KARAKTERISASI EKSON-INTRON 1, 5, DAN 6 GEN ENDOβ-1,4-GLUKANASE PADA RAYAP Coptotermes curvignathus BISRI MUSTOFA

Transkripsi

1 KARAKTERISASI EKSON-INTRON 1, 5, DAN 6 GEN ENDOβ-1,4-GLUKANASE PADA RAYAP Coptotermes curvignathus BISRI MUSTOFA DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2012

2 ABSTRAK BISRI MUSTOFA. Karakterisasi Ekson-Intron 1, 5, dan 6 Gen Endo-β-1,4-glukanase pada Rayap Coptotermes curvignathus. Dibawah bimbingan RIKA RAFFIUDIN dan IMAN RUSMANA. Limbah pertanian yang mengandung selulosa dapat diolah menjadi bioetanol. Konversi selulosa menjadi bioetanol memerlukan enzim selulase. Selulase yang dihasilkan rayap mampu mendegradasi selulosa. Rayap Coptotermes curvignathus mampu mendegradasi selulosa karena enzim selulase yang disandikan oleh gen endo-β-1,4-glukanase. Sekuen gen endo-β-1,4-glukanase rayap C. curvignathus (CcEG) dari penelitian sebelumnya belum lengkap dikarakterisasi, sehingga penelitian ini bertujuan melengkapi karakterisasi gen endo-β-1,4-glukanase pada rayap C. curvignathus. Metode yang digunakan adalah ekstraksi DNA menggunakan metode CTAB yang dimodifikasi, amplifikasi DNA, dan sekuen DNA. Hasil amplifikasi ekson 1, 5, 6 CcEG berukuran 46, 79, dan 163 pb, sedangkan intron 1, 5, dan 6 secara berurutan sebesar 483, 725, dan 274 pb. Sekuen DNA Ekson 5 CcEG hasil penelitian ini melengkapi penelitian sebelumnya dengan jumlah nukleotida yang berada pada posisi yang sama (overlap) sebanyak 26 pb. Ukuran panjang ekson 1, 5, dan 6 CcEG sama dengan C. formosanus (CfEG) masing-masing yaitu 46, 178, dan 163 pb. Komposisi GC ekson CcEG sebesar 50.3% pada ekson sedangkan pada intron sebesar 43.3%. Intron 1, 5, dan 6 CcEG diawali dengan basa GT dan diakhiri AG. Hasil analisis deduksi gen endo-β-1,4-glukanase ekson 1, 5, dan 6 CcEG menghasilkan 94 asam amino putative dengan metionin sebagai awal asam amino, dan termasuk kelompok Glycosyl Hydrolase Family 9 (GHF9). Analisis BLAST dan jarak genetik CcEG terhadap C. formosanus (CfEG), Reticulitermes speratus (RsEG), dan Nasutitermes takasagoensis (NtEG) menunjukkan tingkat kekerabatan yang tinggi dengan CfEG. Hasil karakterisasi gen endo-β-1,4-glukanase pada rayap C. curvignathus.diharapkan dapat menjadi informasi dasar penelitian in vitro karakterisasi enzim selulase rayap tersebut. Kata kunci : Isoptera, Rhinotermitidae, gen endo-β-1,4- glukanase, enzim selulase ABSTRACT BISRI MUSTOFA. Characterization of Exon-Intron 1, 5, 6 Endo-β-1,4-glucanase Genes of Termites Coptotermes curvignathus. Supervised by RIKA RAFFIUDIN and IMAN RUSMANA. An agricultural waste with cellulose-containing can be processed into ethanol. Conversion of cellulose into bioethanol requires cellulase enzyme. Cellulase enzyme from termite is able to degrade cellulose. Termite Coptotermes curvignathus is able to degrade cellulose due to cellulase enzymes encoded by genes endo-β-1,4-glucanase. Gene sequences of endo-β-1,4-glucanase termite C. curvignathus (CcEG) resulted from previous research has not completed yet, hence this research was aimed to complete the gene characterization. Method that used in this study were CTAB DNA extraction with modified method, DNA amplification, and gene sequencing. The size of exons 1, 5, and 6 CcEG were 46, 79, and 163 bp respectively and the size of intron 1, 5, and 6 were 483, 725, and 274 bp, respectively. The exon 5 CcEG gave further contribution to the previous research, with 26 bp of overlap bases. Exon 1, 5, and 6 CcEG showed similar size to C. formosanus (CfEG) each of which were 46, 178, and 163 bp, respectively. GC composition was 51.4% in exons, while the introns possessed 42,3% of GC. Intron 1, 5, and 6 CcEG were commenced with GT and ended with AG. Amino acid deduction analysis of exon 1, 5, and 6 CcEG resulted 95 putative amino acids with methionine as the first amino acids and the protein was classified in a group of Glycosyl Hydrolase Family 9 (GHF9). BLAST and genetic distance analysis of CcEG with C. formosanus (CfEG), Reticulitermes speratus (RsEG), and Nasutitermes takasagoensis (NtEG) showed high level of similarity with CfEG. The results of endo-β-1,4- glucanase gene characterization of C. curvignathus were expected as basic data for further in vitro cellulase enzyme studies. Keywords : Isoptera, Rhinotermitidae, endo-β-1,4- glucanase gene, cellulase enzyme

3 KARAKTERISASI EKSON-INTRON 1, 5, DAN 6 GEN ENDOβ-1,4-GLUKANASE PADA RAYAP Coptotermes curvignathus BISRI MUSTOFA Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Biologi DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2012

4 Judul Skripsi : Karakterisasi Ekson-Intron 1, 5, dan 6 Gen Endo-β-1,4-glukanase pada Rayap Coptotermes curvignathus Nama : Bisri Mustofa NIM : G Menyetujui, Dr. Ir. Rika Raffiudin, M.Si. Pembimbing I Dr. Ir. Iman Rusmana, M.Si. Pembimbing II Mengetahui, Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena, M.Si. Ketua Departemen Biologi Tanggal lulus:

5 PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah Tuhan Yang Maha Esa atas segala karunia- Nya, sehingga karya ilmiah ini dapat diselesaikan. Penelitian dengan judul Karakterisasi Ekson- Intron 1, 5, dan 6 Gen Endo-β-1,4-glukanase pada Rayap Coptotermes curvignathus ini dilakukan mulai Januari 2011 sampai dengan agustus 2011 di Bagian Fungsi dan Perilaku Hewan, Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Penelitian ini didanai oleh Dr. Ir. Rika Raffiudin, M.Si. Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr. Ir. Rika Raffiudin, M.Si. dan Dr. Ir Iman Rusmana, M.Si. atas bimbingan dan arahan yang diberikan. Ungkapan terimakasih juga disampaikan kepada Rut Normasari M.Si, Jazirotul M. Si., Ruth Matha M.Si., teman-teman di bagian Fungsi dan Perilaku Hewan, Ibu Tini dan Ibu Ani serta keluarga besar Dosen di Zoologi atas bantuan dan saran selama penulis melakukan penelitian ini. Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada keluarga tercinta yang senantiasa memberi cinta, doa dan dukungan, serta teman-teman tersayang khususnya di Biologi angkatan 44 dan Keluarga besar Rohis Biologi yang selalu memberikan bantuan, doa, semangat dan kasih sayang. Penulis berharap semoga karya tulis ini dapat bermanfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan. Bogor, 11 Mei 2012 Bisri Mustofa

