HASIL DAN PEMBAHASAN

Transkripsi

1 28 HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Sampel udang vaname (L.vannamei) diperoleh dari tambak udang di kabupaten Pesawaran (Lampung Selatan). Sampel udang vaname diambil dari petak tambak yang sama, dengan status klinis yang berbeda. Sampel berukuran gram/ekor dengan gejala klinis dan sub klinis infeksi myonecrosis (Gambar 13). Udang dengan gejala klinis terinfeksi myonecrosis ditandai dengan hilangnya transparansi jaringan otot udang menjadi berwana keputihan (nekrosis), khususnya pada ruas abdominal ke-6, gerakan lemah, kecenderungan berenang di tepi tambak. Udang vaname sub klinis tidak menunjukkan gejala infeksi myonecrosis dengan transparasi jaringan otot terlihat jelas, respon terhadap pakan masih baik dan gerakan udang yang terlihat aktif. Gambar 13 Udang vaname (L.vannamei). (a) Udang vaname kondisi normal; (b) Nekrosis pada ruas abdominal ke-6 (gejala klinis infeksi myonecrosis) Deteksi fragmen gen ORF1 IMNV Hasil pengujian sampel udang vaname dari Situbondo dengan nested RT- PCR (OIE, 2010) menunjukkan beberapa sampel udang vaname tersebut positif IMNV. Selanjutnya sampel udang positif IMNV digunakan sebagai salinan dalam seleksi fragmen gen ORF1 IMNV. Produk PCR yang dihasilkan pada first step RT-PCR dengan primer 4587F-4914R adalah 328 bp, dan produk PCR dengan primer nested PCR IMNV 4725F-4863R adalah sebesar 139 bp (Gambar 14). Ekstrak RNA positif IMNV berdasar pengujian dengan nested RT-PCR IMNV (OIE, 2010) digunakan dalam seleksi fragmen gen ORF1 IMNV. Produk PCR hasil amplifikasi dengan kedua pasang primer fragmen gen ORF1 tersebut digunakan untuk keperluan sekuensing dan kloning. Seleksi fragmen dimulai dengan merubah RNA sampel udang positif IMNV menjadi cdna melalui reaksi transkripsi balik (reverse transcription) menggunakan kit Impron-II RT System (Promega TM ). Menggunakan primer tunggal 218F sebagai primer spesifik IMNV, cdna hasil transkripsi balik RNA positif IMNV digunakan sebagai tuntuk mengamplifikasi fragmen gen ORF1 IMNV. Amplifikasi untuk deteksi fragmen gen ORF1 IMNV pada urutan basa nukleotida menggunakan dua pasang primer kombinasi 218F-545R yang menghasilkan produk PCR 327 bp, dan primer 412F-682R yang menghasilkan produk PCR 270 bp (Andrade et al., 2007).

2 29 Gambar 14 Gel elektroforesis nested RT-PCR IMNV (OIE,2010). (A) first step RT-PCR IMNV: M(marker 100 bp), line1-4 (328 bp); (B)nested PCR IMNV: M(marker 100bp) line 1-4 (139 bp) Produk PCR fragmen IMNV sebesar 327 bp dan 270 bp (Gambar 15), yang dihasilkan dari kombinasi kedua primer tersebut selanjutnya dipurifikasi menggunakan purifikasi ethanol absolut, dan diukur konsentrasinya dengan GenQuant spectrofotometer. Pengukuran konsentrasi DNA ini bertujuan untuk menentukan rasio antara sisipan (insert) dan vektor plasmid pada saat pembuatan plasmid DNA rekombinan IMNV (pimnv). Hasil pengukuran konsentrasi purifikasi DNA adalah 125,3 ng/µl, konsentrasi produk PCR ini cukup tinggi dan mencukupi sebagai insert ligasi. Rasio antara vektor dan insert dalam kloning ini adalah 1:5 dengan konsentrasi vektor 50 ng/µl, panjang insert 327 bp, dan panjang vektor 3851 bp maka hanya diperlukan sekitar 21,22 ng/µl. Gambar 15 Gel elektroforesis produk PCR fragmen gen ORF1 IMNV urutan nukleotida M (marker 100 bp), line 2-3 (327 bp), line 4-5 (270 bp) Sekuensing fragmen gen ORF1 IMNV isolat lapang Situbondo dan Lampung bertujuan untuk melihat kemiripan dari kedua isolat tersebut. Hasil sekuensing diharapkan dapat memberikan informasi seberapa banyak perubahan basa fragmen gen ORF1 IMNV isolat Lampung dan Situbondo dengan IMNV GenBank accesion no.ef dan acc. no.ay Perubahan basa pada nukleotida dapat mempengaruhi ketepatan primer dalam mengamplifikasi gen target. Fragmen fragmen gen ORF1 IMNV sepanjang 327 bp dan 270 bp adalah produk PCR yang menjadi kandidat kontrol positif. Berada pada urutan nukleotida fragmen gen ORF1 IMNV, produk PCR ini akan digunakan sebagai gen

