EKSTRAK RUMPUT LAUT Gracilaria verrucosa SEBAGAI IMUNOSTIMULAN UNTUK MELAWAN WHITE SPOT PADA UDANG VANAME Litopenaeus vannamei AMINATUL ZAHRA

Transkripsi

1 EKSTRAK RUMPUT LAUT Grcilri verrucos SEBAGAI IMUNOSTIMULAN UNTUK MELAWAN WHITE SPOT PADA UDANG VANAME Litopeneus vnnmei AMINATUL ZAHRA SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2017

2

3 PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA Dengn ini sy menytkn bhw tesis berjudul Ekstrk Rumput Lut Grcilri verrucos sebgi Imunostimuln untuk Melwn White Spot pd Udng Vnme Litopeneus vnnmei dlh benr kry sy dengn rhn dri komisi pembimbing dn belum dijukn dlm bentuk p pun kepd pergurun tinggi mn pun. Sumber informsi yng bersl tu dikutip dri kry yng diterbitkn mupun tidk diterbitkn dri penulis lin telh disebutkn dlm teks dn dicntumkn dlm Dftr Pustk di bgin khir tesis ini. Dengn ini sy melimphkn hk cipt dri kry tulis sy kepd Institut Pertnin Bogor. Bogor, Februri 2017 Amintul Zhr NIM C

4 RINGKASAN AMINATUL ZAHRA. Ekstrk Rumput Lut Grcilri verrucos sebgi Imunostimuln untuk Melwn White Spot pd Udng Vnme Litopeneus vnnmei. Dibimbing oleh SUKENDA dn DINAMELLA WAHJUNINGRUM. Slh stu penykit yng menyerng udng vnme dlh penykit White Spot yng disebbkn oleh White Spot Syndrome Virus (WSSV). Dibutuhkn upy untuk mencegh penyebrn dri WSSV pd budidy udng yng efektif, slh stuny dlh dengn pemberin imunostimuln. Bhn lmi yng dpt dijdikn sebgi imunostimuln yng mn dn rmh lingkungn dlh rumput lut G. verrucos. G.verrucos memiliki kndungn senyw poliskrid yng bisny berisi glktos mupun glktn bersulft. Senyw bioktif dri G.verrucos bis didptkn dengn cr ekstrksi. Dlm proses ekstrksi bnyk fktor yng dpt mempengruhi kndungn senyw hsil ekstrksi dintrny jenis pelrut. Uji bhn pelrut yng terbik dlm proses ekstrksi G.verrucos perlu dilkukn. Pemberin ekstrk rumput lut G. verrucos dlm pkn dihrpkn dpt menstimulsi sistem imun udng vnme. Penelitin ini terdiri ts tig thpn. Penelitin thp stu untuk menguji jenis pelrut yng terbik terdiri dri tig perlkun, yitu EA (etil sett), MT (metnol), dn ET (etnol). Penelitin thp du yitu menguji pengruh dosis ekstrk G. verrucos dlm pkn yng tept untuk meningktkn sistem imun dn resistensi udng vnme terhdp WSSV, terdiri dri enm perlkun dn msing-msing tig ulngn, yitu KN (tnp ekstrk), KP (tnp ekstrk + infeksi WSSV), D2 (2 g/kg pkn + infeksi WSSV), D3 (3 g/kg pkn + infeksi WSSV), D4 (4 g/kg pkn + infeksi WSSV), dn D5 (5 g/kg pkn + infeksi WSSV). Penelitin thp tig yitu menguji pengruh lm pemberin ekstrk G.verrucos yng berbed dlm meningktkn kinerj produksi dn respons imun udng vnme (L. vnnmei) terhdp serngn penykit WSSV, terdiri dri lim perlkun dn tig ulngn, yitu CN (0 kli pemberin/buln), CP (0 kli pemberin/buln + infeksi WSSV), W1 (1 minggu pemberin/buln + infeksi WSSV), W2 (2 minggu pemberin/buln (intervl 7 hri) + infeksi WSSV), dn WS (Setip hri pemberin selm sebuln + infeksi WSSV). Udng vnme dengn bobot 6.07±0.1 g/ekor dipelihr dlm kurium dengn ukurn cm 3 dengn pdt tebr 10 ekor/kurium. Udng diberi pkn ekstrk secr t stition sebnyk tig kli sehri. Prmeter uji yng dimti dlh totl hemosit (THC), ktifits fgositosis (AF), diferensil hemosit (DHC), ktifits phenoloksidse (PO), respirtory burst (RB), kelulushidupn, lju pertumbuhn hrin (LPH), rsio konversi pkn (FCR), Nested PCR, histoptologi, dn gejl klinis. Hsil penelitin thp stu menunjukkn bhw bhn pelrut terbik untuk ekstrksi G. verrucos terdpt pd perlkun EA. Hsil penelitin thp du menunjukkn bhw respons imun (THC, AF, RB, PO, dn Persentsi hilin) udng yng diberi pkn ekstrk menglmi peningktn dibnding perlkun KP mupun KN. Respons imun setelh uji tntng dengn WSSV pd perlkun jug menunjukkn nili yng lebih tinggi dibndingkn dengn kontrol, dn respons imun pling tinggi pd perlkun D4. Kelngsungn hidup setelh uji tntng pd perlkun KN, KP, D2, D3, D4, dn D5 berturut-turut sebesr

5 96.67±5.74%, 26.67±5.74%, 43.33±5.74%, 46.67±5.74%, 56.67±5.74%, dn 36.67±5.74%. Perlkun D2, D3, D4, dn D5 menunjukkn kelngsungn hidup yng lebih tinggi secr signifikn (P<0.05) dibndingkn dengn KP. Hsil penelitin thp tig menunjukkn bhw respons imun (THC, AF, RB, PO, dn Persentsi hilin) udng yng diberi pkn ekstrk menglmi peningktn dibnding perlkun CP mupun CN. Respons imun setelh uji tntng dengn WSSV pd perlkun (W1, W2, dn WS) jug menunjukkn nili yng lebih tinggi dibndingkn dengn kontrol, dn respons imun pling tinggi pd perlkun W2. Kelngsungn hidup setelh uji tntng pd perlkun CN, CP, W1, W2, dn WS berturut-turut sebesr ±0.00%, 23.33±5.77%, 46.67±5.77%, 60.00±10.00%, dn 40.00±10.00%. Perlkun W2 menunjukkn kelngsungn hidup yng pling tinggi signifikn (P<0.05) dibndingkn dengn perlkun linny. Kinerj produksi udng (LPH dn Biomss) pd perlkun W2 dn WS menunjukkn hsil yng lebih tinggi signifikn (P<0.05) dengn perlkun linny, sedngkn FCR tidk berbed signifikn (P>0.05) ntr semu perlkun. Konfirmsi WSSV pd penelitin thp du dengn menggunkn nested PCR menunjukkn hsil bhw udng (D2, D3, D4, D5, dn KP) positif terinfeksi WSSV. Konfirmsi WSSV pd penelitin thp tig dengn menggunkn nested PCR menunjukkn hsil bhw udng (W1, W2, WS, dn CP) positif terinfeksi WSSV. Histologi udng yng terinfeksi WSSV menunjukkn bhw dny bdn inklusi sedngkn pd udng norml tidk ditemukn. Perubhn gejl klinis secr morfologis pd udng yng terinfeksi WSSV terjdiny perubhn wrn kemerhn (discolourtion) pd tubuh, kki renng, dn ekor sedngkn udng norml pd tubuh, kki renng, dn ekor berwrn putih bersih. Pd udng yng terinfeksi WSSV usus kosong sert heptopnkres berwrn kekuningn (puct) sedngkn pd udng norml usus penuh dn heptopnkres berwrn hitm kecokltn. Disimpulkn bhw ekstrksi G. verrucos dengn pelrut etil sett menghsilkn senyw bhn ktif pling tinggi dn pemberin ektrk G. verrucos pd dosis 4 g/kg pkn dengn lm pemberin selm 2 minggu (intervl 7 hri) dpt meningktkn respons imun dn resistensi terbik terhdp infeksi WSSV. Kt kunci: Grcilri verrucos, imunostimuln, rumput lut, udng vnme, WSSV