6 RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Jakarta Provinsi DKI Jakarta pada tanggal 10 Oktober 1989 dari pasangan Sudarman dan Bunyani. Penulis merupakan anak ketiga dari tiga bersaudara. Penulis menyelesaikan pendidikan dasar dan menengah di SDN 12 pagi pada tahun 2001, SMPN 67 Jakarta pada tahun 2004, dan SMAN 43 Jakarta pada tahun Setelah itu, penulis melanjutkan pendidikan tinggi pada Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor melalui Seleksi Penerimaan Mahasiswa Baru. Penulis mempunyai pengalaman sebagai asisten praktikum pada mata kuliah Biologi Dasar (BIO100) pada tahun 2010 dan 2011, serta Perkembangan Hewan (BIO261) pada tahun Penulis juga pernah aktif dalam Lembaga Dakwah Fakultas FMIPA yaitu Serambi Ruhiah Mahasiswa FMIPA (SerumG), sebagai Anggota Human Research Development (HRD) tahun 2009 dan sebagai Kepala departemen HRD serumg tahun Penulis pernah menjadi peserta Olimpiade Sains Nasional (OSN) Pertamania Penulis juga aktif dalam partisipasi dalam berbagai aktivitas kepanitiaan lainnya. Selama menempuh studi di Departemen Biologi, penulis juga pernah melakukan penelitian dalam studi lapang mengenai isolasi bakteri dari usus serangga eksotik di Cangkuang Sukabumi pada tahun 2009 dan praktik lapangan di Serikat Petani Indonesia (SPI) mengenai pembuatan pupuk kompos dengan mikroorganisme efektif (EM) dan uji perbandingan EM industri (EM-4) dengan EM lokal dalam pembusukan sampah organik, di PUSDIKLAT SPI, Cibereum, Dramaga, Bogor pada tahun 2010.

7 DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL...viii DAFTAR GAMBAR...viii DAFTAR LAMPIRAN...viii PENDAHULUAN... 1 Latar Belakang... 1 Tujuan Penelitian... 1 BAHAN DAN METODE... 1 Waktu dan Tempat Penelitian... 1 Koleksi sampel C. curvignathus... 1 Ekstaksi dan Presipitasi DNA C. curvignathus... 1 Amplifikasi DNA Endo-β-1,4- glukanase Sampel Dengan PCR... 2 Visualisasi DNA C. curvignathus Gen Endo-β-1,4-glukanase... 2 Sequencing DNA, Analisis DNA, dan Asam Amino Endo-β-1,4- glukanase C. curvignathus.. 2 HASIL DAN PEMBAHASAN... 4 Amplifikasi dan Visualisasi DNA Endo-β-1,4- glukanase C. curvignathus... 4 Sekuen ekson intron Gen Endo-β-1,4- glukanase C. curvignathus... 5 Analisis Homologi dan BLASTN Gen Endo-β-1,4- glukanase C. curvignathus... 6 Analisis Homologi, BLASTP, Jarak Genetik, dan Struktur Asam amino Putative Endo-β-1,4- glukanase Rayap C. curvignathus... 7 SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Saran DAFTAR PUSTAKA LAMPIRAN... 13

8 DAFTAR TABEL Halaman 1 Sekuen primer untuk amplifikasi gen endo-β-1,4- glukanase pada rayap C. curvignathus Kombinasi primer dan prediksi ukuran amplikon Sekuen gen endo β-1,4 glukanase rayap dari GenBank, unruk alignment Panjang sekuen ekson-intron 1, 5, dan 6 endo-β-1,4-glukanase C. curvignathus Jarak genetik asam amino putative ekson 1, 5, dan 6 endo-β-1,4-glukanase parsial C. curvignathus DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Skema posisi primer untuk amplifikasi gen endoglukanase C. curvignathus Pita DNA hasil amplifikasi gen endoglukanase C. curvignathus Contig gen endoglukanase C. curvignathus dengan menggunakan pasangan primer CfF1 dan CfR1a (a), CfF5a dan CfR5 (b), dan CfF6 dan CfR6(c) Sekuen ekson-intron 1(a), 5 dan 6 (b) gen endoglukanase C. curvignathus Skema posisi ekson dan intron NtEG, RsEG, CfEG, dan CcEG Asam amino putative ekson 1, 5, dan 6 gen endo-β-1,4-glukanase rayap C. curvignathus Alignment asam amino putative ekson 1, 5, dan 6 gen endo-β-1,4-glukanase rayap Pohon filogeni endo-β-1,4-glukanase parsial rayap C. curvignathus, C. formosanus, R. speratus, dan N. takasagoensis Struktur 3 dimensi endo-β-1,4-glukanase parsial rayap C. curvignathus DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1 Kromatogram hasil sekuen gen endoglukanase C. curvignathus primer CfF Kromatogram hasil sekuen gen endoglukanase C. curvignathus primer CfR Alignment basa nukleotida ekson 1, 5, dan 6 CcEG dengan CfEG, NtEG, dan RsEG Overlap sekuen yang menggunakan CfF5-R5 (CcEG 5) dengan sekuen ekson 5 CcEG (Normasari 2011) dan sekuen ekson 6 CcEG Analisis homologi asam amino putative endo-β-1,4-glukanase parsial C. curvignathus... 17