3 30 sisipan pada pembuatan kontrol positif IMNV untuk real time RT-PCR IMNV TaqMan probe dan qrt-pcr IMNV SYBR green (Andrade et al., 2007; de Silva et al., 2011). Sekuensing isolat lapang Situbondo dan Lampung Hasil sekuensing fragmen gen ORF1 IMNV isolat Situbondo dan isolat Lampung dianalisa menggunakan software BioEdit (fasta file). Analisa sekuensing produk PCR 327 bp dan 270 bp fragmen gen ORF1 IMNV digabungkan membentuk panjang sekuen 460 bp. Hasil pensejajaran (pairwaise allingment) antara isolat Situbondo dan isolat Lampung dengan sekuen genom IMNV isolat Indonesia dan Brazil disajikan pada Gambar 14. Gambar 16 Multiple Pairwaise alignment fragmen gen ORF1 IMNV isolat lapang Situbondo dan Lampung dengan IMNV Genbank acc.no.ef dan acc. no.ay Primer 218F-682R ( ); primer 412F-545R ( ); primer probe ( )

4 Analisa hasil sekuensing pada produk PCR 327 bp dan 270 menggunakan menunjukkan bahwa sekuen fragmen gen ORF1 IMNV isolat lapang dari Situbondo dan Lampung 99% sama dengan genom Penaeid shrimp infectious myonecrosis virus (IMNV) isolat Indonesia GenBank accession no. EF dan IMNV isolat Brazil GenBank accession no.ay (Gambar 16). Hasil pensejajaran (pairwaise alignment) total basa nukleotida 460 fragmen gen ORF1 IMNV isolat lapang Situbondo dan Lampung menunjukkan terdapat beberapa basa yang berbeda. Pensejajaran sekuen kedua isolat dengan sekuen genom IMNV yaitu isolat IMNV Indonesia (GenBank accession no. EF061744) dan isolat IMNV Brazil (accession no.ay570982) menunjukkan terdapat lima basa yang berbeda pada sekuen fragmen gen ORF1 IMNV isolat Situbondo. Pada sekuen fragmen gen ORF1 IMNV isolat Lampung terdapat perbedaan dua basa nukleotida dengan sekuen isolat Situbondo dan kedua sekuen genom IMNV isolat Indonesia dan Brazil. 31 Limit deteksi (LOD) qrt-pcr IQ Real TM, qrt-pcr IMNV TaqMan probe, dan nested RT-PCR IMNV Limit deteksi (Limit of Detection/ LOD) qrt-pcr kit IQ-Real TM Quantititave System (Farming Intelligene) adalah satuan konsentrasi terendah yang dapat dideteksi dengan reagen tersebut. Untuk mendapatkan limit deteksi, dilakukan serial pengenceran kontrol positif IMNV kit IQ-Real TM. Kontrol positif yang tersedia dalam kit tersebut memiliki konsentrasi 10 6 salinan/ µl. Serial pengenceran kontrol positif IMNV dimulai dari konsentrasi 10 5, 10 4, 10 3, 10 2, dan 10 1 salinan/µl. Keseluruhan konsentrasi pengenceran tersebut diamplifikasi dengan qrt-pcr IQ-Real, hasil amplifikasi menunjukkan perbandingan nilai Ct dengan jumlah siklus. Kurva yang berbentuk sigmoid menandakan primer mampu mengamplifikasi kontrol positif IMNV. Konsentrasi salinan virus yang tinggi akan menaikkan kurva lebih cepat pada siklus amplifikasi awal. Dengan kata lain konsentrasi salinan berbanding terbalik dengan nilai Ct. Kurva yang terbentuk menjadi standar kurva setelah dianalisis dengan software RotorGene Q series (Gambar 17) dan Tabel 6. Gambar 17 Limit deteksi (LOD) qrt-pcr IMNV IQ Real (Farming Intelligene); (a) Standar kurva nilai curve threshold (Ct); (b) Nilai konsentrasi salinan dan nilai Ct

