATGGCGTACACGGCCACCGTCCTGGCTTGGGGCCTGGTGGACTATGAAGCG 240 CfEG EU GGCTTCCCTATGGCGTACACCGTCACCGTCCTGGCTTGGGGCCTTGTAGACTACGAATC- 320 C. curvignathus 241 GGC-TACTCCT-CAGCAGGCGCTCTGGATGATGGTCGGAAGGCTCTTAAATGGGGCACGG 298 CfEG EU GGCGTA-TTCTACAGCAGGCGCTCTGGATGATGGTCGCAAGGCTCTTAAATGGGGCACGG 379 C. curvignathus 299 ACTACTTCCTCAAGGCCCACACGGCCGCCTCA-GAATTCTACGGACAAGTGGGTCAGGGA 357 CfEG EU ACTACTTCCTCAAGGCCCACACGGCCGCC-AATGAATTCTACGGACAAGTGGGTCAGGGA 438 C. curvignathus 358 GATGTGGACCACGCCTACTGGGGACGTCCAGAAGACATGACGATGTCCAGACCTGCCTAC 417 CfEG EU GATGTGGACCACGCCTACTGGGGACGTCCAGAAGACATGACGATGTCCAGACCTGCCTAC 498 C. curvignathus 418 AAGATCGACACGTCCAAACCAGGGTCGGACCTTGCCGCCGAGACAGCCGCCGCCCTCGCT 477 CfEG EU AAGATCGACACGTCCAAACCAGGGTCGGACCTTGCCGCCGAGACAGCCGCCGCCCTCGCT 558 C. curvignathus 478 GCAACTGCCATCGTCTACAAGAGTGTTGACTCCACTTATTCCAACAACTTGATCACCCAC 537 CfEG EU GCAACTGCCATCGCCTACAAGAGTGCTGACTCCACTTATTCCAACAACTTGATCACCCAC 618 C. curvignathus 538 GCCAAGCAGCTTTTCGACTTCGCCAAC 564 CfEG EU GCCAAGCAGCTTTTCGACTTCGCCAAC 645 Gambar 11 Hasil analisis BLASTN gen endoglukanase C. curvignathus dengan CfEG (EU853671).

6 23 Sekuen ekson dua sampai lima gen endoglukanase C. curvignathus kemudian ditranslasi menggunakan program Genetyx Win versi 4.0. Asam amino putative yang didapatkan sebesar 188 asam amino (Gambar 12). Hasil analisis homologi asam amino putative gen endoglukanase C. curvignathus menggunakan BLASTP homolog (94%) dengan CfEG (BAB40696) dengan E-value sebesar 9e- 92 (Gambar 13, Lampiran 8). Perbedaan asam amino antara asam amino putative gen endoglukanase C. curvignathus dengan CfEG (BAB40696) sebanyak sembilan asam amino (Gambar 13) GCTTACGACTACAAGACAGTACTGAAGAATTCGCTGCTTTTCTACGAGGCTCAGCGATCGGGACAATTGC A Y D Y K T V L K N S L L F Y E A Q R S G Q L CCGCTGATCAGAAGGTCACGTGGAGGAAGGATTCCGCCCTTAACGACAAGGGAAACAACGGCGAGGATCT P A D Q K V T W R K D S A L N D K G N N G E D L GACAGGGGGATATTATGACGCTGGTGATTTTGTGAAATTCGGCTTTCCAATGGCGTACACGGCCACCGTC T G G Y Y D A G D F V K F G F P M A Y T A T V CTGGCTTGGGGCCTGGTGGACTATGAAGCGGGCTACTCCTCAGCAGGCGCTCTGGATGATGGTCGGAAGG L A W G L V D Y E A G Y S S A G A L D D G R K CTCTTAAATGGGGCACGGACTACTTCCTCAAGGCCCACACGGCCGCCTCAGAATTCTACGGACAAGTGGG A L K W G T D Y F L K A H T A A S E F Y G Q V G TCAGGGAGATGTGGACCACGCCTACTGGGGACGTCCAGAAGACATGACGATGTCCAGACCTGCCTACAAG Q G D V D H A Y W G R P E D M T M S R P A Y K ATCGACACGTCCAAACCAGGGTCGGACCTTGCCGCCGAGACAGCCGCCGCCCTCGCTGCAACTGCCATCG I D T S K P G S D L A A E T A A A L A A T A I TCTACAAGAGTGTTGACTCCACTTATTCCAACAACTTGATCACCCACGCCAAGCAGCTTTTCGACTTCGC V Y K S V D S T Y S N N L I T H A K Q L F D F A CAAC N 570 Gambar 12 Asam amino putative gen endoglukanase C. curvignathus.