6 SUMMARY AMINATUL ZAHRA. Extrct of Seweed Grcilri verrucos s Immunostimulnt to Resist White Spot Disese in The White Shrimp Litopeneus vnnmei. Supervised by SUKENDA nd DINAMELLA WAHJUNINGRUM. One of diseses in the white shrimp is white spot disese tht cused by White Spot Syndrom Virus (WSSV). Thus, effective effort to prevent WSSV outbrek in shrimp frming is required, nd one of which is the dministrtion of immunostimulnt. One of herbls tht cn be used s sfety nd eco-friendly immunostimulnt is seweed Grcilri verrucos. G. verrucos hs polyscchrides compound which hs glctose or sulfted glctn. Bioctive compound of G.verrucos cn be obtined by extrction. In the extrction process, there re mny fctors tht cn ffect the compounds resulted from the extrction, including the type of solvent. Study bout the best solvent in G. verrucos extrction is needed to do. The dministrtion of seweed G. verrucos extrct in diet is expected to stimulte immune system in the white shrimp. This study consisted of three experiments. The first experiment ws im to determine the effect of different solvent to produce the best compound in extrct G.verrucos which consisted of three tretments, nmely EA (Etil Asett), MT (Methnol), nd ET (Ethnol). The second experiment ws conducted to exmine the best dose of G. verrucos extrct through feed,consist of six tretments in three replictes respectively, nmely KN (without extrct), KP (without extrct + infected WSSV), D2 (2 g/kg feed + infected WSSV), D3 (3 g/kg feed + infected WSSV), D4 (4 g/kg feed + infected WSSV), nd D5 (5 g/kg feed + infected WSSV). The third experiment ws conducted to exmine the effect of different durtion of the G.verrucos extrct dministrtion to improve the production performnce nd enhnce the immune response white shrimp (L. vnnmei) ginst WSSV disese, consisted of five tretments nd three replictes, nmely CN (0 dministrtion/month), CP (0 dministrtion/ month + infected WSSV), W1 ( week of dministrtion/ month + infected WSSV), W2 (2 weeks of dministrtion/ month (intervl 7 dys) + infected WSSV), nd WS (Every dys dministrtion in month + infected WSSV). White shrimp with initil body weight of 6.07±01 g/shrimp were rered in the cm 3 with density of 10 shrimps/qurium. White shrimp hd been fed medicted feed t stition three times dily. Test prmeters exmined were totl hemocytes count (THC), phgocytic ctivity (AF), differentil hemocytes (DHC), phenoloksidse ctivity (PO), respirtory burst (RB), survivl rte, dily growth rte (LPH), feed conversion rtio (FCR), nested PCR, histopthology, nd clinicl symptoms. The result of first experimet showed tht the best solvent for extrction G. verrucos ws obtined in EA tretment. The result of the second experiment showed tht the immune response (THC, AF, RB, PO, nd the hylin percentge) shrimp fed medicted feed incresed compred to the KP nd KN. The immune response fter chllenge test with WSSV in tretment lso showed higher vlue compred to the control, nd the highest immune response ws obtined in tretment D4. Survivl post-chllenge test in the tretment of KN, KP, D2, D3, D4, nd D5 were ± 5.74%, ± 5.74%, ± 5.74%, ± 5.74%,

7 56.67 ± 5.74%, nd ± 5.74% respectively. Tretment D2, D3, D4, nd D5 showed significntly higher survivl (P <0.05) compred with KP. Result of third experiment showed tht the immune response (THC, AF, RB, PO, nd the hylin percentge) shrimp fed medicted feed incresed compred to CP nd CN. The immune response post-chllenge test with WSSV in tretment lso showed higher vlue compred to the control, nd the highest immune response ws obtined in tretment W2. Survivl post-chllenge test in the tretment of CN, CP, W1, W2, nd WS were ±0.00%, 23.33±5.77%, 46.67±5.77%, 60.00±10.00%, nd 40.00±10.00%, respectively. Tretment W2 showed highest survivl (P <0.05) compred with other tretments significntly. Shrimp performnce production (LPH, nd biomss) showed W2 nd WS in the highest significnt vlue (P<0.05) compred with other tretment, while FCR mong ll tretments ws not significntly different (P>0.05). Confirmtion of WSSV t second experiment using nested PCR showed tht shrimps (D2, D3, D4, D5, nd KP) were positively infected by WSSV. Confirmtion of WSSV in third experiment using nested PCR showed tht shrimps (W1, W2, WS, nd CP) were positively infected by WSSV. Histology of shrimp which infected with WSSV showed the occurence of inclusion bodies wheres not found in norml shrimp. Morphologicl chnges of clinicl symptoms in WSSV infected shrimp showed reddish color chnge (discolourtion) on body, swimming legs, nd til while the color of body, the swimming legs, nd til of norml shrimp were pure white. In Empty intestine nd yellowish (ple) heptopncres were found in WSSV infected shrimp while the intestine is full nd the color of heptopncresis brownish-blck in norml shrimp. It ws concluded tht the best solvent for extrction G. verrucos with ethyl cette nd 4 g/kg dose of G. verrucos extrct to enhnce immune response nd resistnce to WSSV infection. Moreover, the durtion of G. verrucos extrct dministrtion for 2 weeks (every 7 dys) gve the best result on production performnce nd immune response on white shrimp. Keywords: Grcilri verrucos, immunostimulnt, seweed, white shrimp, WSSV

8 Hk Cipt Milik IPB, Thun 2017 Hk Cipt Dilindungi Undng-Undng Dilrng mengutip sebgin tu seluruh kry tulis ini tnp mencntumkn tu menyebutkn sumberny. Pengutipn hny untuk kepentingn pendidikn, penelitin, penulisn kry ilmih, penyusunn lporn, penulisn kritik, tu tinjun sutu mslh; dn pengutipn tersebut tidk merugikn kepentingn IPB Dilrng mengumumkn dn memperbnyk sebgin tu seluruh kry tulis ini dlm bentuk p pun tnp izin IPB

9 EKSTRAK RUMPUT LAUT Grcilri verrucos SEBAGAI IMUNOSTIMULAN UNTUK MELAWAN WHITE SPOT PADA UDANG VANAME Litopeneus vnnmei AMINATUL ZAHRA Tesis sebgi slh stu syrt untuk memperoleh gelr Mgister Sins pd Progrm Studi Ilmu Akukultur SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2017

10 Penguji Lur Komisi pd Ujin Tesis: Dr Ir Mi Setiwti, M Si

11

12 PRAKATA Puji dn syukur penulis ucpkn kehdirt Allh SWT, kren ts berkt dn ksihny penulis dpt menyelesikn kry ilmih dengn judul Ekstrk Rumput Lut Grcilri verrucos sebgi Imunostimuln untuk Melwn White Spot pd Udng Vnme Litopeneus vnnmei. Kry ilmih ini dijukn sebgi slh stu syrt untuk memperoleh gelr Mgister Sins. Terim ksih kepd Bpk Dr Ir Sukend, MSc dn Ibu Dr Dinmell Whjuningrum, S.Si M.Si selku komisi pembimbing yng sudh memberikn srn dn rhn hingg selesiny kry imih ini. Terim ksih jug diucpkn kepd Ibu Dr Ir Mi Setiwti, M Si selku penguji lur komisi dn Ibu Dr Ir Widnrni, M Si selku ketu progrm studi Ilmu Akukultur. Terim ksih penulis ucpkn kepd Ayhnd Drs. Siri Btubr dn Ibund Erisd Lubis besert seluruh kelurg besr yng sudh memberikn do, nseht, dn motivsi dlm menyelesikn studi ini. Ungkpn terim ksih jug diucpkn kepd seluruh pihk, terkhusus temn-temn AKU 2014 yng tidk dpt penulis sebutkn nmny stu perstu yng telh bnyk membntu hingg selesiny kry imih ini. Semog kry ilmih ini bermnft. Bogor, Februri 2017 Amintul Zhr

13 DAFTAR ISI DAFTAR TABEL DAFTAR GAMBAR 1 PENDAHULUAN 1 Ltr Belkng 1 Perumusn Mslh 2 Tujun Penelitin 3 Mnft Penelitin 3 2 BAHAN DAN METODE 3 Wktu dn Tempt 3 Mteri Uji 3 Rncngn Penelitin 4 Prosedur Penelitin 4 Prmeter Pengmtn 6 Anlisis Dt 8 3 HASIL DAN PEMBAHASAN 9 Hsil 9 Pembhsn 21 4 SIMPULAN DAN SARAN 26 Simpuln 26 Srn 26 DAFTAR PUSTAKA 27 LAMPIRAN 30 RIWAYAT HIDUP 32 vi vi