5 32 Tabel 5 Konsentrasi salinan virus berdasar nilai Ct qrt-pcr IQ Real TM IMNV No Warna Nama Ct Given Conc (Salinan) Calc Conc (Salinan) 1 Standar IMNV 10^6 22, , ,2 2 Standar IMNV 10^5 24, , ,6 3 Standar IMNV 10^4 28, , ,2 4 Standar IMNV 10^3 31, , ,6 5 Standar IMNV 10^2 35,28 100,0 81,2 6 Standar IMNV 10^1 38,21 10,0 10,2 7 NTC Limit deteksi qrt-pcr IMNV TaqMan probe adalah nilai konsentrasi terendah dari sampel positif IMNV yang dapat dideteksi dengan teknik qrt-pcr tersebut. Sampel RNA udang vaname yang positif terdeteksi IMNV secara nested RT-PCR, digunakan sebagai sampel yang diencerkan untuk mencari limit deteksi uji. Sampel C5 adalah sampel positif IMNV yang memiliki konsentrasi RNA tertinggi, sehingga digunakan untuk qrt-pcr maupun nested RT-PCR. Hasil pengukuran konsentrasi RNA sampel C5 (udang positif IMNV) adalah 44,1 ng/µl dengan kemurnian (A260/A230) sebesar Selanjutnya sampel RNA dibuat seri pengencerannya mulai 10-1 hingga Hasil pengenceran sampel RNA tersebut digunakan sebagai template pada kedua uji tersebut. Hasil uji dengan qrt-pcr IMNV TaqMan probe pada serial pengenceran sampel disajikan pada Tabel 7 dan Gambar 18.) Tabel 6 Nilai Ct qrt-pcr IMNV TaqMan probe pada pengenceran sampel C5 (klinis) No Warna Nama Tipe Ct 1 NTC NTC 2 C5 pengenceran10-4 Unknown 3 C5 pengenceran10-3 Unknown 29,95 4 C5 pengenceran10-2 Unknown 29,58 5 C5 pengenceran10-1 Unknown 28,48 6 C5 Unknown 27,73 Hasil pengujian dengan qrt-pcr TaqMan probe menunjukkan bahwa konsentrasi RNA 44,1 ng/µl setelah pengenceran hingga 10-4 sampel positif IMNV sudah tidak dapat dideteksi dengan qrt-pcr. Terdapat perbedaan nilai Ct antar sampel RNA yang telah diencerkan, dimana sampel dengan konsentrasi tinggi (pengenceran terendah) memiliki nilai Ct lebih kecil dibandingkan dengan sampel positif IMNV konsentrasi terendah (pengenceran tertinggi). Limit deteksi qrt-pcr IMNV TaqMan probe adalah pengenceran Pengenceran sampel

6 RNA (C5) konsentrasi 44,1 ng/µl hingga 10 4 untuk pengujian dengan nested RT- PCR. Hasil deteksi produk PCR dengan elektroforesis menunjukkan pada nested RT-PCR sudah tidak dapat mendeteksi sampel positif IMNV pada pengenceran Limit deteksi deteksi IMNV dengan nested RT-PCR IMNV (OIE, 2010) pada pengenceran 10-1 (Gambar 19). 33 Gambar 18 Limit Deteksi (LOD) qrt-pcr IMNV dengan TaqMan probe Gambar 19 Limit analitik pada serial pengenceran sampel C5 dengan nested RT-PCR IMNV (OIE, 2010); M (marker 100 bp), line 1: Kontrol positif IMNV (139 bp), line 2: NTC, line 3: sampel C5, line 4: sampel C5 10-1, line 5:sampel C5 10-2, line 6: sampel C5 10-3, line 7: sampel C Sensitifitas diagnostik nested RT-PCR dan qrt-pcr IMNV pada sampel udang vaname (klinis dan sub klinis) Rata-rata konsentrasi RNA yang berhasil diisolasi menggunakan kit Silica Extraction (Farming Intelligene Tech. Corp., Taiwan) adalah ng/µl dengan kemurnian (A260/A230) berkisar antara Sampel dengan gejala klinis (kode : C5.K1-C5K3; K1-K4; HK4) dan sub klinis (kode :C5.N1-N3; SK1- SK4; HK4) diuji dengan nested RT-PCR (primer 4587F-4914R; 4725NF- 4863NR) (Gambar 20) dan qrt-pcr IQ Real IMNV. Hasil pengujian keseluruhan sampel disajikan pada Tabel 7.

7 34 Gambar 20 Hasil nested RT-PCR IMNV (139 bp), sampel klinis dan sub klinis IMNV; (A) LineM (Marker 100 bp), line1 (kontrol +IMNV), line 2 (NTC), line 3-10 (sampel 1-8), line (sampel 9-11). (B) line M (marker 100 bp), line 1(kontrol + IMNV,139 bp), line 2 (NTC), line 3-7(sampel 12-16) Tabel 7 Hasil pengujian sampel klinis dan sub klinis dengan nested RT- PCR dan qrt-pcr IQ Real No Kode Kondisi qrt-pcr Nested Sampel (Ct) Salinan RT-PCR 1. C5.K1 Klinis 29, C5.K2 Klinis 33, C5.K3 Klinis 30, K.1. Klinis 33,47 206, K.2. Klinis 35,48 49, K.3. Klinis 35,43 51, K.4. Klinis 32,71 353, H.K4 Klinis 34,71 85, C5.N.1 Sub Klinis 35, C5.N.2 Sub Klinis 38, C5.N.3 Sub Klinis 39, SK1 Sub Klinis SK2 Sub Klinis SK3 Sub Klinis SK4 Sub Klinis HSK2 Sub Klinis Hasil pengujian dengan qrt-pcr menunjukkan hasil yang berbeda dengan nested RT-PCR. Keseluruhan sampel dengan gejala klinis menunjukkan hasil positif IMNV baik dengan qrt-pcr maupun dengan nested RT-PCR. Dari keseluruhan sampel sub klinis yang diuji terdapat tiga sampel yang terdeteksi positif IMNV dengan qrt-pcr namun negatif IMNV dengan nested RT-PCR. Kisaran salinan virus myonecrosis yang terdeteksi pada sampel sub klinis adalah 3-50 salinan (Tabel 7).