9 PENDAHULUAN Latar Belakang Selulosa merupakan polisakarida yang paling melimpah di alam (Achmadi 1988), namun belum dimanfaatkan dengan optimum. Selulosa yang memiliki ikatan β-1,4-glikosida dapat dikonversi menjadi bioetanol sebagai sumber bahan bakar terbarukan dengan menghidrolisis selulosa menjadi etanol. Hidrolisis selulosa dalam pembuatan bioetanol memerlukan enzim selulase. Enzim selulase dapat diperoleh dari organisme yang mencerna selulosa, misalnya rayap. Rayap Coptotermes curvignathus (Isoptera : Rhinotermitidae) banyak ditemukan di Indonesia dan memiliki kemampuan mendegradasi selulosa. Kemampuan mendegradasi selulosa rayap ini karena memiliki enzim selulase yang dihasilkan rayap itu sendiri dan dari simbion (Nakashima et al. 2001). Enzim selulase yang dihasilkan rayap merupakan enzim yang diekspresikan oleh gen endo-β-1,4-glukanase. Gen endo-β-1,4-glukanase telah diteliti pada Nasutitermes takasagoensis (Isoptera : Termitidae) dan diperoleh data genomik lengkap pada rayap tersebut. Data genomik N. takasagoensis terdiri dari 10 ekson dan 9 intron dengan Accesion number (Acc number) AB (Tokuda et al. 1999). Selain itu rayap C. formosanus (Isoptera: Rhinotermitidae), diperoleh data mrna gen endo-β- 1,4-glukanase sebesar 1348 pb, (Acc number AB058670) (Nakashima et al. 2001). Gen endo-β-1,4-glukanase C. curvignathus yang telah dikarakterisasi sebagian yaitu eksonintron 2, 3, 4, dan 5 (Normasari 2011) dan ekson-intron 7, 8, dan 9 (Nurgianti 2011). Total ukuran ekson 2, 3, 4, dan 5 sebesar 564 pb dan total ukuran intron 2, 3, dan 4 sebesar 1147 pb. Ekson 7, 8, 9 memiliki total ukuran sebesar 519 pb dan intron 7, 8, memiliki total ukuran sebesar 1049 pb. Sedangkan karakterisasi ekson-intron 1, 5, dan 6 gen endo-β-1,4-glukanase pada rayap C. curvignathus, belum dikarakterisasi. Oleh karena itu, penelitian ini dimaksudkan untuk melanjutkan penelitian sebelumnya, sehingga melengkapi data ekson dan intron endo-β-1,4- glukanase C. curvignathus. Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan mengkarakterisasi ekson dan intron 1, 5, dan 6 gen endo-β-1,4-glukanase pada rayap C. curvignathus. BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dimulai sejak Januari 2011 sampai dengan September 2011 yang bertempat di bagian Fungsi dan Perilaku Hewan, Departemen Biologi, Institut Pertanian Bogor. Koleksi Sampel C. curvignathus Obyek yang digunakan adalah sampel rayap pekerja C. curvignathus hasil koleksi dari Dr. Ir. Rika Raffiudin, M.Si. di Departemen Biologi FMIPA IPB. Hasil koleksi berasal dari sarang rayap yang berada di pohon pinus (Pinus mercusii) pada halaman parkir Perpustakaan IPB (06 o ; LS; 106 o BT), Kampus IPB Dramaga, Bogor. Rayap yang diperoleh dimasukkan ke dalam tabung 1,5 ml yang telah berisi alkohol 100%. Ekstraksi dan Presipitasi DNA C. curvignathus Sampel rayap diekstraksi dengan metode Cetyl Trimethylammonium Bromide (CTAB) dan presipitasi etanol berdasarkan metode Sambrook et al. (1989) modifikasi Raffiudin dan Crozier (2007). Sumber DNA berasal dari bagian kepala dan toraks rayap pekerja C. curvignathus. Sampel rayap yang akan diekstraksi, dimasukkan dalam larutan Tris-HCl EDTA ((TE) (Tris-HCl-EDTA 10 mm ph 8; EDTA 1 mm)) untuk menghilangkan etanol dari jaringan tubuh. Ekstraksi dimulai dengan pemisahan kepala dan torak rayap pekerja C. curvignathus di atas cawan petri steril, kepala dan torak dimasukan ke dalam tabung 1.5 ml kemudian tabung berisi kepala dan torak rayap tersebut direndam dalam nitrogen cair selama 15 menit. Sampel kemudian digerus dengan grinder sampai hancur, kemudian 250 µl CTAB 0.2% ditambahkan ke dalam tabung yang berisi hancuran kepala dan toraks. Proteinase K (5 mg/ml) ditambahkan sebanyak 7 μl untuk mendegradasi protein, kemudian diinkubasi selama 2 jam pada suhu 55 C. Setelah diinkubasi, tabung beserta isinya disentrifugasi rpm selama 10 menit. Supernatan dipindahkan ke tabung baru, kemudian ditambahkan 300 μl larutan Phenol : Chloroform : Isoamyl alcohol (PCI) = 25 : 24 : 1, digoyang dengan shaker perlahan selama 5 menit lalu disentrifugasi rpm selama 5 menit. Lapisan atas yang berisi DNA dipindahkan ke tabung baru, kemudian ditambahkan 200 μl larutan

10 2 CIAA (Chloroform : Isoamyl alcohol = 24 : 1), digoyang dengan tangan selama 5 menit hingga larutan homogen dan disentrifugasi rpm selama 3 menit. Lapisan atas campuran yang berisi DNA dipindahkan ke tabung baru. Sebelum presipitasi DNA dilakukan pada hasil ekstraksi tersebut, ditambahkan 300 μl isopropanol murni dan disimpan selama 12 jam pada suhu 4 C. Presipitasi DNA dilakukan dengan sentrifugasi rpm selama 30 menit pada suhu 4 C sehingga terbentuk pelet. Larutan berisi isopropanol dibuang, kemudian ditambahkan 200 μl etanol 70% dan disentrifugasi rpm selama 10 menit pada suhu 4 C. Etanol 70% dibuang, kemudian pelet DNA dikeringkan dengan cara divakum selama 30 menit. Pelet DNA kemudian disuspensikan dalam TE 0.5 mm sebanyak μl dan disimpan pada suhu 4 C. Amplifikasi DNA Endo-β-1,4- glukanase C. curvignathus dengan PCR Amplifikasi fragment gen endo-β-1,4- glukanase dilakukan dengan Polymerase Chain Reaction (PCR) menggunakan mesin thermocycler (ESCO SWIFT MAXI-BLC1). DNA target diamplifikasi menggunakan beberapa pasangan primer untuk memperoleh ekson-intron 1, 5, dan 6 (Tabel 1 dan 2). Primer didesain berdasarkan sekuen cds DNA C. formosanus (Tabel 3) dan dibuat pasangan primer yang terletak di ekson berbeda (Gambar 1). Primer forward didesain di daerah ekson target dan primer reverse dibuat di ekson berikutnya sehingga memungkinkan intron target teramplifikasi. Pasangan primer dibedakan menjadi dua yaitu, primer internal dan eksternal (Tabel 1 dan 2). Amplifikasi gen endo-β-1,4-glukanase C. curvignathus dengan pasangan primer eksternal dilakukan pada amplifikasi ekson-intron 6 dengan perlakuan peningkatan ion magnesium (Mg 2+ ). Nested PCR, dilakukan pada ekson-intron 1 dan 5 (Gambar 1). Nested PCR merupakan amplifikasi lebih lanjut produk PCR dari amplifikasi menggunakab primer eksternal dengan menggunakan primer internal yang bertujuan untuk meningkatkan spesifikasi gen target (Lin et al. 2010). Total pereaksi yang digunakan 20 µl PCR campuran. Campuran tersebut terdiri atas 6.2 µl akuades steril, 0.8 µl primer forward 10 µm, 0.8 µl primer reverse 10 µm, 10 µl KAPA Taq ReadyMix DNA Polymerase buffer Mg mm, dntp 0.4 mm, KAPA Taq DNA Polymerase 0.05 (U/µl), penambahan 1-1,2 µl MgCl mm, dan 1 µl DNA hasil ekstraksi. Amplifikasi dilakukan sebanyak 30 siklus dengan kondisi PCR yang tetap. Kondisi PCR sebagai berikut; inisiasi denaturasi DNA selama 4 menit pada suhu 95 C, denaturasi DNA sebanyak 30 siklus pada suhu 94 C, penempelan primer 1 menit pada suhu 50 C, elongasi DNA selama 2 menit pada suhu 72 C dan 20 menit untuk ekstensi DNA. Visualisasi DNA C. curvignathus Gen Endo-β-1,4-glukanase Hasil amplifikasi fragmen gen endo-β- 1,4-glukanase yang dihasilkan dari PCR dimigrasikan dalam Polyacrilamyde Gel Electrophoresis (PAGE) konsentrasi 6%. Komposisi PAGE 6%, yaitu 12 ml akuades; 4 ml TBE 5x (Tris 0.5 M, asam borat 0.65 M, EDTA 0.02M); 4 ml acrylamide 30%; 15 μl tetramethylethylenediamine (TEMED); 150 μl Amonium Peroxodisulfate (APS) 10%. Hasil PCR tersebut dimigrasikan pada PAGE dengan tegangan 200 V selama 50 menit. Visualisasi fragmen DNA target dilakukan dengan metode pewarnaan perak nitrat (Byun et al. 2009). Gel hasil elektroforesis dicuci dengan akuades, kemudian direndam dalam larutan satu (200 ml akuades, 0.2 g AgNO 3, 80 µl NaOH (4 g/10 ml akuades), dan 0.8 ml NH 4 OH) selama 8 menit, kemudian gel segera dibilas sekali lagi dengan akuades, selanjutnya gel direndam dalam larutan dua (200 ml akuades, 6 g NaOH, dan 100 µl formalin) hingga pita DNA (amplikon) muncul. Tahapan akhir, gel direndam di dalam larutan tiga (100 ml akuades dan 100 µl asam asetat) untuk pengawetan gel. Sequencing DNA, Analisis DNA dan Asam Amino Endo-β-1,4-glukanase C. curvignathus DNA target, ekson 1, 5, dan 6 rayap C. curvignathus yang diperoleh kemudian, dikirim ke perusahaan jasa sekuen. Sekuen nukleotida diolah dan dianalisis menggunakan program Genetyx Win Versi 4.0. Hasil sekuen forward dan reverse di-alignment untuk mendapatkan sekuen utuh (Contig) DNA menggunakan program Mega 4 (Tamura et al. 2007). Analisis homologi untuk urutan basa dilakukan melalui BLASTn ( dan urutan asam amino dilakukan melalui BLASTp ( pada situs National Center for Biotechnology Information (NCBI). Hasil sekuen endo-β-1,4- glukanase C. curvignathus yang telah diedit