14 DAFTAR TABEL 1 Hsil uji kuntitif fitokimi ekstrk G. verrucos 9 2 Kinerj produksi udng (L. vnnmei) 20 DAFTAR GAMBAR 1 Totl hemosit (THC) udng (L. vnnmei) sebelum uji tntng (khir perlkun pemberin ekstrk) dn setelh uji tntng 10 2 Aktifits fgositosis udng (L. vnnmei) sebelum uji tntng (khir perlkun pemberin ekstrk) dn setelh uji tntng 10 3 Aktifits phenoloksidse (PO) udng (L. vnnmei) sebelum uji tntng (khir perlkun pemberin ekstrk) dn setelh uji tntng 11 4 Respirtory burst udng (L. vnnmei) sebelum uji tntng (khir perlkun pemberin ekstrk) dn setelh uji tntng 12 5 Sel hilin udng (L. vnnmei) sebelum uji tntng (khir perlkun pemberin ekstrk) dn setelh uji tntng 12 6 Sel grnulr udng (L. vnnmei) sebelum uji tntng (khir perlkun pemberin ekstrk) dn setelh uji tntng 13 7 Kelulushidupn udng (L. vnnmei) sebelum uji tntng (khir perlkun pemberin ekstrk) dn setelh uji tntng 13 8 Gejl klinis pd udng vnme setelh uji tntng dengn WSSV 14 9 Histologi udng setelh uji tntng WSSV Anlisis nested PCR Totl hemosit (THC) udng (L. vnnmei) sebelum uji tntng (khir perlkun pemberin ekstrk) dn setelh uji tntng Aktifits fgositosis udng (L. vnnmei) sebelum uji tntng (khir perlkun pemberin ekstrk) dn setelh uji tntng Aktifits phenoloksidse (PO) udng (L. vnnmei) sebelum uji tntng (khir perlkun pemberin ekstrk) dn setelh uji tntng Respirtory burst udng (L. vnnmei) sebelum uji tntng (khir perlkun pemberin ekstrk) dn setelh uji tntng Sel hilin udng (L. vnnmei) sebelum uji tntng (khir perlkun pemberin ekstrk) dn setelh uji tntng Sel grnulr udng (L. vnnmei) sebelum uji tntng (khir perlkun pemberin ekstrk) dn setelh uji tntng Kelulushidupn udng (L. vnnmei) sebelum uji tntng (khir perlkun pemberin ekstrk) dn setelh uji tntng Konfirmsi WSSV dengn nested PCR 20

15 1 PENDAHULUAN Ltr Belkng Slh stu penykit yng menyerng udng vnme dlh penykit White Spot yng disebbkn oleh White Spot Syndrome Virus (WSSV). Virus ini dpt mengkibtkn totl kemtin 100% pd 2 smpi 10 hri penyerngn (Wng et l. 2007). Di Indonesi, WSSV menyerng udng di Jw Brt, Bnten, Bli, Lmpung, dn Sulwesi Seltn (Rukyni 2000). Slh stu upy untuk mencegh serngn WSSV pd budidy udng yng tidk memberikn dmpk kepd kesehtn konsumen dn lingkungn dlh dengn pemberin imunostimuln dri bhn lmi yng rmh lingkungn. Imunostimulsi merupkn cr untuk memperbiki fungsi sistem imun dengn menggunkn bhn yng menginduksi sistem tersebut (Brtwidjj 2006). Menurut Treves-Brown (2000) imunostimuln merupkn bhn yng bis meningktkn resistensi orgnisme terhdp infeksi ptogen. Pemberin imunostimuln secr lus dengn mksud untuk mengktifkn sistem imun non spesifik sel seperti mkrofg pd vertebrt dn hemosit pd vertebrt (Dugger dn Jory 1999). Slh stu bhn lmi yng dpt dijdikn sebgi bhn imunostimuln yng mn dn rmh lingkungn dlh rumput lut Grcilri verrucos. G.verrucos merupkn rumput lut yng memiliki komponen utm kimi berup gr dn krgenn (Angk dn Mggy 2000). G.verrucos dpt digunkn sebgi imunostimuln kren memiliki kndungn senyw poliskrid (Anggdiredj et l. 2006), yng bisny berisi glktos mupun glktn bersulft (Nidu 2000). Poliskrid tersebut memiliki sift ntivirl, ntikogulsi, ntitumor dn ktifits immunomodultory pd mmli (Cstro et l. 2006). Poliskrid dri rumput lut dpt menstimulsi sistem imun non spesifik dlm hl ini fgositosis dn ktifits respirtory burst mellui meknisme interksi molekul dengn permukn reseptor (receptor-medited). Senyw bioktif dri G.verrucos bis didptkn dengn cr ekstrksi. Dlm proses ekstrksi sutu bhn tnmn, bnyk fktor yng dpt mempengruhi kndungn senyw hsil ekstrksi dintrny jenis pelrut. Setip pelrut memiliki kepolrn yng berbed-bed sehingg kn mempengruhi bnykny senyw ktif yng terlrut dlm proses ekstrksi G.verrucos. Pelrut heksn, eter, dn kloroform digunkn untuk mengmbil senyw dengn kepolrn rendh sedngkn pelrut yng lebih polr mislny metnol, etnol dn etil sett digunkn untuk mengmbil senyw yng lebih polr (Rusdi 1990). Oleh kren itu perlu dilkukn uji bhn pelrut yng berbed, yitu etil sett, metnol, dn etnol dlm proses ekstrksi G.verrucos. Hsil uji fitokimi ekstrk ksr rumput lut G. verrucos menunjukkn kndungn senyw lkloid, flvonoid, dn steroid dlm rumput lut G.verrucos (Siregr et l. 2012). Senyw lkloid, flvonoid, dn steroid merupkn senyw bioktif yng memiliki ktifits sebgi ntivirus dn ntioksidn (Angk dn Mggy 2000). Alkloid sebgi ntioksidn telh terbukti sngt mpuh mencegh rdikl bebs, singlet oxygen species (O2), liped peroxidtion, sedngkn flvonoid memberikn efek ntioksidn dengn cr

16 2 menetrlisir rdikl bebs seperti superoxide dn hydroxyl rdicl. Steroid sebgi ntivirus mmpu menggnggu repliksi virus (Al Jber et l. 2011) Wongprsert et l. (2013) menytkn sulfted glctn yng diisolsi dri rumput lut Grcilri fisheri dengn dosis µg/ml selm 7 hri dpt meningktktkn sistem imun dn ktifits ntivirl pd udng vnme yng diinfeksi dengn WSSV. Sirirustnnun et l. (2011) menytkn bhw penmbhn Grcilri tenuistipitt pd pkn dengn dosis 0.5 hingg 2.0 g/kg selm 14 hri dpt meningktkn sistem imun pd udng vnme yng diinfeksi dengn WSSV. Menurut Jsmnindr (2009) penggunn ekstrk G. verrucos dengn dosis 50 µg/g bobot udng dlm meningktkn sistem kethnn udng vnme memberikn hsil dpt meningktkn resistensi udng vnme terhdp infeksi bkteri Vibrio hrveyi hingg 73.3% dn 2 kli pemberin (intervl 14 hri) ekstrk G. verrucos selm 30 hri pemelihrn mmpu memberikn kelngsungn hidup hingg 86.7%. Pemberin imunostimuln hrus memperhtikn dosis optiml yng digunkn (Hi 2015), kren dosis imunostimuln yng tinggi dpt menekn respons imun, dn dosis yng rendh bis kurng efektif tu tidk cukup untuk memberikn respons imun. Sehingg perlu dilkukn penelitin tentng pemberin ekstrk rumput lut G. verrucos sebgi imunostimuln pd pkn udng vnme gun menentukn dosis pemberin pkn yng tept. Dursi periode pemberin imunostimuln untuk mencpi proteksi yng optiml merupkn hl yng penting dlm pemberin imunostimuln (Couso et l. 2003). Menurut Cheng et l. (2004) pemberin imunostimuln secr berkelnjutn diperlukn untuk lebih memberikn kemmpun sistem imun dlm merespons ptogen yng msuk kedlm tubuh. Hi (2015) menytkn dosis dn lm pemberin imunostimuln pd level yng optiml hrus dipertimbngkn. Perumusn Mslh Slh stu penykit yng menyerng udng vnme dlh penykit White Spot yng disebbkn oleh WSSV. Sehingg dibutuhkn upy untuk mencegh infeksi WSSV pd udng yng efektif, slh stuny dlh dengn pemberin imunostimuln. Slh stu bhn lmi yng dpt dijdikn sebgi imunostimuln yng mn dn rmh lingkungn dlh rumput lut G. verrucos. G.verrucos memiliki kndungn berup komponen gr yng di dlmny terdpt senyw poliskrid. Poliskrid pd lg merh bisny berisi glktos mupun glktn bersulft. Senyw bioktif dri G.verrucos bis didptkn dengn cr ekstrksi. Dlm proses ekstrksi sutu bhn tnmn, bnyk fktor yng dpt mempengruhi kndungn senyw hsil ekstrksi dintrny jenis pelrut. Uji bhn pelrut yng berbed, yitu etil sett, metnol, dn etnol dlm proses ekstrksi G.verrucos perlu dilkukn. Pemberin ekstrk rumput lut G. verrucos dlm pkn dihrpkn dpt menstimulsi sistem imun udng vnme. Sehingg perlu dilkukn penelitin tentng pemberin ekstrk rumput lut G.verrucos sebgi imunostimuln pd pkn udng vnme gun menentukn dosis dn lm pemberin pkn yng tept.

