HASIL DAN PEMBAHASAN. pb M 1 2. pb M 1 2. pb M 1 2. (a) (b) pb M 1 2. pb M pb M 1 2. pb M (d) (e) (c)

Transkripsi

1 HASIL DAN PEMBAHASAN Amplifikasi dan Visualisasi DNA Endo-β- 1,4- glukanase C. curvignathus Amplifikasi DNA ekson 1 dan 5 CcEG menggunakan pasangan primer eksternal (Tabel 2) dan masing-masing menunjukkan ukuran amplikon sekitar 600 dan 1000 pb (Gambar 2a dan 2c). Namun hasil PCR dengan menggunakan primer eksternal tersebut menunjukkan pita DNA yang tipis (Gambar 2a dan 2c). Pita DNA (amplikon) yang tipis menunjukkan konsentrasi DNA yang diperoleh masih rendah. Hasil PCR ekson 1 dan 5 CcEG dengan konsentrasi amplikon yang rendah tersebut, kembali diamplifikasi dengan primer internal (Tabel 2) dan masing-masing menunjukkan ukuran amplikon sekitar 600 dan 1000 pb dengan konsentrasi yang tinggi (Gambar 2b dan 2d). Peningkatan konsentrasi ini terjadi karena sumber DNA merupakan hasil PCR dari amplifikasi primer eksternal yang telah dipurifikasi. Penggunaan primer internal yang dibuat di sebelah dalam primer eksternal merupakan teknik yang disebut Nested Polymerase Chain Reaction (Nested PCR). Dengan Nested PCR, amplifikasi akan lebih spesifik pada DNA target, sehingga konsentrasi DNA meningkat (Lin et al. 2010). Amplifikasi DNA ekson 6 CcEG menggunakan pasangan primer CfF6-R6 menunjukkan ukuran amplikon sekitar pb. Namun amplikon menunjukkan variasi konsentrasi DNA (Gambar 2e). Hasil amplifikasi dengan peningkatan konsentrasi Mg mm menjadi 2.0 mm sampel yang sama (Cc 46 LSI), pada nomer 1 dan 2 menghasilkan konsentrsai DNA yang tinggi dibanding nomer 3 dan 4 (Gambar 2e) yang tanpa peningkatan konsentrasi Mg 2+. Hal ini terjadi karena peningkatan konsentrasi Mg 2+ mampu mengoptimasi amplifikasi karena pengaruhnya dalam penempelan primer (Innis & Gefland 1990). Hasil sekuen ekson-intron 1, 5, dan 6 CcEG yang diperoleh berupa kromatrogram basa nukleotida (Lampiran 1 dan 2) (a) (b) (c) (d) (e) Gambar 2 Pita DNA hasil amplifikasi gen endoglukanase C. curvignathus pada gel poliakrilamid dengan menggunakan (a) pasangan primer CfF1-R1a; (b) pasangan primer CfF1-R1; (c) pasangan primer CfF5a dan CcR5; (d) pasangan primer CfF5a-R5; (e) pasangan primer CfF6 dan CfR6. M = penanda 100 pb DNA ladder (Promega). = amplikon yang diperoleh.

