Teknik-teknik Dasar Bioteknologi

Transkripsi

1 Teknik-teknik Dasar Bioteknologi Oleh: TIM PENGAMPU Program Studi Agroteknologi Fakultas Pertanian Universitas Jember

2 Tujuan Perkuliahan 1. Mahasiswa mengetahui macam-macam teknik dasar yang digunakan dalam bioteknologi pertanian 2. Mahasiswa mengetahui manfaat teknik dasar bioteknologi dalam bidang pertanian

3 PENDAHULUAN Bioteknologi di bidang pertanian: Pemuliaan (Breeding) Bioteknologi Modern (Rekayasa Genetika) Ditujukan untuk mendapatkan dan mengembangkan sumber keunggulan yang berhubungan dengan bidang pertanian Beberapa Contoh Produk Bioteknologi di bidang pertanian Pemanfaatan mikrob sebagai agensia pengendali hayati, biofertilizer Pengembangan Tanaman toleran dan tahan stres lingkungan Pengembangan Tanaman produksi unggul Pengembangan Tanaman Tahan OPT

4 1. Agensia pengendali hayati dan bioferlizer Nematoda patogen serangga Jamur Patogen Serangga Biofertilizer

5 2. Tanaman tahan atau toleran stres lingkungan Tebu NXI-4T 3. Tanaman unggul produksi Padi tahan Genangan air Payau Produksi mencapai 13,5 ton per hektar

6 4. Tanaman Tahan Hama dan Penyakit Kedelai Tahan Hama Ulat Kedelai Tahan karat daun

7 Dalam pengembangannya, diperlukan adanya analisa pada beberapa tataran yang lebih akurat dan spesifik: Kajian tingkat DNA, Kajian pada tingkat RNA, dan Kajian pada tingkat Protein dan metabolit

8 Kajian DNA Teknik dasar yang umum dilakukan adalah Polymerase Chain Reaction (PCR) Pemotongan (restriksi) penyambungan (ligasi) untai DNA Amplifikasi DNA Pemotongan DNA Penyambungan DNA

9 Teknik Polymerase Chain Reaction Suatu reaksi in vitro untuk menggandakan jumlah molekul DNA pada target tertentu Dilakukan dengan cara mensintesis molekul DNA baru yang berkomplemen dengan molekul DNA target tersebut Dilakukan bantuan komponen PCR dalam suatu thermocycler

10 Komponen PCR DNA template (DNA cetakan) DNA untai ganda yang membawa urutan basa fragmen atau gen yang akan digandakan dntps (deoxyribonucleotida triphosphate) material utama yang dibutuhkan untuk sintesis DNA baru dalam proses PCR yang tiap dntp yang terdiri atas datp (deoxyribo Adenine triphosphate), dgtp, dctp, dttp. Primer PCR molekul oligonukleotida untai tunggal yang terdiri atas sekitar 30 basa yang akan dipolimerisasi dalam reaksi menjadi untai pasangan DNA baru. Enzim DNA polimerase Enzim yang mengkatalis reaksi polimerase. Larutan Buffer (Cofactor) Larutan yang berfungsi melindungi enzim polimerase selama proses polimerasi

11 Siklus PCR (dilakukan pada Thermocycler) Pre-denaturasi dan denaturasi Kondisi dimana pasangan untai DNA cetakan terpisah satu sama lain karena terputusnya ikatan hidrogen antar basa-basanya sehingga menjadi untai tunggal. Umumnya terjadi pada suhu celsius Anealing Kondisi dimana terjadi pembacaan DNA cetakan oleh primer secara komplementer (berpasangan) Umumnya terjadi pada suhu celsius Elongasi dan final elongasi Kondisi dimana terjadi polimerasi Primer menjadi Untai pasangan DNA Umumnya terjadi pada suhu celsius Banyaknya siklus tersebut sangat menentukan kualitas dan kuantitas DNA yang diamplifikasi Biasanya siklus

12 PCR mixture PCR loading PCR running cycle

13 Visualisasi DNA Dilakukan pada Elektroforesis Gel Agarose Didasarkan pada perbedaan ukuran molekul DNA (base pair/ bp atau base/ b atau nukleotida/ nt ) dan muatan elektron pada DNA Dilakukan dengan bantuan pengecatan DNA Etidium bromide (EtBr) SYBR dye (RedSafe atau Green Safe). EtBr SYBR

14 bp Semakin ke bawah semakin kecil ukurannya Biasanya menggunakan penggaris molekular (marker DNA)

15 Analisa Lanjutan DNA Dilakukan untuk konfirmasi kebenaran dan keakuratan DNA target sebelum digunakan lebih lanjut. Teknik yang umum dilakukan adalah Sekuensing Southern Blot Fragmen DNA target?

16 SEKUENSING DAN SOUTHERN BLOT SEKUENSING DNA proses atau teknik penentuan urutan basa nukleotida pada suatu molekul DNA Diperlukan alat dan metode khusus untuk proses ini (DNA sekuenser) DNA Sekuensing Hasil

17 SOUTHERN BLOT HIBRIDISASI Dilakukan untuk mendeteksi keberadaan fragmen DNA spesifik melalui pendekatan hibridisasi fragment DNA dengan Probe DNA Probe DNA merupakan fragment DNA yang telah diketahui dan telah dilabeli dengan bahan kimia tertentu (biasa radioisotop) untuk memudahkan pendeteksian.