17 3 Tujun Penelitin Penelitin ini bertujun untuk: 1 Menguji jenis pelrut yng berbed dlm ekstrksi G. verrucos untuk mendptkn kndungn senyw bioktif yg lebih bnyk 2 Menentukn dosis ekstrk G. verrucos dlm pkn yng tept untuk meningktkn sistem imun dn resistensi udng vnme terhdp WSSV 3 Menguji lm pemberin yng berbed dri dosis yng terbik untuk peningktn kinerj produksi dn meningktkn sistem imun sert resistensi udng vnme terhdp WSSV. Mnft Penelitin Hsil dri penelitin ini dihrpkn dpt memberikn informsi mengeni jenis pelrut yng terbik dlm ekstrksi G.verrucos, sert dosis dn lm pemberin ekstrk rumput lut G. verrucos yng terbik sebgi imunostimuln untuk peningktn kinerj produksi dn meningktkn sistem imun sert resistensi udng vnme terhdp WSSV. 2 BAHAN DAN METODE Wktu dn Tempt Penelitin ini dilksnkn pd buln Agustus 2015 smpi Oktober Anlisis fitokimi dilksnkn di Lbortorium Vicoms, Cibinong, Bogor. Pemelihrn udng uji dn nlisis respons imun dilksnkn di di Lbortorium Kesehtn Orgnisme Akutik, Deprtemen Budidy Perirn, Fkults Periknn dn Ilmu Kelutn, Institut Pertnin Bogor. Konfirmsi WSSV dengn nested PCR dilksnkn di Bli Penelitin dn Pengembngn Budidy Air Twr Bogor. Mteri Uji Udng uji yng digunkn dlh udng vnme (L. vnnmei) yng dimbil dri loksi budidy udng vnme di Bkuheni, Lmpung. Bobot udng vnme yng digunkn berukurn 6.07±0.10 g/ekor. Sebelum perlkun udng diklimtissi selm 2 minggu pd suhu 28 C dlm bk fiber. Setip kurium diisi dengn udng sebnyk 10 ekor. Imunostimuln yng digunkn dlh G. verrucos yng telh berumur 1.5 buln dikumpulkn dri loksi budidy rumput lut di Mur Gembong, Beksi. G. verrucos dipilih yng telh berumur 1.5 buln, kren pbil pnen dilkukn kurng dri umur tersebut menghsilkn rumput lut berkulits rendh, kren umur pnen rumput lut berpengruh terhdp kekutn gel, viskosits, kdr sulft, dn kdr ir pd rumput lut (Anggdiredj et l. 2006).

18 4 Rncngn Penelitin Rncngn yng digunkn pd penelitin ini dlh Rncngn Ack Lengkp (RAL). Penelitin ini terdiri ts tig thpn. Penelitin thp stu untuk menguji jenis pelrut yng terbik terdiri dri tig perlkun, yitu Perlkun EA : Etil Asett Perlkun MT : Metnol Perlkun ET : Etnol Penelitin thp du untuk menguji dosis yng tept terdiri dri enm perlkun dn msing-msing tig ulngn, yitu Kontrol (KN) : Tnp ekstrk G. verrucos Kontrol + (KP) : Tnp ekstrk G. verrucos + infeksi WSSV Perlkun D2 : Dosis ekstrk G. verrucos 2 g/kg pkn + infeksi WSSV Perlkun D3 : Dosis ekstrk G. verrucos 3 g/kg pkn + infeksi WSSV Perlkun D4 : Dosis ekstrk G. verrucos 4 g/kg pkn + infeksi WSSV Perlkun D5 : Dosis ekstrk G. verrucos 5 g/kg pkn + infeksi WSSV Penelitin thp tig untuk menguji lm pemberin yng tept terdiri dri lim perlkun dn tig ulngn, yitu Kontrol - (CN) : 0 kli pemberin/buln Kontrol + (CP) : 0 kli pemberin/buln + infeksi WSSV Perlkun W1 : 1 minggu pemberin/buln (wl pemelihrn) + infeksi WSSV Perlkun W2 : 2 minggu pemberin/buln (intervl 7 hri) + infeksi WSSV Perlkun WS : Setip hri pemberin selm sebuln+ infeksi WSSV Prosedur Penelitin Penelitin thp I Rumput lut G. verrucos dicuci dengn ir lut dn ir twr untuk menghilngkn grm dn mikroorgnisme yng menempel pd rumput lut. Alg yng telh bersih dikeringkn di udr terbuk (kering udr) tnp terken chy mthri lngsung. Selnjutny smpel yng sudh kering digiling hlus dn diyk menggunkn sringn hlus (60 mesh size). Rumput lut yng sudh hlus dicmpur dlm pelrut. Ekstrksi dilkukn dengn menmbhkn pelrut sesui dengn perlkun dengn perbndingn 1:5 (w/v), kemudin dimsersi selm 24 jm, diendpkn dn kemudin disring. Filtrt yng diperoleh diupkn dengn menggunkn vcum rotry evportor pd suhu 50 o C hingg diperoleh ekstrk kentl. Ekstrk G. verrucos yng didptkn kemudin diuji kndungn sulft glktn dn uji fitokiminy secr kulittif dn kuntittif untuk mengethui bhn bioktif yng terkndung di dlmny. Untuk kegitn ekstrksi selnjutny, pelrut yng digunkn dlh pelrut yng memiliki kndungn bioktif pling bnyk diekstrk dengn pelrut tersebut. Penelitin thp II Persipn Wdh Wdh yng digunkn pd penelitin ini dlh 18 kurium dengn ukurn 60x30x30 cm 3 yng dilengkpi dengn ertor, selng dn btu ersi.

19 Sebelum digunkn kurium disterilissi menggunkn kporit sebnyk 100 ppm selm 24 jm, kemudin dibils dengn ir bersih dn dikeringkn. Selnjutny diisi dengn ir lut yng sudh diendpkn selm 24 jm dengn ketinggin ir 20 cm, dn diersi selm 24 jm. Pembutn Pkn Uji Ekstrk G.verrucos berdsrkn dosis perlkun yng telh ditentukn dilrutkn terlebih dhulu dlm 98 ml kudes steril yng sebelumny telh ditmbhkn putih telur sebnyk 2 g sebgi binder. Lrutn tersebut dicmpurkn secr mert ke dlm pkn udng komersil yng telh disipkn. Pkn dikeringkn menggunkn oven pd suhu 37 C. Pemelihrn Udng Udng diberi pkn perlkun t stition sesui dengn perlkun, 3 kli sehri. Udng dipelihr selm 14 hri dn uji tntng dilkukn pd hri ke-15. Setelh uji tntng, pkn yng diberikn dlh pkn komersil bis (tnp ekstrk). Kulits ir selm ms pemelihrn diperthnkn pd suhu 29 smpi 30 C, ph 7.8 smpi 8.3; oksigen terlrut 5.8 smpi 7.2 ppm, slinits 24 smpi 25 ppt, dn TAN 0.11 smpi 0.19 ppm. Adpun persyrtn kulits ir pemelihrn udng vnme sesui dengn Boyd (1990) dlh suhu 28 smpi 30 C, ph 8.0 smpi 9.0, oksigen terlrut 6.0 smpi 10.0 ppm, slinits 15 smpi 25 ppt, dn TAN 1 ppm. Uji Tntng WSSV Uji tntng WSSV pd udng vnme dilkukn secr injeksi. Udng yng digunkn untuk menginfeksi dlh udng yng telh terinfeksi oleh WSSV dn memperlihtkn gejl klinis dny bintik putih pd permukn krps udng yng sebelumny telh dilkukn konfirmsi menggunkn nested PCR (Polymerse Chin Rection). Sebnyk 1 grm orgn udng yng terinfeksi WSSV digerus smpi hlus dn dilrutkn dlm 9 ml PBS (Phosft Buffer Sline), kemudin disentrifuse dengn keceptn 3000 rpm selm 30 menit dn 8000 rpm selm 20 menit. Superntn yng dihsilkn disring dengn kerts miliphore 0.45 μm menggunkn filter holder dn syringe (Hmeed et l. 1998). Uji penulrn WSSV dilkukn mellui injeksi secr intrmuskulr pd segmen ketig bdomen dengn 0.1 ml lrutn virus yng diencerkn smpi 10-3 dengn PBS. Udng kontrol negtif diinjeksi dengn PBS (Yo et l. 2015). Pengmbiln Hemolim Sebnyk 0.6 ml hemolim dimbil dri pngkl kki renng, menggunkn syringe 1 ml berisi 0.4 ml ntikoguln N-sitrt, kemudin dihomogenkn dengn cr menggerkkn tngn membentuk ngk delpn selm 5 menit. Pengmbiln hemolim untuk pengukurn prmeter imun, yitu totl hemosit (THC), diferensil hemosit (DHC), ktifits fgositosis, ktifits phenoloksidse (PO), dn respirtory burst (RB). Pengumpuln dt prmeter dilkukn dengn mengmbil hemolim dri setip ulngn st prperlkun, setelh perlkun, dn setelh uji tntng. 5