11 3 kemudian dilakukan analisis homologi dengan cara melakukan alignment terhadap gen endo β-1,4 glukanase N. takasagoensis (NtEG), C. formosanus (CfEG), dan Reticulitermes speratus (RsEG) (Tabel 3). Sekuen DNA kemudian dideduksi menjadi asam amino menggunakan program Genetyx Win Version 4.0. Hasil sekuen endo-β-1,4-glukanase C. curvignathus yang telah diedit dan deduksi asam amino tersebut di-alignment dengan program Mega 4 (Tamura et al. 2007). Analisis struktur 3 dimensi asam amino endoβ-1,4-glukanase dilakukan meng-gunakan program Cn3D 4.1 dan melalui situs NCBI. Selain itu, juga dianalisis jarak genetik dan dibuat dendogram atau pohon filogeni rayap C. curvignathus terhadap C. formosanus, R. speratus, dan N. takasagoensis dengan menggunakan program Mega 4. Tabel 1 Sekuen primer untuk amplifikasi gen endo-β-1,4- glukanase pada Rayap C. curvignathus No Primer Target eksonintron ke Urutan Basa Nukleotida (5-3 ) Posisi primer berdasar CfEG3 (Nakashima et al 2002) 1 CfF1 1 ATGAGGGTCTTCTTTTGCCTTCT CfF1a 1 TGAGGGTCTTCTTTTGCCTTC CfR1 1 CCGATCGCTGAGCCTCGTAGA CfR1a 1 AAGGATTCCGCCCTTAACGAC CfF5 5 CACGCCAAGCAGCTTTTCGACTT CfF5a 5 ACGCCAAGCAGCTTTTCGACTT CfR5 5 TAGGTGTTGTCGTTGGTCGCC CcR5 5 TATCCCAGTTGAAGGCACCATT CfF6 6 GACTACAAGGATGAGTTAGTATG CfR6 6 TTGTACCTTGTCCTTGTATGC Tabel 2 Kombinasi primer dan prediksi ukuran amplikon No Kombinasi primer Target eksonintron ke berdasarkan CfEG3 Prediksi ukuran ekson Jenis primer Forward Reverse 1 CfF1 CfR1a 1 Eksternal primer 165 pb 2 CfF1a* CfR1* 1 Internal primer 106 pb 3 CfF5a CcR5 5 Eksternal primer 225 pb 4 CfF5a* CfR5* 5 Internal primer 155 pb 5 CfF6* CfR6* 6 Eksternal primer 240 pb *Primer yang digunakan dalam sekuen DNA CfF1 CfF5a CfF1a CfF5 CfF CfR1 CfR1a CfR5 CcR5 CfR6 Gambar 1 Skema posisi primer untuk amplifikasi gen endoglukanase C. curvignathus berdasarkan CfEG (AB058670). Kotak menunjukkan ekson, angka di dalam kotak menunjukkan nomor urut ekson. Tabel 3 Sekuen gen endo β-1,4 glukanase rayap dari GenBank yang digunakan sebagai dasar desain primer dan analisis homologi No Spesies Acc number Pustaka Nukleotida Asam amino 1. Coptotermes formosanus AB BAB40696 Nakashima et al Nasutitermes takasagoensis AB BAA76619 Tokuda et al Reticulitermes speratus AB BAA31326 Tokuda et al. 1999

12 HASIL DAN PEMBAHASAN Amplifikasi dan Visualisasi DNA Endo-β- 1,4- glukanase C. curvignathus Amplifikasi DNA ekson 1 dan 5 CcEG menggunakan pasangan primer eksternal (Tabel 2) dan masing-masing menunjukkan ukuran amplikon sekitar 600 dan 1000 pb (Gambar 2a dan 2c). Namun hasil PCR dengan menggunakan primer eksternal tersebut menunjukkan pita DNA yang tipis (Gambar 2a dan 2c). Pita DNA (amplikon) yang tipis menunjukkan konsentrasi DNA yang diperoleh masih rendah. Hasil PCR ekson 1 dan 5 CcEG dengan konsentrasi amplikon yang rendah tersebut, kembali diamplifikasi dengan primer internal (Tabel 2) dan masing-masing menunjukkan ukuran amplikon sekitar 600 dan 1000 pb dengan konsentrasi yang tinggi (Gambar 2b dan 2d). Peningkatan konsentrasi ini terjadi karena sumber DNA merupakan hasil PCR dari amplifikasi primer eksternal yang telah dipurifikasi. Penggunaan primer internal yang dibuat di sebelah dalam primer eksternal merupakan teknik yang disebut Nested Polymerase Chain Reaction (Nested PCR). Dengan Nested PCR, amplifikasi akan lebih spesifik pada DNA target, sehingga konsentrasi DNA meningkat (Lin et al. 2010). Amplifikasi DNA ekson 6 CcEG menggunakan pasangan primer CfF6-R6 menunjukkan ukuran amplikon sekitar 500 pb. Namun amplikon menunjukkan variasi konsentrasi DNA (Gambar 2e). Hasil amplifikasi dengan peningkatan konsentrasi Mg mm menjadi 2.0 mm sampel yang sama (Cc 46 LSI), pada nomer 1 dan 2 menghasilkan konsentrsai DNA yang tinggi dibanding nomer 3 dan 4 (Gambar 2e) yang tanpa peningkatan konsentrasi Mg 2+. Hal ini terjadi karena peningkatan konsentrasi Mg 2+ mampu mengoptimasi amplifikasi karena pengaruhnya dalam penempelan primer (Innis & Gefland 1990). Hasil sekuen ekson-intron 1, 5, dan 6 CcEG yang diperoleh berupa kromatrogram basa nukleotida (Lampiran 1 dan 2). pb M 1 2 pb M 1 2 pb M (a) (b) pb M 1 2 pb M 1 2 pb M pb M (c) (d) (e) Gambar 2 Pita DNA hasil amplifikasi gen endoglukanase C. curvignathus pada gel poliakrilamid dengan menggunakan (a) pasangan primer CfF1-R1a; (b) pasangan primer CfF1-R1; (c) pasangan primer CfF5a dan CcR5; (d) pasangan primer CfF5a-R5; (e) pasangan primer CfF6 dan CfR6. M = penanda 100 pb DNA ladder (Promega). = amplikon yang diperoleh.