8 Penghitungan nilai sensitifitas uji diagnostik nested RT-PCR dan qrt-pcr IQ Real TM adalah : Tabel 8 Perhitungan nilai sensitifitas uji diagnostik nested RT-PCR dan qrt- PCR IQ Real TM rrt- PCR IMNV Nested RT-PCR IMNV Positif Negatif JUMLAH Positif Negatif JUMLAH Penghitungan akurasi berdasar rumus sebagai berikut : Sensitifitas = True positivex 100% True Positive+False Negative = 8/ 8+0 X 100% = 100% Berdasar hasil pengujian sampel, nilai sensitifitas uji diagnostik nested RT- PCR dan qrt-pcr IQ Real TM 100%, dengan limit deteksi hingga 1 salinan/ µl. Metoda nested RT-PCR hanya mampu membaca hingga 10 3 salinan/ µl. Deteksi IMNV dengan qrt-pcr TaqMan probe dan qrt-pcr IQ Real TM Hasil pengujian IMNV pada sampel udang dengan qrt-pcr TaqMan probe dan qrt-pcr IQ Real TM disajikan pada Gambar 21 a,b,c. Konsentrasi salinan virus dan nilai Ct qrt-pcr disajikan pada Tabel 9. Gambar 21 Pengujian sampel IMNV dengan qrt-pcr IMNV TaqMan probe dan qrt-pcr IQ Real TM. (a) Kurva Ct qrt-pcr IQ Real. (b) Kurva Ct qrt-pcr IMNV TaqMan (c) Perbandingan nilai Ct dengan konsentrasi salinan qrt-pcr IQ Real.

9 36 Tabel 9 Konsentrasi salinan dan nilai Ct qrt-pcr IQ real dan TaqMan probe No. Warna Name qrt-pcr IQ Real Ct Con.salinan TaqMan probe Ct 1 Stand.IMNV 10 4 / pimnv 28, ,00 29,39 2 sampel 174a 37,08 27,3 35,19 3 sampel 174b 37,46 20,8 36,99 4 sampel 175a 36,54 40,1 34,55 5 sampel 175b ,34 6 sampel 175c 36,84 32,4 33,42 7 sampel 175d sampel 175e ,32 9 NTC Hasil pemeriksaan dengan jumlah sampel terbatas menunjukkan sampel 175b negatif IMNV dengan IQ Real, dan positif IMNV pada Ct 36,34 dengan TaqMan probe. Sampel 175e negatif IMNV dengan TaqMan probe dan IQ Real. Rata-rata nilai Ct yang dihasilkan oleh Taqman probe dan IQ Real tidak banyak berbeda (setara). Kloning fragmen gen ORF1 IMNV sebagai kandidat kontrol positif Tahapan dalam kloning dimulai dari ligasi, transformasi, seleksi koloni dan perbanyakan. Untuk mengetahui sel bakteri telah mengandung DNA rekombinan, maka sel bakteri ditumbuhkan dalam medium padat yang mengandung antibiotik, X-gal (zat kimia yang berfungsi sebagai indikator) dan IPTG (zat kimia yang berfungsi sebagai inducer). Jika sel bakteri tersebut mengandung DNA rekombinan, maka terdapat koloni berwarna putih pada kultur medium padat. Adanya perubahan yang terjadi pada koloni digunakan untuk memastikan keberhasilan membuat DNA rekombinan dan penggandaan jumlah gen yang disisipkan ke dalam plasmid (Azhar, 2008). Konsentrasi plasmid yang dihasilkan dari purifikasi plasmid DNA Rekombinan IMNV menggunakan QIAprep miniprep (Qiagen)disajikan pada Tabel 11. Tabel 10 Konsentrasi plasmid DNA rekombinan IMNV Kode Konsentrasi Puritas plasmid Plasmid Plasmid (ng/ µl) A260/A A 81,1 1, B 95,9 1, Bb 69,2 1, B 32,5 1, C 57,0 1,733

10 Primer gen spesifik digunakan untuk memastikan ketepatan insersi gen target pada plasmid DNA rekombinan IMNV (pimnv). Amplifikasi PCR dengan gen spesifik memunculkan pita 327bp dan 270 bp sesuai dengan primer fragmen gen ORF1 IMNV (Gambar 22). 37 Gambar 22 Plasmid DNA rekombinan IMNV (pimnv); M (marker 100 bp); line 1-8: pimnv (327 bp); line 7-8: pimnv (270 bp). Hasil sekuensing pimnv 218 dan pimnv 412 dengan gen spesifik 99% sesuai dengan genome IMNV isolat Indonesia GenBank accession no. EF dan IMNV isolat Brazil GenBank accession no.ay Analisa BLAST GenBank pimnv dengan primer T7 promoter dan Sp6 promoter menunjukkan terdapat 2 jenis urutan nukleotida pada hasil sequence yaitu gen IMNV (GenBank accession no.ef dan no.ay570982), dan gen pdrive cloning vectorgenome Acc.no. DQ sesuai dengan vektor plasmid yang digunakan. Tabel 11 Nilai Ct plasmid DNA rekombinan IMNV (pimnv) dengan rpcr IMNV TaqMan probe No. Warna Sampel Ct 1 pimnv 218A 26,51 2 pimnv 218 B 19,73 3 pimnv 218 Bb 22,11 4 pimnv 412 B 34,07 5 pimnv 412 C 22,84 6 cdna sampel positif IMNV (C5.K1) 7 NTC 26,87 Keseluruhan plasmid DNA rekombinan IMNNV (pimnv) berhasil diamplifikasi dengan real time PCR IMNV TaqMan Probe bersama dengan sampel positif IMNV (cdna). Konsentrasi pimnv berpengaruh terhadap nilai Ct real time PCR (Tabel 12). Konsentrasi plasmid berbanding terbalik dengan nilai Ct pada kurva qpcr. Plasmid dengan konsentrasi rendah nilai Ct pada qpcr