20 6 Penelitin Thp III Prosedur penelitin pd thp III sm dengn prosedur thp II pd persipn wdh dn hewn uji, sert pembutn pkn uji. Dosis ekstrk yng digunkn dlm eksperimen ini yitu dosis terbik dlm meningktkn imunits udng dn kethnn terhdp infeksi WSSV. Udng dipelihr selm 28 hri dn diuji tntng pd hri ke-29 sesui dengn prosedur pd thp II. Setelh uji tntng, pkn yng diberikn dlh pkn komersil bis (tnp ekstrk). Pengmbiln hemolim sesui prosedur pd penelitin thp II. Prmeter Pengmtn Konfirmsi Keberdn WSSV Menggunkn nested PCR Pemeriksn virus dengn metode nested PCR dilkukn gun mengkonfirmsi keberdn virus WSSV pd udng vnme setelh diinfeksi dri setip ulngn menggunkn metode Kimur et l. (1996). Histoptologi Histoptologi dimbil dri jringn heptopnkres udng pd setip khir pengmtn setelh infeksi. Smpel udng digunkn dimbil dri perlkun KP dn KN (msing- msing 2 ekor) untuk mengethui tingkt keruskn jringn yng terjdi kibt WSSV dn pengruh perlkun yng diberikn. Heptopnkres yng dimbil dri udng uji difikssi terlebih dhulu dengn lrutn fikstif Dvidson miniml stu hri. Kemudin orgn dipotong 3 smpi 5 mm dn 1x1 cm, selnjutny dilkukn dehidrsi, clering, impregnsi, embedding, dn blocking prrfin. Block jringn selnjutny diiris menggunkn mikrotom 5 µm dn diwrni dengn hemtoxylin-eosin. Totl Hemosit Totl hemosit dihitung sesui metode Liu dn Chen Stu tetes lrutn hemolim diletkkn pd hemocytometer dn jumlh sel per ml dihitung. 1 Totl Hemosit = sel terhitung x x Fktor pengencer Volume kotk besr Diferensil Hemosit Diferensil Hemosit dihitung sesui metode Sung et l Dihitung dengn cr: hemolim diteteskn pd gels objek dn dibut ulsn, dikeringkn dn difikssi dengn metnol selm 5 menit. Kemudin dikering nginkn dn diwrni dengn lrutn giems selm 10 menit, dicuci dengn ir menglir dn dibirkn kering. Ulsn kemudin diperiks di bwh mikroskop dengn pembesrn 100 kli. Diferensil hemosit dihitung berdsrkn persentse jenis sel hemosit. Persentse jenis sel hemosit = Jumlh tip jenis hemosit Totl hemosit x 100 Aktifits Fgositosis Hemolim udng dimsukkn sebnyk 0.1 ml ke dlm mikroplte dn dicmpur secr mert dengn 25 µl bkteri Stphylococcus ureus dn diinkubsi selm 20 menit. Kemudin sebnyk 5 µl diteteskn pd objek glss dn dibut preprt uls. Selnjutny difikssi dengn Metnol 100% selm 5

21 menit dn diwrni dengn Giems (10%) selm 15 menit. Aktifits fgositosis diukur berdsrkn presentse sel-sel fgosit yng menunjukkn proses fgositosis (Anderson dn Siwicki 1993). Aktifits Fgositik (%) = Jumlh sel fgosit yng melkukn fgositosis Jumlh sel fgosit x 100 Aktifits Phenoloksidse (PO) Untuk mengukur ktifits phenoloksidse secr spektrofotometer oleh perekmn pembentukn dopchrome yng dihsilkn dri L- dihydroxyphenyllnine (L-DOPA) (Liu dn Chen 2004), hemolim yng diencerkn disentrifugsi pd 700 g pd 4 o C selm 20 menit; cirn superntnt dibung dn pellet dibils, disuspensikn kembli secr perlhn dlm ccodylte-citrte buffer (0.01 M sodium ccodylte, 0.45 M sodium chloride, 0.10 M trisodium citrte, ph 7.0) dn disentrifugsi ulng. Pellet kemudin diresuspended dengn 200 µl ccodylte buffer (0.01 M sodium ccodylte, 0.45 M sodium chloride, 0.01 M clcium chloride, 0.26 M mgnesium chloride, ph 7 dn 100 µl liqout diinkubsi dengn 50 µl trypsin (1 mg/ml) sebgi ktivtor selm 10 menit pd 25 smpi 26 o C, 50 µl L-DOPA ditmbhkn, diikuti oleh 800 µl ccodylte buffer 5 menit kemudin. Opticl density pd 490 nm diukur menggunkn spektrofotometer Hitchi U Opticl density ktifits phenoloksidse udng diekspresikn sebgi pembentukn dopchrome dlm 50 µl hemolim. Respirtory Burst (RB) Respirtory burst dri hemosit diukur berdsrkn reduksi NBT (nitroblue tetrzolium) sebgi ukurn superoxide nion (O 2 - ) (Cheng et l. 2004). Sebnyk 50 µl cmpurn hemolim-ntikoguln diinkubsi selm 30 menit dlm suhu rung. Selnjutny disentrifugsi dengn keceptn 3000 rpm selm 20 menit dn superntn dibung. Ditmbhkn 100 µl NBT dlm lrutn HBSS (hnk's buffered sltsolution dengn konsentrsi 0.3%) dn didimkn selm 2 jm pd suhu rung. Kemudin disentrifugsi 3000 rpm selm 10 menit, superntn dibung dn ditmbhkn 100 µl metnol bsolut untuk selnjutny disentrifugsi 3000 rpm selm 10 menit (superntn dibung). Pelet yng terbentuk kemudin dibils sebnyk 2 kli dengn metnol 70%. Selnjutny 120 µl KOH (2M) dn 140 µl DMSO (dimethylsulfoxide) ditmbhkn untuk melrutkn pelet. Pelet yng lrut kemudin dimsukkn ke dlm microplte untuk diukur densits optikl (OD) menggunkn microplte reder pd pnjng gelombng 630 nm. Respirtory burst dinytkn sebgi reduksi NBT per 10 µl hemolim. Gejl Klinis Pengmtn gejl klinis dimti secr visul setip hri setelh uji tntng hingg khir pemelihrn. Gejl klinis yng dimti (semu perlkun) yitu respons mkn, kemerhn pd tubuh (perubhn wrn tubuh), bintik putih pd krps selm pemelihrn (Wng et l. 1998; Lightner 1996; Hmeed et l. 1998). 7

22 8 Kelulushidupn Kelulushidupn dihitung sebelum uji tntng dn 9 hri setelh uji tntng dengn rumus yng digunkn dlm Dniels et l. (2010): KH (%) = Nt x 100 No Keterngn: KH : Kelulushidupn (%) Nt : Jumlh udng hidup pd khir penelitin (ekor) No : Jumlh udng hidup pd wl penelitin (ekor) Lju Pertumbuhn Hrin Lju pertumbuhn hrin (LPH) dihitung setelh 30 hri perlkun dengn rumus yng digunkn dlm Dniels et l. (2010): ln Wt ln Wo LPH (%) = x 100 t Keterngn: LPH : Lju pertumbuhn hrin (%) Wt : Bobot rt-rt udng pd khir penelitin (g) Wo : Bobot rt-rt udng pd wl penelitin (g) t : Periode penelitin (hri) Rsio Konversi Pkn Rsio konversi pkn tu feed conversion rtio (FCR) dihitung setelh pemelihrn dengn rumus yng digunkn dlm Dniels et l.(2010): FCR = Bt Bo Keterngn : FCR : Konversi pkn F : Jumlh pkn Bt : Biomss udng khir penelitin (g) Bo : Biomss udng wl penelitin (g) F Anlisis Dt Anlisis dt dilkukn dengn du metode yitu nlisis rgm (nlysis of vrince/anova) pd selng kepercyn 95% (α=0,05) dn nlisis deskriptif. ANOVA digunkn untuk nlisis dt totl hemosit, ktifits fgositosis, diferensil hemosit, ktifits phenoloksidse, respirtory burst, kelulushidupn, lju pertumbuhn spesifik, dn rsio konversi pkn. Apbil terdpt perbedn ntr perlkun mk nlisis dilnjutkn dengn uji Duncn menggunkn softwre SPSS 17. Sedngkn nlisis deskriptif digunkn untuk nlisis dt nested PCR, histoptologi, dn gejl klinis.