13 5 Sekuen Ekson-Intron Gen Endo-β-1,4- glukanase C. curvignathus Hasil sekuen ekson-intron 1, 5, dan 6 gen endo-β-1,4-glukanase C. curvignathus diedit dan di-alignment dengan sekuen CfEG3, RsEG, dan NtEG (Tabel 3). Ukuran gen endo-β-1,4-glukanase C. curvignathus yang diperoleh menggunakan pasangan primer CfF1a-R1 (Gambar 3a), CfF5-R5 (Gambar 3b), dan CfF6-R6 (Gambar 3c) yaitu masing-masing sebesar 594 (Gambar 4a, Tabel 4), 872 (Gambar 4b Tabel 4), dan 465 pb (Gambar 4c, Tabel 4). Total sekuen DNA CcEG yang didapat adalah 1931 pb. Hasil sekuen ekson 5 CcEG yang diperoleh penelitian ini melengkapi sekuen ekson 5 CcEG penelitian Normasari (2011) dan melengkapi sekuen ekson 6 (Tabel 4 Lampiran 4). Komposisi GC sekuen ekson CcEG sebesar 51.4% sedangkan sekuen intron sebesar 42.3%. Berdasarkan Alignment nukleotida juga diketahui Intron 1, 5, dan 6 CcEG diawali dengan basa GT (pada ujung 5 -intron) dan diakhiri dengan basa AG (pada ujung 3 -intron). Hasil ini seperti intron gen amy dari Drosophila (Inomata et al. 1997) dan intron 2 dan 4 CcEG (Normasari 2011). CfF1 >>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>> ATGAGGGTCTTCTTTTGCCTTCTGTCTGCGCTCGCGCTTTGCCAAGGTAACCAGTTCACCACTACACTTGG GTTAGAGTTCACTGTGGTAATTTCACACTATTCCCAACAGGATCACACACCTACAGCTATACTCACGAATA ACGCAAGTTCACCTAGTTATACGGATCAGAACCATAAGCTTACATTACCGTAACAGGTTGCTGCAAACTGT ACGATCTCCAAAGCCGCATACATTGTCTCTCTCGCTCTCTCTCTCTCTCACACACGCGCGCACGCACAGAA TAGAACAAAACCAACATCAATGGATACCATAGACAGGGATATAAATGCACCGGTTTATGACACAACGCCCG GATCGCGCTTCATGTTCGAAAATGCTGCAATTCCAAACTGAACACACACGGTAACTTGGCTCAATGGAAAT GTTATCCATTGTCGTTTCATGTCCTACACTTCATCATAAAGACACTCTCCGATGCATATTCCTACAAGGGG GAGACGTTCCCATAATGTGCCCTGTGTTACAGCTGCTTACGACTACAAGACAGTACTGAAGAATTCGCTGC TTTTCTACGAGGCTCAGCGATCGG <<<<<<<<<<<<<<<<<<<< CfR1 (a) CfF5a >>>>>>>>>>>>>>>>>>> CCAAGCAGCTTTTCGACTTCGCCAACAATTATCGCGGCAAATACAGCGATTCCATCACCGACGCGAAGAAT TTCTATGCGTAAGTGTACTACACTACCCACTCAATTTGCWATACGTACAGCGCTCTTACRCACGYCGSGCT GTCACMACTACCTAAACTYGGCGTTTAGAACTGCWTGAKGCTYGTACATTACACACACCTCCTTTGTGCGC AGGATCCTACRAATTACCACTCGGCCCAGCTGCCKGTCAATTACTCAGTCAGGCACATTCACATATYTAAA GGATACATATAAACACGTTGCAGTGATTACRGGGAAGTTTTACCCTGTTCCGTACGACTACGCTCTATCAT AATAAAAAAACATTAATTTHATCTTCACGTTTAADGTAATATCTTCCACGGGADGTATCACAGKGTGAAGG ATATCGCARACTTCTGCCGCAACATATGTYTACKGCATGACGTTACGTTTCATTCTTTCCACTGAAAACAA CTGTCATATAATGCACATCGCCCCTTTATTAGCCTCTCTTTAACGAATTTTGTGCAAAAGATTCAAATCTA CACAGTTATTCGTCCAGAACTGTGAGACATTTTTCTTCATTATGTGTTCCTGCAATGCCACACTCTGTACT CTGCTACAAATATATTCACACAGAGGAGCAGACTACCGCCTGCATACTCAGTACTATGTTCCTAGCACGAT AAATCTGATACGCTGAATGGCATCACAACGTCAAAATCTCCATATTCACCACCGTCACAAACACAAATCAA CCATTTCTAATCATCTGATGTAGGTCTGGAGACTACAAGGATGAGTTAGTATGGGCAGCCGCATGGCTCTA CAGGGCGACCA >>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>> <<<<<<<<< CfF6 CfR5 (b) CfF6 CfR5 >>>>>> <<<<<<<<<<<<<<<<<<<< AGTATGGGCAGCCGCATGGCTCTACAGGGCGACCAACGACAACGCCTATCTCACTAAAGCTGAGTCGCTGT CcR5 ACAACGAATTCGGCCTTGGAAGCTGGAATGGTGCCTTCAACTGGGATAACAAGATCTCCGGTGTACAGGTC <<<<<<<<<<<<<<<<<<< AGACACGTGAAGAAATTCATGCTTACAAAAGTCACGGACAAAACAACAAAGCTACAGATATTAATACATAC CACAAGCCACACAATCACTGTGTCAGTTTCAGTCACTAGCTGAGTGATAGTTCTTCAGCCATGGAAGTGTA GGCGTCATACAGTAATAATCATTCACAAAAGAAAACTGAAAATCCTGGACAATATAGGTGCCGAAACAGCA ATAGGCACCATGTTCCTAAACGTTTCGCCCTCTATCATATTTACTTGAACTTCCACAGGTTCTACTGGCCA AGCTCACAAGCAAGCAGGCATACAAGGACAAGGTACAGG <<<<<<<<<<<<<<<<<<<<< CfR6 (c) Gambar 3 Contig gen endoglukanase C. curvignathus dengan menggunakan pasangan primer (a) CfF1-R1, (b)cff5a-r5 dan (c) CfF6-R6. Huruf kapital = urutan basa ekson basa yang digaris bawah= primer. Basa nukleotida ambigu; D= A/G/T; H= A/C/T; K= G /T; M= A/C; R= A/G; S= C/G; W= A/T; Y= C/T