2 5 Sekuen Ekson-Intron Gen Endo-β-1,4- glukanase C. curvignathus Hasil sekuen ekson-intron 1, 5, dan 6 gen endo-β-1,4-glukanase C. curvignathus diedit dan di-alignment dengan sekuen CfEG3, RsEG, dan NtEG (Tabel 3). Ukuran gen endo-β-1,4-glukanase C. curvignathus yang diperoleh menggunakan pasangan primer CfF1a-R1 (Gambar 3a), CfF5-R5 (Gambar 3b), dan CfF6-R6 (Gambar 3c) yaitu masing-masing sebesar 594 (Gambar 4a, Tabel 4), 872 (Gambar 4b Tabel 4), dan 465 pb (Gambar 4c, Tabel 4). Total sekuen DNA CcEG yang didapat adalah 1931 pb. Hasil sekuen ekson 5 CcEG yang diperoleh penelitian ini melengkapi sekuen ekson 5 CcEG penelitian Normasari (2011) dan melengkapi sekuen ekson 6 (Tabel 4 Lampiran 4). Komposisi GC sekuen ekson CcEG sebesar 51.4% sedangkan sekuen intron sebesar 42.3%. Berdasarkan Alignment nukleotida juga diketahui Intron 1, 5, dan 6 CcEG diawali dengan basa GT (pada ujung 5 -intron) dan diakhiri dengan basa AG (pada ujung 3 -intron). Hasil ini seperti intron gen amy dari Drosophila (Inomata et al. 1997) dan intron 2 dan 4 CcEG (Normasari 2011). CfF1 >>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>> ATGAGGGTCTTCTTTTGCCTTCTGTCTGCGCTCGCGCTTTGCCAAGGTAACCAGTTCACCACTACACTTGG GTTAGAGTTCACTGTGGTAATTTCACACTATTCCCAACAGGATCACACACCTACAGCTATACTCACGAATA ACGCAAGTTCACCTAGTTATACGGATCAGAACCATAAGCTTACATTACCGTAACAGGTTGCTGCAAACTGT ACGATCTCCAAAGCCGCATACATTGTCTCTCTCGCTCTCTCTCTCTCTCACACACGCGCGCACGCACAGAA TAGAACAAAACCAACATCAATGGATACCATAGACAGGGATATAAATGCACCGGTTTATGACACAACGCCCG GATCGCGCTTCATGTTCGAAAATGCTGCAATTCCAAACTGAACACACACGGTAACTTGGCTCAATGGAAAT GTTATCCATTGTCGTTTCATGTCCTACACTTCATCATAAAGACACTCTCCGATGCATATTCCTACAAGGGG GAGACGTTCCCATAATGTGCCCTGTGTTACAGCTGCTTACGACTACAAGACAGTACTGAAGAATTCGCTGC TTTTCTACGAGGCTCAGCGATCGG <<<<<<<<<<<<<<<<<<<< CfR1 (a) CfF5a >>>>>>>>>>>>>>>>>>> CCAAGCAGCTTTTCGACTTCGCCAACAATTATCGCGGCAAATACAGCGATTCCATCACCGACGCGAAGAAT TTCTATGCGTAAGTGTACTACACTACCCACTCAATTTGCWATACGTACAGCGCTCTTACRCACGYCGSGCT GTCACMACTACCTAAACTYGGCGTTTAGAACTGCWTGAKGCTYGTACATTACACACACCTCCTTTGTGCGC AGGATCCTACRAATTACCACTCGGCCCAGCTGCCKGTCAATTACTCAGTCAGGCACATTCACATATYTAAA GGATACATATAAACACGTTGCAGTGATTACRGGGAAGTTTTACCCTGTTCCGTACGACTACGCTCTATCAT AATAAAAAAACATTAATTTHATCTTCACGTTTAADGTAATATCTTCCACGGGADGTATCACAGKGTGAAGG ATATCGCARACTTCTGCCGCAACATATGTYTACKGCATGACGTTACGTTTCATTCTTTCCACTGAAAACAA CTGTCATATAATGCACATCGCCCCTTTATTAGCCTCTCTTTAACGAATTTTGTGCAAAAGATTCAAATCTA CACAGTTATTCGTCCAGAACTGTGAGACATTTTTCTTCATTATGTGTTCCTGCAATGCCACACTCTGTACT CTGCTACAAATATATTCACACAGAGGAGCAGACTACCGCCTGCATACTCAGTACTATGTTCCTAGCACGAT AAATCTGATACGCTGAATGGCATCACAACGTCAAAATCTCCATATTCACCACCGTCACAAACACAAATCAA CCATTTCTAATCATCTGATGTAGGTCTGGAGACTACAAGGATGAGTTAGTATGGGCAGCCGCATGGCTCTA CAGGGCGACCA >>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>> <<<<<<<<< CfF6 CfR5 (b) CfF6 CfR5 >>>>>> <<<<<<<<<<<<<<<<<<<< AGTATGGGCAGCCGCATGGCTCTACAGGGCGACCAACGACAACGCCTATCTCACTAAAGCTGAGTCGCTGT