11 38 akan lebih tinggi dibanding plasmid dengan konsentrasi yang lebih tinggi (Gambar 23). Gambar 23 Kurva nilai Ct plasmid DNA rekombinan (pimnv) pengujian rpcr IMNV TaqMan probe Gambar 24 Peta plasmid DNA rekombinan IMNV (pimnv) 327 bp pada pdrive cloning vector

12 39 Pembahasan Infeksi IMNV pertama kali muncul pada budidaya udang vaname (L.vannamei) di Pernambuco di Brasil pada tahun 2002, dan selanjutnya menyebar ke seluruh pesisir wilayah utara-timur Brazil, Indonesia, Thailand dan Provinsi Hainan di Cina (Lightner et al., 2004b; Senapin et al., 2007; Andrade et al., 2007). Sumber asli infeksi tidak diketahui, tetapi penyebaran trans-benua hampir dapat dipastikan karena tingginya frekwensi perdagangan induk udang L. vannamei (Walker et al., 2010). Gejala klinis yang menyertai infeksi myonecrosis pada umumnya muncul dengan derajat nekrosis otot udang yang berbeda-beda (Tang et al., 2005; Walker et al., 2010). Infeksi myonecrosis pertama kali masuk ke Indonesia pada tahun 2006 menjadi wabah di tambak-tambak udang di Situbondo Jawa Timur. Gejala klinis oleh infeksi myonecorsis pada budidaya udang vaname berupa hilangnya transparansi pada jaringan otot akibat nekrosis, infeksi lanjutan (berat) ditandai dengan perubahan jaringan otot di bagian distal abdomen udang dari warna putih suram menjadi merah seperti udang rebus (Andrade et al., 2008). Gejala klinis yang ditimbulkan akibat infeksi myonecrosis di Indonesia memiliki kemiripan dengan gejala klinis myonecrosis di Brazil (Senapin et al., 2007; OIE, 2012; Senapin et al., 2011) Hasil pengamatan sampel udang vaname dengan gejala klinis infeksi myonecrosis, terdapat perubahan jaringan otot berwarna putih (nekrosis) pada ruas abdomen ke-6. Nekrosis jaringan otot udang vaname hanya pada ruas abdomen ke-6 dan tidak merata keseluruh tubuh. Warna udang juga tidak mengalami perubahan menyerupai udang rebus, dimana infeksi myonecrosis berat ditandai dengan adanya perubahan nekrosis jaringan otot udang dari warna putih suram menjadi merah menyerupai udang rebus (Lightner et al., 2004). Pada umumnya infeksi awal ditandai dengan hilangnya transparansi pada jaringan otot akibat nekrosis dan infeksi lanjutan ditandai dengan nekrosis pada jaringan otot di bagian distal abdomen (Lightner et al.,2004a,b; Poulos et al., 2006). Perubahan nekrosis jaringan otot dari warna putih suram menjadi merah (seperti udang rebus) menyebabkan mortalitas udang hingga 70% (Andrade et al., 2008). Pengambilan sampel dilakukan pada saat tambak tidak dalam kondisi terjadi kematian masal akibat infeksi myonecrosis. Infeksi myonecrosis dicurigai menjadi penyebab kematian beberapa ekor udang vaname di tambak berdasar gejala klinisnya. Kematian udang vaname oleh infeksi myonecrosis tersebut relatif tidak banyak, hal ini kemungkinan disebabkan status infeksi myonecrosis masih tahap infeksi awal. Seperti dikemukakan oleh Andrade et al., (2007) sifat infeksi myonecrosis adalah komulatif progresif, dimana udang vaname yang diinfeksi buatan dengan virion murni IMNV menunjukkan perkembangan infeksi yang lambat, dan rata-rata waktu kematian udang hingga 50% (LT 50 ) setelah hari ke-43 paska infeksi (p.i.) Hasil pemeriksaan sampel udang dari Situbondo yang dicurigai terinfeksi IMNV dengan nested RT-PCR (OIE, 2012) menunjukkan sampel positif IMNV. Sampel positif IMNV tersebut digunakan untuk deteksi fragmen ORF 1 IMNV. Primer 218F-682R adalah primer yang didesain untuk mengamplifikasi fragmen gen ORF1 IMNV sepanjang 464 bp, namun demikian primer tersebut ternyata sulit mengamplifikasi cdna positif IMNV untuk menghasilkan pita 464 bp.