14 6 ATGAGGGTCT TCTTTTGCCT TCTGTCTGCG CTCGCGCTTT GCCAAGgtaa 50 ccagttcacc actacacttg ggttagagtt cactgtggta atttcacact 100 attcccaaca ggatcacaca cctacagcta tactcacgaa taacgcaagt 150 tcacctagtt atacggatca gaaccataag cttacattac cgtaacaggt 200 tgctgcaaac tgtacgatct ccaaagccgc atacattgtc tctctcgctc 250 tctctctctc tcacacacgc gcgcacgcac agaatagaac aaaaccaaca 300 tcaatggata ccatagacag ggatataaat gcaccggttt atgacacaac 350 gcccggatcg cgcttcatgt tcgaaaatgc tgcaattcca aactgaacac 400 acacggtaac ttggctcaat ggaaatgtta tccattgtcg tttcatgtcc 450 tacacttcat cataaagaca ctctccgatg catattccta caagggggag 500 acgttcccat aatgtgccct gtgttacagc TGCTTACGAC TACAAGACAG 550 TACTGAAGAA TTCGCTGCTT TTCTACGAGG CTCAGCGATC GG 592 (a) Ekson 1 Intron 1 Ekson 2 CCAAGCAGCT TTTCGACTTC GCCAACAATT ATCGCGGCAA ATACAGCGAT 50 TCCATCACCG ACGCGAAGAA TTTCTATGCg taagtgtact acactaccca 100 Ekson 5 ctcaatttgc watacgtaca gcgctcttac rcacgycgsg ctgtcacmac 150 tacctaaact yggcgtttag aactgcwtga kgctygtaca ttacacacac 200 ctcctttgtg cgcaggatcc tacraattac cactcggccc agctgcckgt 250 caattactca gtcaggcaca ttcacataty taaaggatac atataaacac 300 gttgcagtga ttacrgggaa gttttaccct gttccgtacg actacgctct 350 atcataataa aaaaacatta attthatctt cacgtttaad gtaatatctt 400 ccacgggadg tatcacagkg tgaaggatat cgcaracttc tgccgcaaca 450 tatgtytack gcatgacgtt acgtttcatt ctttccactg aaaacaactg 500 Intron 5 tcatataatg cacatcgccc ctttattagc ctctctttaa cgaattttgt 550 gcaaaagatt caaatctaca cagttattcg tccagaactg tgagacattt 600 ttcttcatta tgtgttcctg caatgccaca ctctgtactc tgctacaaat 650 atattcacac agaggagcag actaccgcct gcatactcag tactatgttc 700 ctagcacgat aaatctgata cgctgaatgg catcacaacg tcaaaatctc 750 catattcacc accgtcacaa acacaaatca accatttcta atcatctgat 800 gtaggtctgg AGACTACAAG GATGAGTTAG TATGGGCAGC CGCATGGCTC 850 TACAGGGCGA CCAACGACAA CGCCTATCTC ACTAAAGCTG AGTCGCTGTA 900 CAACGAATTC GGCCTTGGAA GCTGGAATGG TGCCTTCAAC TGGGATAACA 950 Ekson 6 AGATCTCCGG TGTACAGgtc agacacgtga agaaattcat gcttacaaaa 1000 gtcacggaca aaacaacaaa gctacagata ttaatacata ccacaagcca 1050 cacaatcact gtgtcagttt cagtcactag ctgagtgata gttcttcagc 1100 catggaagtg taggcgtcat acagtaataa tcattcacaa aagaaaactg 1150 Intron 6 aaaatcctgg acaatatagg tgccgaaaca gcaataggca ccatgttcct 1200 aaacgtttcg ccctctatca tatttacttg aacttccaca ggttctactg 1250 GCCAAGCTCA CAAGCAAGCA GGCATACAAG GACAAGGTAC AGG 1293 Ekson 7 (b) Gambar 4 Sekuen ekson-intron 1 (a), 5 dan 6 (b) gen endoglukanase C. curvignathus. Huruf kapital = urutan basa ekson; huruf kecil = urutan basa intron; basa dengan latar kuning = awal dan akhir intron; basa yang dengan garis bawah = overlap antar contig. Basa nukleotida ambigu; Basa nukleotida ambigu; D= A/G/T; H= A/C/T; K= G /T; M= A/C; R= A/G; S= C/G; W= A/T; Y= C/T Tabel 4 Panjang sekuen ekson-intron 1, 5, dan 6 endo-β-1,4-glikanase C. curvignathus No. Sekuen ekson Primer yang digunakan Total sekuen Panjang ekson Panjan g intron Informasi tambahan (pb) (pb) (pb) 1 1 CfF1-R1 (primer internal) Overlap 61 pb intron 2* 2 5 CfF5a-R5(primer internal) Overlap 26 pb ekson 5** dan 35 pb ekson 6*** 3 6 CfF6-R6 (primer Overlap 52 pb eksternal) ekson 7**** *) Overlap sekuen 1 CcEG dengan sekuen CcEG ekson 2 Normasari (2011); ** Overlap hasil 2 CcEG dengan CcEG ekson 5 Normasari (2011); *** Overlap hasil 2 CcEG dengan sekuen hasil ekson 6 CcEG penelitian ini, **** Overlap hasil 3 CcEG dengan sekuen CcEG ekson 7 Nurgianti (2011) (Lampiran 4)

15 7 Analisis Homologi Nukleotida dengan BLASTN Gen Endo-β-1,4- glukanase Rayap C. curvignathus Hasil alignment gen endo-β-1,4-glukanase parsial C. curvignathus (CcEG) dengan C. formosanus (CfEG3), R. speratus (RsEG), dan N. takasagoensis (NtEG) menunjukkan posisi ekson 1, 5, dan 6 CcEG berada pada ekson 1, 5, dan 6 CfEG dan RsEG, sedangkan pada NtEG berada pada ekson 2, 6, dan 7. Ukuran panjang ekson 5, 6 CcEG sama dengan ekson 5, 6 CfEG3 dan RsEG serta ekson 6 dan 7 NtEG (Gambar 5). Panjang Ekson 1 CcEG sama dengan panjang CfEG, namun berbeda dengan ekson 1 RsEG dan ekson 2 NtEG (Gambar 5). Hasil alignment ekson 1, 5, dan 6 CcEG dengan CfEG, NtEG, dan RsEG menunjukkan perbedaan basa paling sedikit dengan CfEG dibandingkan dengan NtEG dan RsEG (Lampiran 3). Hasil analisis homologi nukleotida dengan BLASTN ekson 1, ekson 5 dan ekson 6 gen endoglukanase parsial C. curvignathus homolog dengan CfEG (Tabel 5). Sekuen ekson 1,5, dan 6 CcEG secara keseluruhan menghasilkan persen homolog 98% dengan C. formosanus (Tabel 5). Kedua rayap ini memiliki genus yang sama yaitu Coptotermes (Ahmad 1958). Analisis Homologi asam amino dengan BLASTP, Jarak Genetik dan Struktur protein Endo-β-1,4-glukanase Parsial Rayap C. curvignathus Hasil deduksi sekuen ekson 1, 5, dan 6 rayap C. curvignathus gen endo-β-1,4- glukanase parsial menghasilkan sebanyak 95 asam amino putative dengan asam amino pertama adalah metionin (Gambar 6). Metionin merupakan asam amino hasil dari translasi kodon start (kodon penginisiasi awal) berupa basa ATG di utas DNA atau AUG di RNA (Griffiths et al. 1999). Hasil analisis homologi asam amino putative ekson 1, 5, dan 6 endoglukanase parsial C. curvignathus melalui BLASTp homolog 94% dengan asam amino putative C. formosanus (Tabel 6). Hasil alignment asam amino ekson 1, 5, dan 6 CcEG dengan CfEG3, RsEG, dan NtEG memperlihatkan bahwa asam amino putative CcEG memilki perbedaan yang paling sedikit dengan CfEG dibanding dengan RsEG dan NtEG, yaitu 1 asam amino berbeda (Gambar 7). Perhitungan jarak genetik dan pembuatan pohon filogeni berdasarkan asam amino putative gen endo-β-1,4-glukanase parsial C. curvignathus ekson 1, 5 dan 6 menunjukan CcEG lebih dekat dengan asam amino putative gen endoglukanase C. formosanus jika dibandingkan dengan asam amino putative gen endoglukanase N. takasagoensis dan R. speratus dilihat dari nilai jarak terkecil yaitu sebesar 0,011 (Tabel 7 dan Gambar 8). Nilai jarak genetik yang terjauh dari asam amino putative gen endo-β-1,4-glukanse parsial C. curvignathus adalah asam amino putative dari N. takasagoensis yaitu sebesar (Tabel 7). Hal ini menunjukkan bahwa C. curvignathus lebih dekat kekerabatannya dengan C. formosanus dibandingkan dengan N. takasagoensis. Rayap C. curvignathus dan C. formosanus termasuk ke dalam famili Rhinotermitidae sedangkan N. takasagoensis termasuk ke dalam famili yang berbeda yaitu Termitideae (Ahmad 1958). Struktur tiga dimensi endoglukanase parsial dibuat dengan program Cn3D. Struktur 3 dimensi yang terbentuk terdiri dari helix alpa dan lembar beta (Gambar 9). Analisis asam amino putative dengan BLASTp juga menunjukkan asam amino putative CcEG termasuk dalam kelompok Glycosyl Hydrolase Family 9 (GHF9) karena homolog 99% dengan GHF 9 C. formosanus (Lampiran 5). Hal ini memperlihatkan kemiripan tingkat asam amino putative dari CcEG terhadap NtEG, CfEG dan RsEG yang juga termasuk dalam GHF 9 (Tokuda et al. 1999, Nakashima et al. 2001) Rayap C. curvignathus berkerabat dekat dengan C. formosanus, R. speratus karena berasal dari famili yang sama yaitu Rhinotermitidae dibandingkan dengan N. takasagoensis yang bersal dari famili Termitideae. Namun C. curvignathus lebih dekat dengan C. formosanus dibandingkan dengan R. speratus karena berasal dari genus yang sama, yaitu Coptotermes (Ahmad 1958). Rayap famili Rhinotermitidae merupakan rayap tingkat rendah sedangkan rayap famili Termitidae merupakan rayap tingkat tinggi (Khrisna & Weesner 1970). Endoglukanase rayap diekspresikan pada saluran pencernaan rayap. Ekspresi endoglukanase (EG) pada rayap tingkat tinggi dan rayap tingkat rendah memiliki perbedaan. Ekspresi EG N. takasagoensis (NtEG) yang termasuk rayap tingkat tinggi terjadi di usus tengah. Sedangkan ekspresi EG pada rayap tingkat rendah berbeda pada tiap spesies. Ekspresi EG rayap tingkat rendah seperti RsEG terjadi di kelenar saliva/usus depan dan CfEG terjadi di saliva usus depan dan usus tengah (Tokuda et al. 1999).