CcR5 ACAACGAATTCGGCCTTGGAAGCTGGAATGGTGCCTTCAACTGGGATAACAAGATCTCCGGTGTACAGGTC <<<<<<<<<<<<<<<<<<< AGACACGTGAAGAAATTCATGCTTACAAAAGTCACGGACAAAACAACAAAGCTACAGATATTAATACATAC CACAAGCCACACAATCACTGTGTCAGTTTCAGTCACTAGCTGAGTGATAGTTCTTCAGCCATGGAAGTGTA GGCGTCATACAGTAATAATCATTCACAAAAGAAAACTGAAAATCCTGGACAATATAGGTGCCGAAACAGCA ATAGGCACCATGTTCCTAAACGTTTCGCCCTCTATCATATTTACTTGAACTTCCACAGGTTCTACTGGCCA AGCTCACAAGCAAGCAGGCATACAAGGACAAGGTACAGG <<<<<<<<<<<<<<<<<<<<< CfR6 (c) Gambar 3 Contig gen endoglukanase C. curvignathus dengan menggunakan pasangan primer (a) CfF1-R1, (b)cff5a-r5 dan (c) CfF6-R6. Huruf kapital = urutan basa ekson basa yang digaris bawah= primer. Basa nukleotida ambigu; D= A/G/T; H= A/C/T; K= G /T; M= A/C; R= A/G; S= C/G; W= A/T; Y= C/T

3 6 ATGAGGGTCT TCTTTTGCCT TCTGTCTGCG CTCGCGCTTT GCCAAGgtaa 50 ccagttcacc actacacttg ggttagagtt cactgtggta atttcacact 100 attcccaaca ggatcacaca cctacagcta tactcacgaa taacgcaagt 150 tcacctagtt atacggatca gaaccataag cttacattac cgtaacaggt 200 tgctgcaaac tgtacgatct ccaaagccgc atacattgtc tctctcgctc 250 tctctctctc tcacacacgc gcgcacgcac agaatagaac aaaaccaaca 300 tcaatggata ccatagacag ggatataaat gcaccggttt atgacacaac 350 gcccggatcg cgcttcatgt tcgaaaatgc tgcaattcca aactgaacac 400 acacggtaac ttggctcaat ggaaatgtta tccattgtcg tttcatgtcc 450 tacacttcat cataaagaca ctctccgatg catattccta caagggggag acgttcccat aatgtgccct gtgttacagc TGCTTACGAC TACAAGACAG 550 TACTGAAGAA TTCGCTGCTT TTCTACGAGG CTCAGCGATC GG 592 (a) Ekson 1 Intron 1 Ekson 2 CCAAGCAGCT TTTCGACTTC GCCAACAATT ATCGCGGCAA ATACAGCGAT 50 TCCATCACCG ACGCGAAGAA TTTCTATGCg taagtgtact acactaccca 100 Ekson 5 ctcaatttgc watacgtaca gcgctcttac rcacgycgsg ctgtcacmac 150 tacctaaact yggcgtttag aactgcwtga kgctygtaca ttacacacac 200 ctcctttgtg cgcaggatcc tacraattac cactcggccc agctgcckgt 250 caattactca gtcaggcaca ttcacataty taaaggatac atataaacac 300 gttgcagtga ttacrgggaa gttttaccct gttccgtacg actacgctct 350 atcataataa aaaaacatta attthatctt cacgtttaad gtaatatctt 400 ccacgggadg tatcacagkg tgaaggatat cgcaracttc tgccgcaaca 450 tatgtytack gcatgacgtt acgtttcatt ctttccactg aaaacaactg Intron 5 tcatataatg cacatcgccc ctttattagc ctctctttaa cgaattttgt 550 gcaaaagatt caaatctaca cagttattcg tccagaactg tgagacattt 600 ttcttcatta tgtgttcctg caatgccaca ctctgtactc tgctacaaat 650 atattcacac agaggagcag actaccgcct gcatactcag tactatgttc 700 ctagcacgat aaatctgata cgctgaatgg catcacaacg tcaaaatctc 750 catattcacc accgtcacaa acacaaatca accatttcta atcatctgat 800 gtaggtctgg AGACTACAAG GATGAGTTAG TATGGGCAGC CGCATGGCTC 850 TACAGGGCGA CCAACGACAA CGCCTATCTC ACTAAAGCTG AGTCGCTGTA 900 CAACGAATTC GGCCTTGGAA GCTGGAATGG TGCCTTCAAC TGGGATAACA 950 Ekson 6 AGATCTCCGG TGTACAGgtc agacacgtga agaaattcat gcttacaaaa 1000 gtcacggaca aaacaacaaa gctacagata ttaatacata ccacaagcca 1050 cacaatcact gtgtcagttt cagtcactag ctgagtgata gttcttcagc 1100 catggaagtg taggcgtcat acagtaataa tcattcacaa aagaaaactg 