7 24 Gambar 13 Hasil analisis BLASTP asam amino putative gen endoglukanase C. curvignathus dengan gen CfEG (BAB40696). Kotak menunjukkan perbedaan asam amino. Analisis Filogeni dan Jarak Genetik Gen Endoglukanase C. curvignathus Hasil analisis filogeni dengan menggunakan asam amino menunjukkan gen endoglukanase C. curvignathus mengelompok dengan GHF 9 pada kelompok rayap dan terpisah dengan GHF 9 pada kelompok moluska, echinodermata, cacing tanah, dan bakteri. Gen endoglukanase C. curvignathus juga terpisah dengan GHF 7 pada kelompok fungi dan protozoa (Gambar 14). Berdasarkan perhitungan jarak genetik gen endoglukanase C. curvignathus lebih dekat dengan gen endoglukanase C. formosanus EG3, C. formosanus, dan C. formosanus EG4. Hal ini dilihat dari nilai jarak genetik yang paling kecil yaitu Hubungan gen endoglukanase C. curvignathus yang terjauh adalah dengan gen endoglukanase N. takasagoensis dengan jarak genetik terbesar yaitu (Tabel 3).

8 25 GHF 9 GHF 7 Gambar 14 Pohon filogeni gen endoglukanase C. curvignathus berdasarkan asam amino putative menggunakan metode Maximum Parsimony (bootstrap 1000 kali). Tabel 3 Jarak genetik gen endoglukanase C. curvignathus dengan gen endoglukanase C. acinaciformis, C. formosanus, N. takasagoensis, R. flavipes, dan R. speratus Keterangan: (1) C. formosanus EG1a, (2) C. formosanus EG1b, (3) C. formosanus EG2, (4) C. formosanus EG3, (5) C. formosanus, (6) C. formosanus EG4, (7) R. flavipes, (8) R. speratus, (9) C. curvignathus, (10) C. acinaciformis, (11) N. takasagoensis. Kotak menunjukkan jarak genetik terbesar dan terkecil.

9 26 Analisis Protein Putative Gen Endoglukanase C. curvignathus Berdasarkan Prosite, Nakashima et al. (2002b), dan Zhou et al. (2007) protein putative gen endoglukanase C. curvignathus menunjukkan adanya beberapa motif yaitu satu consensus signature GHF 9, nucleophile, conucleophile, salt bridge, dan N-terminal (Gambar 15). Pencarian dengan Pfam menunjukkan endoglukanase C. curvignathus masuk ke dalam GHF 9 yang termasuk ke dalam CL0059 yaitu six-hairpin glycosidase superfamily. CfEG1 (BAB40693) MRVFFCLLSALALCQAAYDYKTVLKNSLLFYEAQRSGKLPADKKVTWRKDSALNDKGQKG 60 CfEG3 (BAB40696) MRVFFCLLSALALCQAAYDYKTVLKNSLLFYEAQRSGKLPADQKVTWRKDSALNDKGQKG 60 C. curvignathus AYDYKTVLKNSLLFYEAQRSGQLPADQKVTWRKDSALNDKGNNG 44 o * CfEG1 (BAB40693) EDLTGGYYDAGDFVKFGFPMAYTVTVLAWGLVDYESAYSTAGALDDGRKALKWGTDYFLK 120 CfEG3 (BAB40696) EDLTGGYYDAGDFVKFGFPMAYTVTVLAWGLVDYESAYSTAGALDDGRKALKWGTDYFLK 120 C. curvignathus EDLTGGYYDAGDFVKFGFPMAYTATVLAWGLVDYEAGYSSAGALDDGRKALKWGTDYFLK 104 CfEG1 (BAB40693) AHTAANEFYGQVGQGDVDHAYWGRPEDMTMSRPAYKIDTSKPGSDLAAETAAALAATAIA 180 CfEG3 (BAB40696) AHTAANEFYGQVGQGDVDHAYWGRPEDMTMSRPAYKIDTSKPGSDLAAETAAALAATAIA 180 C. curvignathus AHTAASEFYGQVGQGDVDHAYWGRPEDMTMSRPAYKIDTSKPGSDLAAETAAALAATAIV 164 CfEG1 (BAB40693) YKSADSTYSNNLITHAKQLFDFANNYRGKYSDSITDAKNFYASGDYKDELVWAAAWLYRA 240 CfEG3 (BAB40696) YKSADSTYSNNLITHAKQLFDFANNYRGKYSDSITDAKNFYASGDYKDELVWAAAWLYRA 240 C. curvignathus YKSVDSTYSNNLITHAKQLFDFAN Gambar 15 Analisis protein putative gen endoglukanase C. curvignathus. = N- terminal, = consensus signature GHF 9, o = nucleophile, * = conucleophile, # = salt bridge. #