16 N. takasagoens (Nakashima et al. 2001) R. speratus (Tokuda et al.1999) C. formosanus (Tokuda et al.1999) * 483 o 118* 187* 725o 503** 274 o 546** C. curvignathus 46 o 162* 96* 183* 125* 79 o 163 o 165** 140** 214** Gambar 6 Skema posisi ekson dan intron NtEG (AB019146), RsEG (AB008778), CfEG (AB058670), dan gen endoglukanase C. curvignathus (hasil penelitian ini). = ekson ; = intron. Angka di bawah kotak menunjukkan posisi ekson dan angka di atas segitiga menunjukkan posisi intron. Angka di dalam kotak dan segitiga menunjukkan panjang basa; tanda ( o )= Studi ini, tanda (*) = Normasari 2011; (**)= Nurgianti 8

17 9 Tabel 5 Hasil analisis homologi berdasarkan nukleotida (BLAST N) gen endo-β-1,4-glukanase rayap C. curvignathus No. Nukleotida Deskripsi Acc number 1 Ekson 1 CcEG 2 Ekson 5 CcEG 3 Ekson 6 CcEG C. formosanus endo-beta-1,4- glucanase (EG3a-1) gene, partial cds C. formosanus CfEG4 mrna for endo-b-1,4-glucanase, Persen Homologi (%) E- value HQ e -14 AB e -31 complete cds C.formosanus endo-beta-1,4- glucanase mrna, complete cds EU e Ekson 1,5, dan 6 C. formosanus CfEG4 mrna for endo-b-1,4-glucanase, complete cds AB e ATGAGGGTCTTCTTTTGCCTTCTGTCTGCGCTCGCGCTTTGCCAAGCCAAGCAGCTTTTC M R V F F C L L S A L A L C Q K Q L F GACTTCGCCAACAATTATCGCGGCAAATACAGCGATTCCATCACCGACGCGAAGAATTTC D F A N N Y R G K Y S D S I T D A K N F TATGCGTCTGGAGACTACAAGGATGAGTTAGTATGGGCAGCCGCATGGCTCTACAGGGCG Y A S G D Y K D E L V W A A A W L Y R A ACCAACGACAACGCCTATCTCACTAAAGCTGAGTCGCTGTACAACGAATTCGGCCTTGGA T N D N A Y L T K A E S L Y N E F G L G AGCTGGAATGGTGCCTTCAACTGGGATAACAAGATCTCCGGTGTACAG S W N G A F N W D N K I S G V Q Gambar 7 Asam amino putative ekson 1, 5, dan 6 gen endo-β-1,4-glukanase rayap C. curvignathus. = kodon start (ATG) dan metionin (M), Angka di baris ke-1 = jumlah nukleotida; huruf di baris ke-2 = nukleotida; huruf di baris ke-3 = asam amino putative C. curvignathus MRVFFCLLSALALCQKQLFDFANNYRGKYSDSITDAKNFYASGDYKDELVWAAAWLYRAT 60 C. formosanus R. speratus.k..v...q N. takasagoensis...l...r...r...a..r C. curvignathus NDNAYLTKAESLYNEFGLGSWNGAFNWDNKISGVQ 95 C. formosanus...t R. speratus...t...n N. takasagoensis...t..nt...d...qn.g.gl...s.v Gambar 8 Alignment Asam amino putative ekson 1, 5, dan 6 gen endo-β-1,4-glukanase rayap C. curvignathus dengan C. formosanus, R. speratus dan N takasagoensis.

18 10 Tabel 6 Hasil analisis homologi berdasarkan asam amino putative (BLAST P) ekson 1, 5 dan 6 gen endo-β-1,4-glukanase rayap C. curvignathus No. Asam amino putative Deskripsi Jumlah asam amino 1 Ekson 1 Endo-beta-1,4- glukanase C. formosanus 2 Ekson 5 Endogenous cellulase R. flavipes 3 Ekson 6 Endo-β-1.4- glukanase C. formosanus 4 Ekson 1, 5, 6 Endo-β-1.4- glukanase C. formosanus Acc number Kehomologian (%) E- value 15 ADV e AAU e BAB e BAB e -47 Tabel 7 Jarak genetik asam amino putative gen endoglukanase C. curvignathus ekson 1, 5 dan 6 dengan asama amino putative C. formosanus, R. speratus dan N. takasagoensis C. curvignathus C. formosanus C. curvignathus C. formosanus R. speratus N. takasagoensis R. speratus N. takasagoensis CcEG 156 CfEG3 156 RsEG 156 NtEG Gambar 9 Pohon filogeni Endo-β-1,4-glukanase parsial rayap C. curvignathus (CcEG terhadap asam amino putative C. formosanus (CfEG), R. speratus (RsEG), dan N. takasagoensis (NtEG) A B Gambar 10 Struktur 3 dimensi endo-β-1,4-glukanase parsial rayap C. curvignathus dari asam amino putative 5 dan 6. A = helix alpa; B = lembar beta.

