Wereng batang coklat (WBC)

Transkripsi

1

2 Wereng batang coklat (WBC) Penusuk pengisap batang padi (& rumput Leersia hexandra) Menularkan 2 penyakit oleh virus Dimorfisme sayap Kromosom diploid=30 (28 autosom, XY dan XX) Ukuran genom: 1,2 Gbp Grassy stunt Gejala hopperburn Ragged stunt Imago makroptera Imago brakiptera

3 Wereng batang coklat Pengendalian paling praktis adalah dengan penanaman varietas tahan Adaptasi tinggi untuk makan dan bereproduksi pada varietas tahan Pengelompokan biotipe 1, 2, dan 3 berdasarkan spektrum virulensi pada varietas differensial (IRRI)

4 Varietas Gen ketahanan Biotipe TN1, Pelita I/1 Tidak ada R R R R Mudgo, IR26 Bph1 T R T R ASD7, IR42 bph2 T T R R Rathu Heenati, IR72, IR74 Bph3 T T T T Babawee Bph4 T T T T ARC10550 Bph5 R R R T Swarnalata Bph6 R R R T T12 bph7 R R R T Chin Saba Bph8 T T T Balamawee Bph9 R R R R O. latifolia Bph12 T O. australiensis Bph18 T T T T O. officinalis Bph6+Bph13 T T T T O. minuta Bph20+Bph21 T T= tahan; R= rentan Sumber: Heong & Hardy (2009)

5 Wereng batang coklat Biotipe (1, 2, 3): perbedaan morfologi dan kimiawi sangat kecil antar biotipe; tidak ada penghalang guntuk kawin antar biotipe virulensi dikendalikan secara poligenik

6 Studi keragaman genetik WBC berdasarkan marka molekuler RAPD studi keragaman WBC padi & L. hexandra DNA mitokondria studi migrasi WBC di Cina SSR belum pernah dilakukan

7 Marka SSR Teknik pengembangannya Genomic SSR (g SSR) skrining sejumlah klon dari pustaka genom dengan probe berulang EST SSR (e SSR) in silico dari database sekuen genom Polimorfisme Lebih tinggi Lebih rendah, karena berkorespondensi dengan coding region, sehingga cocok untuk comparative mapping Transferability antar Lebih rendah Lebih tinggi spesies/genus Asosiasi dengan gen Erat, dapat menjadi marka gen

8 Tujuan penelitian Mengidentifikasi e SSR dari database sekuen EST Menggunakan e SSR utk analisis keragaman genetik biotipe WBC Mempelajari transferability e SSR pada N. muri asal L. hexandra

9 Populasi WBC WBC dipelihara di insectary Biotipe 1 var. TN1 (tanpa gen ketahanan) Biotipe 2 var. Mudgo (Bph1) Biotipe 3 var. ASD7 (bph2) Biotipe Y berasal dari biotipe 1 yang dipelihara selama 2 tahun (33 generasi) pada var. YHY15 (gen tahan Bph15) N. muri dikoleksi dari lapangan dan dipelihara pada L. hexandra

10 Eksplorasi dan pengembangan marka essr Downloading > sekuen EST WBC SSR discovery program SSRIT Parameter: Panjang min. 10 bp Unit pengulangan 2-6 bp Hasil pencarian SSR Total EST yang diperiksa: 12,303 Total EST mengandung SSR: 1519 (12,4%) Total SSR teridentifikasi: 1969 Total panjang EST yang diskrining: 7689,38 kb Kepadatan SSR: 1 per 3,91 kb Skrining SSR SSR dg pjg min. 12 bp: 502 dalam 482 klaster EST Disain primer SSR program Primer Tinggi dibandingkan dg tanaman & sp. hewan lainnya Pada aphid 1 SSR pd 3,0 kb Tipe pengulangan tri-nucleotida paling banyak (1327 [67,4%]) Parameter: - Panjang primer basa (opt. 20) - Min. panjang pengulangan SSR=12 bp - Produk PCR bp - Ta opt. 55 o C - Kandungan GC 35-65% (opt. 50%)

11 Frekuensi & distribusi SSR dalam EST WBC Motif AT > CG Motif AAT, AAG > CCG Pada hewan lain motif AG dan AAT juga dominan