13 40 Kesulitan mendapatkan pita 464 bp sesuai target fragmen gen ORF1 IMNV mungkin dikarenakan kualitas primer yang kurang baik, sehingga sulit mengamplifikasi gen target. Untuk mendapatkan target fragmen gen ORF1 sepanjang 464 bp digunakan kombinasi primer 218F-682R dengan primer real time RT-PCR Taqman probe 412F-545R. Amplifikasi fragmen gen ORF1 mengkombinasikan primer 218F-545R agar dapat menghasilkan produk PCR sepanjang 327 bp, dan primer 412F-682R yang menghasilkan produk PCR sepanjang 270 bp. Kombinasi primer ini dilakukan agar dapat mengamplifikasi basa nukeotida fragmen gen ORF1 pada sekuen Urutan basa nukleotida fragmen gen ORF adalah daerah yang digunakan untuk desain primer real time RT-PCR IMNV TaqMan probe (Andrade et al., 2007; OIE, 2012). Deteksi fragmen gen ORF1 sangat penting karena daerah tersebut adalah conserve region virus myonecrosis. Gen ORF1 adalah daerah terpanjang dari sekuen genom virus myonecrosis ( ) dibandingkan gen ORF2 ( ) (Nibert, 2007; Tang et al., 2008). Gen ORF1 mengkode protein yang mengikat putative RNA dan mengkode protein capsid virus myonecrosis (Lightner et al., 2004; Tang et al., 2005) sehingga daerah ini yang sering digunakan untuk mendeteksi keberadaan virus myonecrosis. Urutan basa nukleotida dan urutan basa nukleotida adalah urutan basa nukleotida yang akan disisipkan pada vektor plasmid untuk keperluan pembuatan plasmid DNA rekombinan IMNV (IMNVp) sebagai kontrol positif real time RT- PCR IMNV TaqMan probe. Urutan nukleotida tersebut sesuai dengan desain primer qrt-pcr IMNV, yaitu daerah fragmen gen ORF1 myonecrosis virus yang mengambil daerah (Andrade et al., 2007; da Silva et al., 2011; OIE, 2012). Desain primer probe qrt-pcr dimulai dari sekuen , sehingga kedua urutan nukleotida yang disisipkan dalam plasmid masih dapat dikenali oleh probe qrt-pcr IMNV. Berdasar hasil sekuensing sampel IMNV isolat lapang yang berasal dari Situbondo dan Lampung, kedua isolat memiliki kemiripan (similiarity) dengan genome IMNV dari Brazil dan Indonesia hingga 99%. Isolat lapang dari Lampung memiliki kemiripan dengan isolat Indonesia 99,12%, dan dengan isolat Brazil 98,90%. Isolat Situbondo memiliki kemiripan dengan isolat Indonesia 99,55% dan isolat Brazil 99,33%. Dibandingkan dengan IMNV isolat Lampung, IMNV isolat Situbondo lebih banyak memiliki kemiripan basa dengan isolat Indonesia dan isolat Brazil. Hal ini dimungkinkan mengingat isolat Indonesia (GenBank accession no.ef061744) berasal dari Situbondo (Senapin et al., 2007). Kemiripan antar kedua isolat lapang dari Lampung dan Situbondo berdasar pensejajaran (alignment) dari kedua sekuens fragmen adalah 98,90%. Terdapat perbedaan 5 pasang basa dari total 457 pasang basa diantara kedua isolat tersebut. Hasil BLAST menunjukkkan bahwa urutan nukleotida tersebut mengkode fragmen gen ORF1 IMNV (Lampiran 1 dan 2). Meskipun terdapat perbedaan basa, secara umum kedua isolat tersebut masih memiliki kemiripan dengan genom IMNV isolat Brazil maupun Indonesia yang terdaftar di GenBank. Seperti dikemukakan Senapin et al (2007) homologi antara isolat Indonesia dan Brazil dibuktikan dengan sekuen keduanya yang memiliki kemiripan hingga 99,6% dimana hanya terdapat 29 basa yang berbeda dalam urutan genome dari total 7,5 kb basa nukleotida. Salah satu perbedaan tersebut adalah adanya penyisipan basa tunggal pada nukleotida urutan 7431 yang berperan pada penyusunan asam amino