23 9 3 HASIL DAN PEMBAHASAN Hsil Hsil penelitin msing-msing thp, yitu penelitin thp stu, du, dn tig disjikn sebgi berikut: Penelitin thp I Senyw bhn ktif pling bnyk seperti phenol, vnilin, phytol, ester, sulft, dn glktos pd G. verrucos terdpt pd perlkun bhn pelrut etil sett. Hsil uji kuntittif fitokimi ekstrk G. verrucos disjikn pd Tbel 1. Tbel 1 Hsil uji kuntittif fitokimi ekstrk G. verrucos Jenis Bhn Aktif Hsil Anlisis (ml/l) Etil Asett Metnol Etnol Metode Phenol HPLC Vnilin HPLC Phytol HPLC Ester HPLC Kndungn Sulft Spektrofotometri Kndungn Glktos HPLC Penelitin thp II Prmeter uji yng diukur pd penelitin thp du, yitu respons imun dn konfirmsi WSSV disjikn pd hsil berikut. Respons Imun Respons imun (totl hemosit, diferensil hemosit, ktifits fgositosis, ktifits phenoloksidse, dn respirtory burst) yng diukur pd wl, sebelum, dn setelh uji tntng WSSV disjikn pd hsil berikut. Totl Hemosit Totl hemosit setelh pemberin pkn ekstrk G. verrucos menglmi peningktn pd perlkun D2, D3, D4, dn D5 yng berbed signifikn (P<0.05) dibndingkn dengn kontrol. Totl hemosit tertinggi setelh pemberin ekstrk pd perlkun D4 dn berbed signifikn (P<0.05) dengn semu perlkun. Totl hemosit setelh uji tntng WSSV lebih tinggi secr signifikn (P<0.05) pd perlkun D2, D3, dn D4 dibndingkn dengn kontrol, tetpi pd perlkun D5 tidk berbed signifikn (P>0.05) dengn KP. Totl hemosit pd wl, sebelum, dn setelh uji tntng disjikn pd Gmbr 1.

24 10 Totl hemosit (10 3 sel/ mm 3 ) d d cd bc c c b b Awl Sebelum uji tntng Setelh uji tntng KN KP D2 D3 D4 D5 Wktu Pengmtn Gmbr 1 Totl hemosit (THC) udng (L. vnnmei) pd wl, sebelum uji tntng (khir perlkun pemberin ekstrk), dn setelh uji tntng. Huruf berbed di ts setip br menunjukkn berbed signifikn (P<0.05) ntr perlkun. Keterngn: KN: kontrol negtif; KP: kontrol positif; D2: pemberin ekstrk 2 g/kg pkn; D3: pemberin ekstrk 3 g/kg pkn; D4: pemberin ekstrk 4 g/kg pkn; D5: pemberin ekstrk 5 g/kg pkn. Aktifits Fgositosis Aktifits fgositosis sebelum uji tntng pd perlkun D2, D3, D4, dn D5 berbed signifikn (P<0.05) dengn kontrol. Aktifits fgositosis setelh uji tntng WSSV pd perlkun D2, D3, dn D4 berbed signifikn (P<0.05) dengn kontrol, sedngkn perlkun D5 tidk berbed signifikn (P>0.05) dengn kontrol. Aktifits fgositosis perlkun D4 bik sebelum dn setelh uji tntng WSSV pling tinggi secr signifikn (P<0.05) dibndingkn dengn perlkun linny. Aktifits fgositosis pd wl, sebelum, dn setelh uji tntng disjikn pd Gmbr 2. Aktivits fgositosis (%) bc Gmbr 2 Aktifits fgositosis udng (L. vnnmei) pd wl, sebelum uji tntng (khir perlkun pemberin ekstrk), dn setelh uji tntng. Huruf berbed di ts setip br dn wktu pengmtn yng sm menunjukkn berbed signifikn (P<0.05) ntr perlkun. Keterngn: KN: kontrol negtif; KP: kontrol positif; D2: pemberin ekstrk 2 g/kg pkn; D3: pemberin ekstrk 3 g/kg pkn; D4: pemberin ekstrk 4 g/kg pkn; D5: pemberin ekstrk 5 g/kg pkn. c Awl Sebelum uji tntng Setelh uji tntng d b Wktu Pengmtn b c c d b KN KP D2 D3 D4 D5

25 Aktifits Phenoloksidse (PO) Aktifits phenoloksidse menglmi peningktn sebelum mupun setelh uji tntng. Aktifits phenoloksidse pd perlkun D2, D3, dn D4 berbed signifikn (P<0.05) dibndingkn dengn kontrol pd sebelum dn setelh uji tntng, sedngkn pd perlkun D5 tidk berbed signifikn (P>0.05) dengn KP. Aktifits phenoloksidse pling tinggi bik sebelum dn setelh uji tntng dlh pd perlkun D4 yng berbed signifikn (P<0.05) dengn perlkun linny. Aktifits phenoloksidse pd wl, sebelum, dn setelh uji tntng disjikn pd Gmbr 3. Phenoloksidse O.D. 490 nm 0,250 0,200 0,150 0,100 0,050 0,000 bc Gmbr 3 Aktifits phenoloksidse (PO) udng (L. vnnmei) pd wl, sebelum uji tntng (khir perlkun pemberin ekstrk), dn setelh uji tntng. Huruf berbed di ts setip br dn wktu pengmtn yng sm menunjukkn berbed signifikn (P<0.05) ntr perlkun. Keterngn: KN: kontrol negtif; KP: kontrol positif; D2: pemberin ekstrk 2 g/kg pkn; D3: pemberin ekstrk 3 g/kg pkn; D4: pemberin ekstrk 4 g/kg pkn; D5: pemberin ekstrk 5 g/kg pkn. Respirtory Burst (RB) Respirtory burst setelh dn sebelum uji tntng menglmi peningktn dibndingkn pd wl pengukurn. Respirtory burst pd perlkun D2, D3, D4, dn D5 sebelum dn setelh uji tntng berbed signifikn (P<0.05) dengn kontrol. Respirtory burst memiliki nili tertinggi pd perlkun D4, dimn sebelum dn setelh uji tntng berbed signifikn (P<0.05) dengn kontrol dn perlkun D5, sedngkn dengn perlkun D2 dn D3 tidk berbed signifikn (P>0.05). Respirtory burst pd wl, sebelum, dn setelh uji tntng disjikn pd Gmbr 4. c Awl Sebelum uji tntng Setelh uji tntng d b Wktu Pengmtn b c c d b KN KP D2 D3 D4 D5 11