19 11 SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Gen endo-β-1,4-glukanase pada rayap C. curvignathus ekson 1, 5, 6 masing masing berukuran 46, 79, dan 163 pb, dengan intron 1, 5, dan 6 secara berurutan sebesar 483, 734, dan 274 pb. Hasil sekuen ekson 5 CcEG melengkapi sekuen Normasari (2011), menyambung 26 pb. Dengan demikian ukuran panjang ekson 1, 5 dan 6 CcEG sama dengan CfEG3 yaitu, 46 pb ekson 1, 178 pb ekson 5, dan 163 pb ekson 6.. Deduksi ekson 1, 5, dan 6 CcEG menghasilkan 94 asam amino putative dengan metionin sebagai awal asam amino. Analisis homologi DNA dan asam amino putative endo-β-1,4-glukanase C. curvignathus dengan alignment, BLASTn dan BLASTp, perhitungan jarak genetik, menunjukan CcEG berkerabat dekat dengan C. formosanus. Endoglukanase C. curvignathus termasuk dalam kelompok Glycosyl Hydrolase Family 9 (GHF9) homolog 93% dengan GHF 9 C. formosanus. Struktur 3 dimensi endo-β-1,4-glukanase C. curvignathus tersusun atas helix alpa dan lembar beta Saran Perlu dilakukan penelitian aktivitas enzim glukanase C. curvignathus untuk aplikasi lebih lanjut. DAFTAR PUSTAKA Ahmad M Key to the indomalayan Termites. Biologia 4: Achmadi S S Kimia Kayu. Bogor: IPB Press. Byun SO, Fang Q, Zhou H, Hickford JGH An effective method for silverstaing DNA in large number for polyacrilamide gels. Anal Biochem 385: Griffiths et al Modern Genetic Analysis. New York: W. H. Freeman aand Company. Inis M A, Gefland PCR Protocols: Guide to Methods and Application. London: Academic Press. Inomata N, Tachida H, Yamazaki T Molecular evolution of the amy multigenes in the subgenus Sophopora of the Drosophilla. Mol Biol Evol 14: Krishna K, Weesner FM Biology of Termites. Ed ke-8. New York and London: Academic Press. Lin C et al Nested PCR-Linked capillary electrophoresis and singlestrand conformation polymorphisms for detection of macrolide-resistant Mycoplasma pneumoniae. J Clin Microbiol 48: Nakashima K, Watanabe H, Saitoh H, Tokuda G, Azuma JI Dual cellulosedigesting system of the wood-feeding termite, Coptotermes formosanus Shiraki. Insect Biochem Molec Biol 32: Normasari R Karakterisasi gen endo-β- 1,4-glukanase pada rayap Coptotermes curvignathus [tesis]. Bogor: Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Nurgianti R Karakterisasi ekson dan intron 7, 8, 9 gen endo-β-1,4-glukanase pada rayap Coptotermes curvignathus [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Raffiudin R & Crozier RH Phylogenetic analysis of honey bee behavioral evolution. Mol Phylogenet Evol 48: Sambrook J, Fritsch EF, Miniatis T Molecular Cloning : a laboratory Manual. Ed Ke-2. United State of America: Cold Spring Harbor Laboratory Press. Tamura K, Dudley J, Nei M, Kumar S MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Mol Biol Evol 24: Tokuda et al Metazoan cellulase genes from termites: intron/exon structures and sites of expression. Biochim Biophys Acta 1447:

20 LAMPIRAN

21 Lampiran 1 Kromatogram hasil sekuen gen endoglukanase C. curvignathus dengan menggunakan primer CfF1 13

22 Lampiran 2 Kromatogram hasil sekuen gen endoglukanase C. curvignathus dengan menggunakan primer CfR1 14

23 15 Lampiran 3 Alignment basa nukleotida ekson 1, 5, dan 6 CcEG dengan CfEG, NtEG, dan RsEG C. curvignathus ATGAGGGTCT TCTTTTGCCT TCTGTCTGCG CTCGCGCTTT GCCAAGCCAA 50 C. formosanus c R. speratus...a.....g...t.....a N. takasagoensis.....c...t a......g 50 C. curvignathus GCAGCTTTTC GACTTCGCCA ACAATTATCG CGGCAAATAC AGCGATTCCA 100 C. formosanus t R. speratus t...a. 100 N. takasagoensis t..c..a. 100 C. curvignathus TCACCGACGC GAAGAATTTC TATGCGTCTG GAGACTACAA GGATGAGTTA 150 C. formosanus R. speratus....c.....c...c c N. takasagoensis... C.G.....C...C. CG...G...A C. curvignathus GTATGGGCAG CCGCATGGCT CTACAGGGCG ACCAACGACA ACGCCTATCT 200 C. formosanus a R. speratus a a N. takasagoensis a.....a...c C. curvignathus CACTAAAGCT GAGTCGCTGT ACAACGAATT CGGCCTTGGA AGCTGGAATG 250 C. formosanus G......C R. speratus G..C.....A...A C....A...C. 250 N. takasagoensis..ac.cc.....a...a..tg.t......t..ccag.a...gg C. curvignathus GTGCCTTCAA CTGGGATAAC AAGATCTCCG GTGTACAG 288 C. formosanus R. speratus N. takasagoensis...g.c.t.....g...ag.g

24 16 Lampiran 4 Overlap sekuen DNA hasil penelitian ini menggunakan CfF5 dan CfR5 (CcEG 5) dengan sekuen ekson 5 CcEG (Normasari 2011) dan sekuen ekson 6 CcEG (a) CcEG_hasil 1 TGCTTACGAC TACAAGACAG TACTGAAGAA TTCGCTGCTT TTCTACGAGG 580 Exon2_NS CcEG_hasil 1 CTCAGCGATC GG Exon2_NS.....GACAATTG 600 (b) CcEG_hasil C 100 Exon5_NS GTCTACAAGA GTGTTGACTC CACTTATTCC AACAACTTGA TCACCCACG. 100 CcEG_hasil 2 CAAGCAGCTT TTTGACTTTG CTAACAATTA TAGCGGGAAA TACAGCGATT 150 Exon5_NS.....C...C..C (c) CcEG_hasil 2 catctgatgt aggtctggac ACTACAGGGA TGAGTTAGTA TGGGCAGCCG 950 CcEG_hasil CcEG_hasil 2 CATGGCTCTA CGGGGCGACA A CcEG_hasil 3....A...C.ACGACAACG CCTATCTCAC TAAAGCTGAG 1000 (d) CcEG_hasil 3 CAGGTTCTAC TGGCCAAGCT CACAAGCAAG CAGGCATACA AGGACAAGGT 460 Exon7_NG CcEG_hasil 3 TCAAG Exon7_NG A..G.GCTAC 470 Keterangan: CcEG_hasil 1= sekuen CcEG ekson 1 penelitian ini; CcEG_hasil 2 = sekuen CcEG ekson 5 penelitian ini, CcEG_hasil 3 = sekuen CcEG ekson 6 penelitian ini; Exon5_NS = sekuen CcEG Normasari (2011); Exon7_NG = sekuen CcEG Nurgianti (2012); = basa yang overlap, huruf kapital = basa nukleotida ekson, huruf kecil = basa nukleotida intron, (-) = tidak ada sekuen, (.) = sama dengan nukleotida yang dibandingkan di atasnya. (a) = Overlap sekuen 1 CcEG dengan sekuen CcEG ekson 2 Normasari (2011); (b)= Overlap hasil 2 CcEG dengan sekuen CcEG ekson 5 Normasari (2011); (c)= Overlap hasil 2 CcEG dengan sekuen ekson 6 CcEG penelitian ini (hasil 3); (d)= Overlap hasil 3 CcEG dengan sekuen CcEG ekson 7 Nurgianti (2011)

25 Lampiran 5 Analisis homologi asam amino putative 5-6 endo-β-1,4-glukanase C. curvignathus 17