14 dalam pembentukan protein RdRp (RNA dependent RNA polymerase). Meskipun terjadi mutasi pergeseran frame (frame shift) asam amino pada posisi 731 dan terjadi 3 mutasi lainnya pada ORF2, tidak mengubah asam amino di delapan motif sekuen RdRp yang berada di (Poulos et al., 2006; Senapin et al., 2007). Sampel udang vaname yang diambil dari tambak di Lampung menunjukkan gejala klinis berupa hilangnya transparansi jaringan otot udang menjadi berwana keputihan (nekrosis) khususnya pada ruas abdominal ke-6. Tidak ditemukan kondisi nekrosis lanjutan pada jaringan otot udang vaname berupa perubahan warna putih suram menjadi merah. Berdasarkan gejala klinis yang diamati dan hasil pengujian dengan nested RT-PCR dan qrt-pcr IMNV, mengindikasikan infeksi yang terjadi pada udang masih pada tahap infeksi awal. Infeksi awal ditandai dengan hilangnya transparansi pada jaringan otot akibat nekrosis dan infeksi lanjutan ditandai dengan nekrosis pada jaringan otot di bagian distal abdomen (Lightner et al.,2004a,b; Poulos et al., 2006). Pemeriksaan sampel udang dengan gejala klinis dan sub klinis IMNV menunjukkan hasil yang berbeda antara pemeriksaan dengan nested RT-PCR maupun qrt-pcr. Nested RT-PCR hanya mampu mendeteksi sampel dengan kondisi klinis terinfeksi IMNV meskipun pada tahap awal infeksi, dan tidak dapat mendeteksi sampel udang sub klinis. Berbeda dengan qrt-pcr yang dapat mendeteksi sampel klinis maupun sub klinis. Sensitivitas uji qrt-pcr IQ Real IMNV (Farming Intelligene) adalah 100%, dengan limit deteksi hingga <10 1 salinan/µl. Sesuai dengan penelitian Andrade et al., (2007) yang menyatakan bahwa nested RT-PCR hanya mampu mendeteksi IMNV saat jumlah salinan virus tinggi >1500 salinan, sedangkan qrt-pcr IMNV mampu mendeteksi hingga 10 salinan/µl RNA. Hasil pemeriksaan qrt-pcr menunjukkan udang dengan gejala klinis terinfeksi myonecrosis rata-rata terdeteksi jumlah salinan virus antara salinan/µl. Kondisi ini sesuai dengan gejala klinis yang menunjukkan infeksi myonecrosis masih pada tahap infeksi awal, yang ditandai dengan hilangnya transparansi jaringan otot udang (Lightner et al.,2004a,b). Pada sampel udang vaname sub klinis, IMNV yang terdeteksi memiliki jumlah salinan virus yang rendah. Udang vaname sub klinis IMNV menunjukkan aktivitas yang masih baik seperti gerakan dan respon terhadap pakan. Gejala klinis infeksi myonecrosis tidak ditemukan pada udang vaname sub klinis. Kematian udang vaname di lokasi tambak di Lampung yang memiliki gejala menyerupai infeksi myonecrosis tidak terjadi secara masal. Kematian udang masih dijumpai pada beberapa petak tambak dengan pola kematian progresif kumulatif. Kondisi ini sesuai dengan Kematian udang sangat tergantung dari daya tahan tubuhnya terhadap infeksi IMNV. Sistem pertahanan tubuh udang tergantung dari imunitas bawaan (innate immunity) yang terbentuk dari pertahanan humoral seperti adanya aktivitas mekanisme pembekuan hemolimph, melanisasi, respon imun antimikroba dan pertahanan seluler (fagositosis,enkapsulasi, seluler, degranulasi dan faktror pelepasan pertahanan) (Melo et al., 2011). Abdomen ruas ke-6 adalah organ udang yang memiliki jumlah salinan IMNV tertinggi, sesuai dengan penelitian da Silva et al., (2011) disamping hemolim jaringan otot merupakan organ tertinggi kedua yang mengandung jumlah virus terbanyak. 41