1150 Intron 6 aaaatcctgg acaatatagg tgccgaaaca gcaataggca ccatgttcct 1200 aaacgtttcg ccctctatca tatttacttg aacttccaca ggttctactg 1250 GCCAAGCTCA CAAGCAAGCA GGCATACAAG GACAAGGTAC AGG 1293 Ekson 7 (b) Gambar 4 Sekuen ekson-intron 1 (a), 5 dan 6 (b) gen endoglukanase C. curvignathus. Huruf kapital = urutan basa ekson; huruf kecil = urutan basa intron; basa dengan latar kuning = awal dan akhir intron; basa yang dengan garis bawah = overlap antar contig. Basa nukleotida ambigu; Basa nukleotida ambigu; D= A/G/T; H= A/C/T; K= G /T; M= A/C; R= A/G; S= C/G; W= A/T; Y= C/T Tabel 4 Panjang sekuen ekson-intron 1, 5, dan 6 endo-β-1,4-glikanase C. curvignathus No. Sekuen ekson Primer yang digunakan Total sekuen Panjang ekson Panjan g intron Informasi tambahan (pb) (pb) (pb) 1 1 CfF1-R1 (primer internal) Overlap 61 pb intron 2* 2 5 CfF5a-R5(primer internal) Overlap 26 pb ekson 5** dan 35 pb ekson 6*** 3 6 CfF6-R6 (primer Overlap 52 pb eksternal) ekson 7**** *) Overlap sekuen 1 CcEG dengan sekuen CcEG ekson 2 Normasari (2011); ** Overlap hasil 2 CcEG dengan CcEG ekson 5 Normasari (2011); *** Overlap hasil 2 CcEG dengan sekuen hasil ekson 6 CcEG penelitian ini, **** Overlap hasil 3 CcEG dengan sekuen CcEG ekson 7 Nurgianti (2011) (Lampiran 4)

4 7 Analisis Homologi Nukleotida dengan BLASTN Gen Endo-β-1,4- glukanase Rayap C. curvignathus Hasil alignment gen endo-β-1,4-glukanase parsial C. curvignathus (CcEG) dengan C. formosanus (CfEG3), R. speratus (RsEG), dan N. takasagoensis (NtEG) menunjukkan posisi ekson 1, 5, dan 6 CcEG berada pada ekson 1, 5, dan 6 CfEG dan RsEG, sedangkan pada NtEG berada pada ekson 2, 6, dan 7. Ukuran panjang ekson 5, 6 CcEG sama dengan ekson 5, 6 CfEG3 dan RsEG serta ekson 6 dan 7 NtEG (Gambar 5). Panjang Ekson 1 CcEG sama dengan panjang CfEG, namun berbeda dengan ekson 1 RsEG dan ekson 2 NtEG (Gambar 5). Hasil alignment ekson 1, 5, dan 6 CcEG dengan CfEG, NtEG, dan RsEG menunjukkan perbedaan basa paling sedikit dengan CfEG dibandingkan dengan NtEG dan RsEG (Lampiran 3). Hasil analisis homologi nukleotida dengan BLASTN ekson 1, ekson 5 dan ekson 6 gen endoglukanase parsial C. curvignathus homolog dengan CfEG (Tabel 5). Sekuen ekson 1,5, dan 6 CcEG secara keseluruhan menghasilkan persen homolog 98% dengan C. formosanus (Tabel 5). Kedua rayap ini memiliki genus yang sama yaitu Coptotermes (Ahmad 1958). Analisis Homologi asam amino dengan BLASTP, Jarak Genetik dan Struktur protein Endo-β-1,4-glukanase Parsial Rayap C. curvignathus Hasil deduksi sekuen ekson 1, 5, dan 6 rayap C. curvignathus gen endo-β-1,4- glukanase parsial menghasilkan sebanyak 95 asam amino putative dengan asam amino pertama adalah metionin (Gambar 6). Metionin merupakan asam amino hasil dari translasi kodon start (kodon penginisiasi awal) berupa basa ATG di utas DNA atau AUG di RNA (Griffiths et al. 1999). Hasil analisis