REKAYASA GENETIKA. Genetika. Rekayasa. Sukarti Moeljopawiro. Laboratorium Biokimia Fakultas Biologi Universitas Gadjah Mada

Transkripsi

1 REKAYASA GENETIKA Sukarti Moeljopawiro Laboratorium Biokimia Fakultas Biologi Universitas Gadjah Mada Rekayasa Genetika

2 REKAYASA GENETIKA Teknik untuk menghasilkan molekul DNA yang berisi gen baru yang diinginkan/kombinasi gen-gen baru atau dapat dikatakan manipulasi organisme

3 ILMU YANG MENDUKUNG UNTUK DAPAT MELAKUKAN DAN MEMANFAATKAN REKAYASA GENETIKA Fisiologi mikrobia Genetika molekular Biokimia Biokimia genetik Ilmu pendukung yang lain: Kultur jaringan Fusi sel Bioreaktor

4 TAHAP PENTING PERKEMBANGAN BIOTEKNOLOGI MODERN 1944 DNA pembawa informasi genetik 1953 struktur DNA 1961 kodon 1968 ditemukan enzim endonuklease restriksi 1973 teknik kombinasi gen berhasil dilakukan 1977 hormon tumbuh diproduksi di bakteri dengan teknik rekombinasi DNA 1978 gen untuk insulin diperbanyak 1982 Humulin mulai dijual 1983 Polymerase Chain Reaction (PCR) 1985 PCR dipublikasikan 1990 Human Genom Project 1990 terapi gen pertama kali diaplikasikan 2000 Human Genom Project selesai

5 DOGMA SENTRAL BIOLOGI Replikasi DNA Transkripsi Translasi RNA Protein Transkripsi Balik

6 KROMOSOM DNA

7 DNA

8 ENZIM RESTRIKSI Ada 3 macam enzim restriksi, yaitu: Tipe I, II dan III Masing-masing mempunyai spesifisitas tempat pemotongan Tipe II memotong pada urutan basa pengenal Enzim yang banyak digunakan dalam DNA rekombinan Nama terdiri dari 3 singkatan spesies bakteri: BamH I: Bacillus amyloliquefaciens H EcoR I: Escherichia coli RY13

9 SUMBER ENZIM Bacillus amyloliquefaciens H Brevibacterium albidum Escherichia coli RY13 Haemophilus aeqyptius Haemophilus influenzae Rd SINGKATAN BamH I Bal I EcoR I Hae III Hind III URUTAN PENGENAL GGATCC CCTAGG * TGGCCA ACCGGT * GAATTC CTTAAG GGCC CCGG * * * * AAGCTT TTCGAA Haemophilus parainfluenzae Hpa II GTTAAC CAATTG

10 LANGKAH LANGKAH MEMBUAT DNA REKOMBINAN 1. Isolasi sumber DNA yang diinginkan : DNA dari total genomic Dibuat dari mrna yaitu cdna Dibuat secara in vitro 2. Pemotongan gen yang diinginkan Bila hasil pemotongan ujungnya tumpul pada ujung perlu ditambahkan Fragmen DNA : Ekor homopolimer Linker Adaptor 3. Menyisipkan gen yang diinginkan ke alat pembawa vektor Plasmid : materi gen ekstrakromosomal Bacteriophage : virus bakteri Cosmid : gabungan cohesive ends bacteriophage lambda dan plasmid

11 LANGKAH LANGKAH MEMBUAT DNA REKOMBINAN (lanjt.) 4. Memasukkan DNA Rekombinan ke sel inang Transformasi DNA-packaging Mikroinjection 5. Menyeleksi clone Genetik Hibridisasi asam nukleat

12 LANGKAH LANGKAH MEMBUAT DNA REKOMBINAN

13 ISOLASI SUMBER DNA

14 PENYISIPAN DNA

15 CARA INTRODUKSI DNA Transformasi E.coli dapat menyerap DNA bakteriophage maupun DNA plasmid dengan perlakuan CaCl3, diikuti perlakuan suhu. Transfeksi Sama dengan transformasi, bedanya yang masuk bukan plasmid tetapi DNAphage atau virus. Masuknya DNA diinduksi dengan heat shock.

16 CARA INTRODUKSI DNA (lanjt.) DNA- packaging Masuknya molekul DNA-phage lebih efisien apabila dikemas di dalam partikel phage daripada transfeksi. Microinjection Dengan memakai jarum super kecil menginjeksikan DNA secara langsung ke inti sel yang ditransformasi.

17 SELEKSI CLONE

18 SYARAT VEKTOR UNTUK TRANSFER GEN 1. Harus berukuran kecil 2. Melangsungkan independen replikasi (replikasi sendiri) 3. Berisi sisi pengenal tunggal untuk satu atau lebih enzim restriksi pada tempat yang tidak esensial unruk replikasi 4. Memiliki gen untuk resistensi terhadap antibiotik 5. Tidak mengganggu metabolisme dan merusak gen dalam sel target 6. Mampu memindahkan secara efisien

19 PLASMID pbr 322

20 CLONING VECTORS VECTOR AVARAGE INSERT SIZE (BP) Plasmid Lambda Cosmid Yeast Artificial Chromosome (YAC)

21 JENIS VECTOR 1. VIRAL VECTOR Retrovirus Adenovirus Adeno Ass. Virus Herpes virus Hepatitis virus 2. NON- VIRAL VECTOR

22 JENIS VECTOR (lanjt.) RETROVIRUS : Mampu menginfeksi bermacam macam sel target Tidak merusak sel yang diinfeksi

23 SYARAT SEL INANG YANG BAIK 1. Cepat tumbuh 2. Mampu tumbuh pada medium kultur yang murah 3. Tidak pathogenik 4. Stabil dalam kultur Sel inang yang banyak digunakan untuk mempelajari cloning : E.coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevicae

24 KEBERHASILAN REKAYASA GENETIKA Keberhasilan Rekayasa Genetika tergantung pada : Kemurnian DNA Bersih dari DNA-ase Kemampuan penguasaan teknik rekombinan Kriteria keberhasilan : Bila gen asing yang di clone dapat berekspresi dengan baik dan stabil

25 Terima Kasih