26 12 Respirtory burst O.D. 630 nm 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 bc c c bc bc bc b b Awl Sebelum uji tntng Setelh uji tntng KN KP D2 D3 D4 D5 Wktu Pengmtn Gmbr 4 Respirtory burst udng (L. vnnmei) pd wl, sebelum uji tntng (khir perlkun pemberin ekstrk), dn setelh uji tntng. Huruf berbed di ts setip br dn wktu pengmtn yng sm menunjukkn berbed signifikn (P<0.05) ntr perlkun. Keterngn: KN: kontrol negtif; KP: kontrol positif; D2: pemberin ekstrk 2 g/kg pkn; D3: pemberin ekstrk 3 g/kg pkn; D4: pemberin ekstrk 4 g/kg pkn; D5: pemberin ekstrk 5 g/kg pkn. Diferensil Hemosit (DHC) Diferensil hemosit yng dihitung pd penelitin ini dlh sel hilin dn grnulr. Persentsi sel hilin sebelum uji tntng menglmi peningktn pd semu perlkun, perlkun D3 dn D4 lebih tinggi signifikn (P<0.05) dibndingkn dengn kontrol dn perlkun D5, sedngkn perlkun D2 tidk berbed signifikn (P>0.05) dengn kontrol. Persentsi sel hilin setelh uji tntng pd perlkun D2, D3, dn D4 berbed signifikn (P<0.05) dengn kontrol. Persentsi sel hilin pd wl, sebelum, dn setelh uji tntng disjikn pd Gmbr 5. Hylin (%) 60,00 50,00 40,00 30,00 20,00 10,00 0,00 b b b Gmbr 5 Sel hilin udng (L. vnnmei) pd wl, sebelum uji tntng (khir perlkun pemberin ekstrk), dn setelh uji tntng. Huruf berbed di ts setip br dn wktu pengmtn yng sm menunjukkn berbed signifikn (P<0.05) ntr perlkun. Keterngn: KN: kontrol negtif; KP: kontrol positif; D2: pemberin ekstrk 2 g/kg pkn; D3: pemberin ekstrk 3 g/kg pkn; D4: pemberin ekstrk 4 g/kg pkn; D5: pemberin ekstrk 5 g/kg pkn. b b bc c bc Awl Sebelum uji tntng Setelh uji tntng Wktu Pengmtn b K- K+ A B C D

27 Sel grnulr pd perlkun D3 dn D4 sebelum uji tntng tidk berbed signifikn (P>0.05) dengn perlkun D2 tetpi berbed signifikn (P<0.05) dengn kontrol dn perlkun D5. Setelh uji tntng sel grnulr pd perlkun D2, D3, dn D4 berbed signifikn (P<0.05) dengn kontrol dn perlkun D5. Persentsi sel grnulr pd wl, sebelum, dn setelh uji tntng disjikn pd Gmbr 6. Grnulr (%) b b b Gmbr 6 Sel grnulr udng (L. vnnmei) pd wl, sebelum uji tntng (khir perlkun pemberin ekstrk), dn setelh uji tntng. Huruf berbed di ts setip br dn wktu pengmtn yng sm menunjukkn berbed nyt (P<0.05) ntr perlkun. Keterngn: KN: kontrol negtif; KP: kontrol positif; D2: pemberin ekstrk 2 g/kg pkn; D3: pemberin ekstrk 3 g/kg pkn; D4: pemberin ekstrk 4 g/kg pkn; D5: pemberin ekstrk 5 g/kg pkn. Kelulushidupn Kelulushidupn udng setelh uji tntng pling tinggi pd perlkun D2, kemudin diikuti perlkun D3 dn D4 yng berbed signifikn (P<0.05) dengn kelulushidupn KP, sedngkn perlkun D5 tidk berbed signifikn (P>0.05) dengn KP. Kelulushidupn pd sebelum dn setelh uji tntng disjikn pd Gmbr 7. Kelulushidupn (%) Gmbr 7 Kelulushidupn udng (L. vnnmei) sebelum uji tntng (khir perlkun pemberin ekstrk) dn setelh uji tntng. Huruf berbed di ts setip br dn wktu pengmtn yng sm menunjukkn berbed Signifikn (P<0.05) ntr perlkun. Keterngn: KN: kontrol negtif; KP: kontrol positif; D2: pemberin ekstrk 2 g/kg pkn; D3: pemberin ekstrk 3 g/kg pkn; D4: pemberin ekstrk 4 g/kg pkn; D5: pemberin ekstrk 5 g/kg pkn. b c c bc b b Awl Sebelum uji tntng Setelh uji tntng Sebelum uji tntng Wktu Pengmtn d Wktu Pengmtn bc bc c Setelh uji tntng b KN KP D2 D3 D4 D5 KN KP D2 D3 D4 D5 13

28 14 Konfirmsi WSSV Konfirmsi WSSV dengn pengmtn gejl klinis, histologi, dn nested PCR disjikn sebgi berikut. Gejl Klinis Pengmtn gejl klinis pd penelitin ini dilkukn untuk mengmti perubhn yng terjdi kibt dny infeksi WSSV terhdp udng uji. Perubhn gejl klinis udng dimti setip hri setelh uji tntng meliputi perubhn secr morfologis dn nfsu mkn. Perubhn gejl klinis secr morfologis pd udng yng terinfeksi WSSV terjdiny perubhn wrn kemerhn (discolourtion) pd tubuh, kki renng, dn ekor sedngkn udng norml pd tubuh, kki renng, dn ekor berwrn putih bersih. Pd udng yng terinfeksi WSSV usus kosong sert heptopnkres berwrn kekuningn (puct) sedngkn pd udng norml usus penuh dn heptopnkres berwrn hitm kecokltn. Penurunn nfsu mkn pd udng terinfeksi WSSV jug terjdi pd hri pertm setelh uji tntng. Gmbrn gejl klinis pd udng disjikn pd Gmbr 8. Gmbr 8 Gejl klinis pd udng vnme setelh uji tntng dengn WSSV. (A) Udng norml dn (B) Udng terinfeksi WSSV. Histologi Histologi heptopnkres pd udng yng diinfeksi WSSV menunjukkn dny perbedn dengn udng norml. Histologi heptopnkres udng yng terinfeksi WSSV terliht dny bdn inklusi, sedngkn pd udng norml tidk terliht dny bdn inklusi (Gmbr 9). Gmbr 9 Histologi udng setelh uji tntng WSSV. (A) Histoptologi heptopnkres udng norml (KN), (B) Histoptologi heptopnkres udng yng terinfeksi WSSV (KP). Keterngn: Tnd pnh menunjukkn dny bdn inklusi.

29 Anlisis nested PCR Konfirmsi keberdn WSSV pd udng eksperimen diuji dengn menggunkn nlisis nested PCR. Smpel dikumpulkn dri perlkun yng menunjukkn gejl klinis (smpel D2, D3, D4, D5 dn KP) berup tubuh kemerhn, heptopnkres berwrn puct, dn usus kosong sert perlkun KN yng diinjeksi dengn PBS. Penelitin thp stu menunjukkn bhw 5 smpel (smpel D2, D3, D4, D5 dn KP) yng diuji positif terinfeksi WSSV, sementr perlkun KN yng diuji menunjukkn udng tidk terinfeksi WSSV. Hsil konfirmsi WSSV pd penelitin thp stu dengn nested PCR disjikn pd Gmbr 10. Primer pertm 15 Primer Kedu Gmbr 10 Konfirmsi WSSV dengn nested PCR. (1) Perlkun D2, (2) Perlkun D3, (3) Perlkun D4, (4) Perlkun D5, (5) KP, (6) KN, (7) Negtif Kontrol, (8) Positif Kontrol, (9) Mrker. Penelitin thp III Prmeter uji yng diukur pd penelitin thp tig, yitu respons imun, konfirmsi WSSV, dn kinerj produksi disjikn pd hsil berikut. Respons Imun Totl Hemosit Totl hemosit sebelum dn setelh uji tntng menunjukkn bhw pemberin ekstrk pd perlkun W1, W2, dn WS berbed signifikn (P<0.05) dengn kontrol. Perlkun W2 berbed secr signifikn (P<0.05) dengn perlkun WS tetpi tidk berbed signifikn (P>0.05) dengn perlkun W1. Totl hemosit pd wl, sebelum, dn setelh uji tntng disjikn pd Gmbr 11.