homologi asam amino putative ekson 1, 5, dan 6 endoglukanase parsial C. curvignathus melalui BLASTp homolog 94% dengan asam amino putative C. formosanus (Tabel 6). Hasil alignment asam amino ekson 1, 5, dan 6 CcEG dengan CfEG3, RsEG, dan NtEG memperlihatkan bahwa asam amino putative CcEG memilki perbedaan yang paling sedikit dengan CfEG dibanding dengan RsEG dan NtEG, yaitu 1 asam amino berbeda (Gambar 7). Perhitungan jarak genetik dan pembuatan pohon filogeni berdasarkan asam amino putative gen endo-β-1,4-glukanase parsial C. curvignathus ekson 1, 5 dan 6 menunjukan CcEG lebih dekat dengan asam amino putative gen endoglukanase C. formosanus jika dibandingkan dengan asam amino putative gen endoglukanase N. takasagoensis dan R. speratus dilihat dari nilai jarak terkecil yaitu sebesar 0,011 (Tabel 7 dan Gambar 8). Nilai jarak genetik yang terjauh dari asam amino putative gen endo-β-1,4-glukanse parsial C. curvignathus adalah asam amino putative dari N. takasagoensis yaitu sebesar (Tabel 7). Hal ini menunjukkan bahwa C. curvignathus lebih dekat kekerabatannya dengan C. formosanus dibandingkan dengan N. takasagoensis. Rayap C. curvignathus dan C. formosanus termasuk ke dalam famili Rhinotermitidae sedangkan N. takasagoensis termasuk ke dalam famili yang berbeda yaitu Termitideae (Ahmad 1958). Struktur tiga dimensi endoglukanase parsial dibuat dengan program Cn3D. Struktur 3 dimensi yang terbentuk terdiri dari helix alpa dan lembar beta (Gambar 9). Analisis asam amino putative dengan BLASTp juga menunjukkan asam amino putative CcEG termasuk dalam kelompok Glycosyl Hydrolase Family 9 (GHF9) karena homolog 99% dengan GHF 9 C. formosanus (Lampiran 5). Hal ini memperlihatkan kemiripan tingkat asam amino putative dari CcEG terhadap NtEG, CfEG dan RsEG yang juga termasuk dalam GHF 9 (Tokuda et al. 1999, Nakashima et al. 2001) Rayap C. curvignathus berkerabat dekat dengan C. formosanus, R. speratus karena berasal dari famili yang sama yaitu Rhinotermitidae dibandingkan dengan N. takasagoensis yang bersal dari famili Termitideae. Namun C. curvignathus lebih dekat dengan C. formosanus dibandingkan dengan R. speratus karena berasal dari genus yang sama, yaitu Coptotermes (Ahmad 1958). Rayap famili Rhinotermitidae merupakan rayap tingkat rendah sedangkan rayap famili Termitidae merupakan rayap tingkat tinggi (Khrisna & Weesner 1970). Endoglukanase rayap diekspresikan pada saluran pencernaan rayap. Ekspresi endoglukanase (EG) pada rayap tingkat tinggi dan rayap tingkat rendah memiliki perbedaan. Ekspresi EG N. takasagoensis (NtEG) yang termasuk rayap tingkat tinggi terjadi di usus tengah. Sedangkan ekspresi EG pada rayap tingkat rendah berbeda pada tiap spesies. Ekspresi EG rayap tingkat rendah seperti RsEG terjadi di kelenar saliva/usus depan dan CfEG terjadi di saliva usus depan dan usus tengah (Tokuda et al. 1999).