12 Ekstraksi DNA dan genotyping WBC Ekstraksi DNA secara individual (bufer CTAB) 120 (23,9%) Tidak ada amplikon Skrining 502 primer e-ssr 351 (70%) Pita jelas DNA pool dari 4 biotipe WBC, DNA pool dari N. muiri 31 (6,2%) Amplifikasi lemah 324 (92,3%) dapat mengamplifikasi DNA N.muiri, 100 primer menghasilkan ukuran pita yg sama dg yg ada pd N. lugens sekuen transcribed terkonservasi 155 (30,9%) polimorfik pada 4 biotipe WBC 61 primer dipilih 196 (39%) monomorfik Dibandingkan dengan database non-redundant protein dari NCBI N=21 per biotipe (16, 5 ) Genotyping WBC gel sekuensing poliakrilamid 6% 109 klaster EST (31,1%) match dengan gen yang fungsinya diketahui

13 Analisis data Skor biner (1=ada pita DNA, 0=tdk ada pita DNA) Jaccard s similarity coefficient (NTSYS 2.1) Analisis klaster UPGMA - dendrogram (NTSYS 2.1) Struktur populasi - AMOVA (Arlequin) na, H e, H o, PIC (PowerMarker) Uji korelasi (r) antara kesamaan genetik dengan matriks Mantel test PCoA (GenAlEX 6.3) AMOVA=analysis of molecular variance na=jumlah alel H e =expected heterozygosity H o =observed heterozygosity PIC=polymorphic information content PCoA=principle coordinate analysis UPGMA=unweighted pair group method averaging

14 Polimorfisme 351 marka e SSR pada 4 biotipe WBC Tingkat polimorfisme serupa antar biotipe (~30%)

15 Keragaan genetik WBC Biotipe WBC (var, gen tahan) Jumlah alel Expected heterozygosity Rata rata (dan kisaran) Observed heterozygosity Rata rata PIC 1 (TN1, tidak ada) 2,3 (1 5) 0,35 0,43 0,30 (0 0,681) 2 (Mudgo, Bph1) 3,5 (2 9) 0,51 0,53 0,45 (0,086 0,756) 3 (ASD7, bph2) 2,8 (1 7) 0,42 0,44 0,37 (0 0,728) Y (YHY15, Bph15) 4,5(2 9) 0,57 0,52 0,52(0,130 0,827) 0 Keragaan genetik WBC lebih tinggi pada populasi yang dipelihara pada varietas tahan (lihat jumlah alel dan heterosigositas) Keragaan biotipe Y paling tinggi, biotipe 1 paling rendah Konsisten dengan tingkat ketahanan varietas padi (ketahanan var. YHY15 (Bph15) > Mudgo (Bph1) > ASD7 (bph2) > TN1 (tidak ada gen tahan) PIC mengukur variasi alelik dari marka. Nilai PIC pada biotipe 1 & 3 lebih rendah karena ada 10 marka monomorfik (biotipe 1) & 7 (biotipe 3)

16 Hubungan kekerabatan antar biotipe WBC Biotipe 1 (tingkat kemiripan antar individu (57%) > biotipe lain) Biotipe 3 Biotipe 2 Biotipe Y Mantel test r = 0,94 (good fit)

17 Principal coordinate analysis (PCoA) PCoA melihat lebih jauh perbedaan genetik antar genotipe : Aksis 1: biotipe 1 terpisah jauh dari biotipe yang lain (32,5% dari total variasi genetik) Aksis 2: biotipe Y terpisah dari biotipe (21,9% dari total variasi genetik) Varietas tahan (ASD7, Mudgo, YHY15) Biotipe 2 Biotipe Y Biotipe 3 Varietas rentan (TN1) Biotipe 1

18 Analysis of Molecular Variance (AMOVA) AMOVA untuk mendeteksi struktur genetik populasi Keragaan genetik antar individu dalam populasi (biotipe) tinggi (74,5% dari total ragam) artinya ada variasi virulensi yang tinggi dalam satu biotipe, sehingga ada potensi dalam satu populasi biotipe untuk mengatasi mekanisme ketahanan padi yang akan dihadapi di lapangan

19 Penutup Anggapan konvensional bahwa bottleneck populasi dapat menyebabkan kehilangan variasi genetik secara masif tidak berlaku utk WBC Biotipe Y mempunyai keragaan genetik lebih tinggi daripada biotipe asalnya (biotipe 1) setelah dipaksa makan pada var. tahan selama 33 generasi (>2 tahun) Ketahanan varietas padi mengerahkan tekanan pada populasi WBC awal sehingga timbul individu individu dengan alel beragam yang dapat beradaptasi pada varietas spesifik Perlu studi lanjut mengenai asal muasal dan evolusi populasi virulen