15 42 Pengujian real time RT-PCR IMNV dengan kit komersial IQ Real dan TaqMan probe (OIE, 2010) pada sampel nomor 174a-b dan 175a-e mampu mendeteksi sampel positif dan negatif IMNV, hanya pada sampel nomor 175b IQ Real tidak dapat mendeteksi salinan IMNV dan qrt-pr TaqMan probe mendeteksi salinan virus myonecrosis pada Ct 36,34 (konsentrasi salinan virus rendah). Pada sampel 175e, IQ Real negatif IMNV dan TaqMan probe menunjukkan nilai Ct 37,32. Pengujian dengan TaqMan probe memiliki nilai cut off Ct 37, artinya nilai Ct diatas nilai cut off dianggap sampel negatif. Dengan demikian sampel nomor 175e negatif IMNV dengan TaqMan probe dan IQ Real. Berdasar hasil pengujian IMNV pada sampel yang terbatas dengan kit IQ-Real dan TaqMan probe, menunjukkan qrt-pcr TaqMan probe setara dan bahkan memiliki kecenderungan lebih sensitif dibandingkan dengan qrt-pcr IQ Real. Kecenderungan lebih sensitif ini dapat dilihat pada sampel no. 175b dimana TaqMan probe mendeteksi jumlah salinan IMNV pada Ct ke 36,34 sedangkan IQ Real tidak dapat mendeteksinya. Kuantifikasi jumlah salinan virus pada sampel yang diuji dengan Taqman probe memerlukan kontrol positif berupa plasmid DNA rekombinan IMNV. Plasmid DNA rekombinan IMNV (pimnv) menjadi standar pada pengukuran jumlah salinan virus pada sampel uji. Kemampuan metoda diagnosa mendeteksi infeksi penyakit pada tahap awal maupun kondisi sub klinis sangat penting untuk pengendalian penyakit. Metoda deteksi patogen yang cepat, sensitif menjadi prioritas utama dalam pengendalian penyakit. Kemampuan real time RT-PCR baik dengan TaqMan probe dalam menganalisa kuantitas salinan virus pada jaringan (viral load) udang yang terinfeksi virus IMN menjadikan metoda deteksi ini sangat dibutuhkan dalam pengendalian infeksi IMN (Andrade et al., 2007; de Silva et al., 2011). Transmisi virus secara vertikal dapat dicegah melalui pengujian terhadap sampel induk udang dengan qrt-pcr sebelum dilakukan pemijahan. Sampel udang klinis dan sub klinis yang diuji menunjukkan nilai Ct maupun konsentrasi jumlah salinan tertinggi IMNV adalah pada jaringan otot dan pleopod. Jaringan udang yang memiliki jumlah virus terbesar adalah pada haemolim dan otot, diikuti dengan pleopod dan insang (de Silva et al., 2011; Andrade et al., 2007). Berdasar data kuantifikasi salinan virus dalam jaringan, maka dalam melakukan sampling pada induk udang dapat dilakukan secara non lethal sampling, sehingga tidak harus mematikan induk saat pengambilan sampel. Hasil pensejajaran sekuen (multiple pairwaise alignment) fragmen gen ORF1 IMNV isolat Lampung dan Situbondo, menunjukkan kedua isolat tersebut tidak banyak mengalami perubahan basa nukleotida pada wilayah fragmen gen ORF1. Kombinasi primer antara 218F-545R dan 412F-682R yang menghasilkan pita DNA 327 bp dan 270 bp, memperlihatkan urutan basa nukleotida keduanya berada di dalam wilayah fragmen gen ORF1. Desain primer qrt-pcr IMNV TaqMan probe baik primer forward, reverse dan probe berada didalam wilayah basa nukleotida pita 327 bp dan 270 bp. Kedua produk PCR (327 bp dan 270 bp) dapat digunakan untuk pembuatan rekombinan plasmid DNA IMNV sebagai kandidat kontrol positif IMNV sesuai desain primer qrt-pcr TaqMan probe berdasar wilayah ORF1 genom IMNV (Poulos et al., 2006). Hasil sekuensing produk PCR dan analisa molekuler untuk dapat memastikan fragmen IMNV pada sampel udang vaname dari Situbondo dan Lampung memiliki kemiripan yang tinggi, dan sesuai untuk pembuatan plasmid DNA rekombinan IMNV (pimnv).

16 Konsentrasi produk PCR hasil purifikasi sepanjang 327 bp yang diperlukan untuk ligasi pada vektor kloning sepanjang 3,8 kb adalah 21,22 ng/µl. Rasio antara vektor dan sisipan (insert) dalam kloning ini adalah 1:5 lebih tinggi dari rekomendasi Arispie (2010) yang menyatakan agar ligasi berjalan baik maka rasio antara vektor dengan insert adalaha 1:3. Keberhasilan ligasi sangat ditentukan dari konsentrasi DNA sisipan, penggunaan DNA dengan konsentrasi tinggi (lebih dari 100 µg/ml) dapat meningkatkan efisiensi ligasi (Susanto, 2004). Hasil sekuensing plasmid DNA rekombinan IMNV dan pengujian dengan qpcr IMNV TaqMan probe menunjukkan bahwa plasmid tersebut mengkode fragmen gen ORF1 IMNV dan dapat menjadi kandidat kontrol positif IMNV setelah dilakukan transkripsi linier. Deteksi infeksi myonecrosis pada udang vaname dengan qrt-pcr IQ Real memiliki sensitifitas 100% dengan limit deteksi hingga <10 1 salinan virus/µl. Limit deteksi qrt-pcr ini lebih tinggi dibandingkan dengan nested RT-PCR yang memiliki limit deteksi 10 3 salinan virus/µl. Kemampuan kit komersial mendeteksi infeksi myonecrosis memungkinkan adanya ketergantungan pada satu produk kit tertentu, sehingga dikhawatirkan kontinuitas pengujian sangat bergantung pada produk kit tersebut. Real time RT-PCR Taqman probe dapat menjadi alternatif metoda deteksi IMNV yang memiliki sensitifitas uji setara dengan kit IQ Real. Sesuai dengan rekomendasi dari OIE (2012), pengembangan metoda deteksi IMNV dengan qrt-pcr TaqMan probe mampu mendeteksi dan mengkuantifikasi IMNV pada jaringan udang. Metoda ini mampu mendeteksi sedikitnya 10 salinan RNA virus per µl total RNA (Andrade et al., 2007; OIE, 2012). Plasmid DNA rekombinan IMNV fragmen gen ORF1 IMNV, dapat dijadikan sebagai kontrol positif IMNV yang terkuantifikasi jumlah salinan/µl pada uji qrt-pcr Taqman probe. 43