5 N. takasagoens (Nakashima et al. 2001) R. speratus (Tokuda et al.1999) C. formosanus (Tokuda et al.1999) * 483 o 118* 187* 725o 503** 274 o 546** C. curvignathus 46 o 162* 96* 183* 125* 79 o 163 o 165** 140** 214** Gambar 6 Skema posisi ekson dan intron NtEG (AB019146), RsEG (AB008778), CfEG (AB058670), dan gen endoglukanase C. curvignathus (hasil penelitian ini). = ekson ; = intron. Angka di bawah kotak menunjukkan posisi ekson dan angka di atas segitiga menunjukkan posisi intron. Angka di dalam kotak dan segitiga menunjukkan panjang basa; tanda ( o )= Studi ini, tanda (*) = Normasari 2011; (**)= Nurgianti 8

6 9 Tabel 5 Hasil analisis homologi berdasarkan nukleotida (BLAST N) gen endo-β-1,4-glukanase rayap C. curvignathus No. Nukleotida Deskripsi Acc number 1 Ekson 1 CcEG 2 Ekson 5 CcEG 3 Ekson 6 CcEG C. formosanus endo-beta-1,4- glucanase (EG3a-1) gene, partial cds C. formosanus CfEG4 mrna for endo-b-1,4-glucanase, Persen Homologi (%) E- value HQ e -14 AB e -31 complete cds C.formosanus endo-beta-1,4- glucanase mrna, complete cds EU e Ekson 1,5, dan 6 C. formosanus CfEG4 mrna for endo-b-1,4-glucanase, complete cds AB e ATGAGGGTCTTCTTTTGCCTTCTGTCTGCGCTCGCGCTTTGCCAAGCCAAGCAGCTTTTC M R V F F C L L S A L A L C Q K Q L F GACTTCGCCAACAATTATCGCGGCAAATACAGCGATTCCATCACCGACGCGAAGAATTTC D F A N N Y R G K Y S D S I T D A K N F TATGCGTCTGGAGACTACAAGGATGAGTTAGTATGGGCAGCCGCATGGCTCTACAGGGCG Y A S G D Y K D E L V W A A A W L Y R A ACCAACGACAACGCCTATCTCACTAAAGCTGAGTCGCTGTACAACGAATTCGGCCTTGGA T N D N A Y L T K A E S L Y N E F G L G AGCTGGAATGGTGCCTTCAACTGGGATAACAAGATCTCCGGTGTACAG S W N G A F N W D N K I S G V Q Gambar 7 Asam amino putative ekson 1, 5, dan 6 gen endo-β-1,4-glukanase rayap C. curvignathus. = kodon start (ATG) dan metionin (M), Angka di baris ke-1 = jumlah nukleotida; huruf di baris ke-2 = nukleotida; huruf di baris ke-3 = asam amino putative C. curvignathus MRVFFCLLSALALCQKQLFDFANNYRGKYSDSITDAKNFYASGDYKDELVWAAAWLYRAT 60 C. formosanus R. speratus.k..v...q N. takasagoensis...l...r...r...a..r C. curvignathus NDNAYLTKAESLYNEFGLGSWNGAFNWDNKISGVQ 95 C. formosanus...t R. speratus...t...n N. takasagoensis...t..nt...d...qn.g.gl...s.v Gambar 8 Alignment Asam amino putative ekson 1, 5, dan 6 gen endo-β-1,4-glukanase rayap C. curvignathus dengan C. formosanus, R. speratus dan N takasagoensis.

7 10 Tabel 6 Hasil analisis homologi berdasarkan asam amino putative (BLAST P) ekson 1, 5 dan 6 gen endo-β-1,4-glukanase rayap C. curvignathus No. Asam amino putative Deskripsi Jumlah asam amino 1 Ekson 1 Endo-beta-1,4- glukanase C. formosanus 2 Ekson 5 Endogenous cellulase R. flavipes 3 Ekson 6 Endo-β-1.4- glukanase C. formosanus 4 Ekson 1, 5, 6 Endo-β-1.4- glukanase C. formosanus Acc number Kehomologian (%) E- value 15 ADV e AAU e BAB e BAB e -47 Tabel 7 Jarak genetik asam amino putative gen endoglukanase C. curvignathus ekson 1, 5 dan 6 dengan asama amino putative C. formosanus, R. speratus dan N. takasagoensis C. curvignathus C. formosanus C. curvignathus C. formosanus R. speratus N. takasagoensis R. speratus N. takasagoensis CcEG 156 CfEG3 156 RsEG 156 NtEG Gambar 9 Pohon filogeni Endo-β-1,4-glukanase parsial rayap C. curvignathus (CcEG terhadap asam amino putative C. formosanus (CfEG), R. speratus (RsEG), dan N. takasagoensis (NtEG) A B Gambar 10 Struktur 3 dimensi endo-β-1,4-glukanase parsial rayap C. curvignathus dari asam amino putative 5 dan 6. A = helix alpa; B = lembar beta.