30 16 Totl hemosit (10 3 sel/ mm 3 ) 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 bc Gmbr 11 Totl hemosit (THC) udng (L. vnnmei) pd wl, sebelum uji tntng (khir perlkun pemberin ekstrk), dn setelh uji tntng. Huruf berbed di ts setip br dn wktu pengmtn yng sm menunjukkn berbed signifikn (P<0.05) ntr perlkun. Keterngn: CN: kontrol negtif; CP: kontrol positif; W1: 1 minggu pemberin/buln (wl pemelihrn); W2: 2 minggu pemberin/buln (intervl 7 hri); WS: Setip hri pemberin selm sebuln. Aktifits Fgositosis Aktifits fgositosis setelh pemberin ekstrk pd perlkun W1, W2, dn WS berbed signifikn (P<0.05) dengn kontrol. Setelh uji tntng, ktifits fgositosis pling tinggi pd perlkun WS diikuti dengn perlkun W1 dn W2 dimn berbed signifikn (P<0.05) dengn kontrol. Aktifits fgositosis pd wl, sebelum, dn setelh uji tntng disjikn pd Gmbr 12. Aktifits fgositosis (%) Gmbr 12 Aktifits fgositosis udng (L. vnnmei) pd wl, sebelum uji tntng (khir perlkun pemberin ekstrk), dn setelh uji tntng. Huruf berbed di ts setip br dn wktu pengmtn yng sm menunjukkn berbed signifikn (P<0.05) ntr perlkun. Keterngn: CN: kontrol negtif; CP: kontrol positif; W1: 1 minggu pemberin/buln (wl pemelihrn); W2: 2 minggu pemberin/buln (intervl 7 hri); WS: Setip hri pemberin selm sebuln. c Awl Sebelum uji tntng Setelh uji tntng b Wktu Pengmtn b b b Awl Sebelum uji tntng Setelh uji tntng Wktu Pengmtn b c bc d c cd b CN CP W1 W2 WS CN CP W1 W2 WS

31 Aktifits Phenoloksidse (PO) Aktifits phenoloksidse setelh pemberin ekstrk pd perlkun W1, W2, dn WS berbed signifikn (P<0.05) dengn kontrol, kemudin perlkun WS berbed signifkn (P<0.05) dengn perlkun W1 dn W2. Setelh uji tntng, ktifits phenoloksidse pling tinggi pd perlkun WS yng berbed signifikn (P<0.05) dengn perlkun linny, diikuti dengn perlkun W1 dn WS yng berbed signifikn (P<0.05) dengn kontrol. Aktifits phenoloksidse pd wl, sebelum, dn setelh uji tntng disjikn pd Gmbr 13. Phenoloksidse O.D. 490 nm 0,18 0,16 0,14 0,12 0,10 0,08 0,06 0,04 0,02 0,00 b Gmbr 13 Aktifits phenoloksidse (PO) udng (L. vnnmei) pd wl, sebelum uji tntng (khir perlkun pemberin ekstrk), dn setelh uji tntng. Huruf berbed di ts setip br dn wktu pengmtn yng sm menunjukkn berbed nyt (p<0.05) ntr perlkun. Keterngn: CN: kontrol negtif; CP: kontrol positif; W1: 1 minggu pemberin/buln (wl pemelihrn); W2: 2 minggu pemberin/buln (intervl 7 hri); WS: Setip hri pemberin selm sebuln. Respirtory Burst (RB) Lm pemberin ekstrk yng berbed memberikn pengruh yng signifikn terhdp respirtory burst, dimn setelh pemberin ekstrk selm 2 minggu memberikn hsil pling tinggi yng berbed signifikn (P<0.05) dengn perlkun linny. Respirtory burst setelh uji tntng berbed signifikn (P<0.05) ntr semu perlkun dn yng pling tinggi pemberin selm 2 minggu. Respirtory burst pd wl, sebelum, dn setelh uji tntng disjikn pd Gmbr 14. d d Awl Sebelum uji tntng Setelh uji tntng c Wktu Pengmtn b c d c CN CP W1 W2 WS 17

32 18 Respirtory burst O.D. 630 nm Gmbr 14 Respirtory burst udng (L. vnnmei) pd wl, sebelum uji tntng (khir perlkun pemberin ekstrk), dn setelh uji tntng. Huruf berbed di ts setip br menunjukkn dn wktu pengmtn yng sm berbed signifikn (P<0.05) ntr perlkun. Keterngn: CN: kontrol negtif; CP: kontrol positif; W1: 1 minggu pemberin/buln (wl pemelihrn); W2: 2 minggu pemberin/buln (intervl 7 hri); WS: Setip hri pemberin selm sebuln. Diferensil Hemosit (DHC) Lm pemberin ekstrk yng berbed memberikn pengruh signifikn terhdp persentsi sel hilin. Setelh pemberin ekstrk, persentsi sel hilin pling tinggi pd perlkun W2 dn berbed signifikn (P<0.05) dengn kontrol. Persentsi sel hilin setelh uji tntng pd perlkun W1 dn WS tidk berbed signifikn (P>0.05) dengn kontrol, tetpi pd perlkun W2 berbed signifikn (P<0.05) dengn kontrol. Persentsi sel hilin pd wl, sebelum, dn setelh uji tntng disjikn pd gmbr 15. Hilin (%) ,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 Gmbr 15 Persentsi sel hilin udng (L. vnnmei) pd wl, sebelum uji tntng (khir perlkun pemberin ekstrk), dn setelh uji tntng. Huruf berbed di ts setip br dn wktu pengmtn yng sm menunjukkn berbed nyt (p<0.05) ntr perlkun. Keterngn: CN: kontrol negtif; CP: kontrol positif; W1: 1 minggu pemberin/buln (wl pemelihrn); W2: 2 minggu pemberin/buln (intervl 7 hri); WS: Setip hri pemberin selm sebuln. b c Awl Sebelum uji tntng Setelh uji tntng Wktu Pengmtn b b b Awl Sebelum uji tntng Setelh uji tntng b Wktu Pengmtn b b b bc d c e c b CN CP W1 W2 WS CN CP W1 W2 WS

33 Persentsi sel grnulr setelh pemberin ekstrk dn uji tntng yng pling tinggi pd perlkun W2 yng berbed signifikn (P<0.05) dengn kontrol. ekstrk Persentsi sel grnulr pd wl, sebelum, dn setelh uji tntng disjikn pd Gmbr 16. Grnulr (%) Gmbr 16 Persentsi sel grnulr udng (L. vnnmei) pd wl, sebelum uji tntng (khir perlkun pemberin ekstrk), dn setelh uji tntng. Huruf berbed di ts setip br dn wktu pengmtn yng sm menunjukkn berbed nyt (p<0.05) ntr perlkun. Keterngn: CN: kontrol negtif; CP: kontrol positif; W1: 1 minggu pemberin/buln (wl pemelihrn); W2: 2 minggu pemberin/buln (intervl 7 hri); WS: Setip hri pemberin selm sebuln. Kelulushidupn Kelulushidupn pling tinggi secr signifikn (P<0.05) pd perlkun W2, kemudin diikuti dengn perlkun W1 dn WS, sedngkn kelulushidupn terendh pd CP. Kelulushidupn sebelum dn setelh uji tntng disjikn pd Gmbr 17. Kelulushidupn (%) b b Gmbr 17 Kelulushidupn udng (L. vnnmei) sebelum uji tntng (khir perlkun pemberin ekstrk) dn setelh uji tntng. Huruf berbed di ts setip br menunjukkn berbed signifikn (P<0.05) ntr perlkun. Keterngn: CN: kontrol negtif; CP: kontrol positif; W1: 1 minggu pemberin/buln (wl pemelihrn); W2: 2 minggu pemberin/buln (intervl 7 hri); WS: Setip hri pemberin selm sebuln. b Awl Sebelum uji tntng Setelh uji tntng Sebelum uji tntng b Wktu Pengmtn d Wktu Pengmtn b b bc c Setelh uji tntng c b b CN CP W1 W2 WS CN CP W1 W2 19 WS

34 20 Konfirmsi WSSV Menggunkn Nested PCR Hsil penelitin ini menunjukkn bhw 4 smpel (smpel W1, W2, W3, dn CP) yng diuji positif terinfeksi WSSV, sementr perlkun CP yng diuji menunjukkn udng tidk terinfeksi WSSV.Hsil konfirmsi WSSV pd penelitin thp du dengn nested PCR disjikn pd Gmbr 18. Primer pertm Primer Kedu Gmbr 18 Konfirmsi WSSV dengn nested PCR. (1) Perlkun W1, (2) Perlkun W2, (3) Perlkun WS, (4) CP, (5) CN, (6) Negtif Kontrol, (7) Positif Kontrol, (8) Mrker. Kinerj Produksi Lju pertumbuhn hrin dn biomss khir udng pd perlkun W2 dn WS berbed signifikn (P<0.05) dengn kontrol dn perlkun W1. Pemberin ekstrk G. verrucos tidk memberikn pengruh signifikn (P>0.05) terhdp konversi pkn. Kinerj produksi udng (lju pertumbuhn hrin, konversi pkn, dn biomss khir udng) penelitin selm 28 hri disjikn pd Tbel 2. Tbel 2 Kinerj produksi udng L. vnnmei Perlkun LPH (%) FCR Biomss (g) CN 1,20±0.08 2,06± ,20±2.02 CP 1,15±0.09 2,00± ,10±2.25 W1 1,16±0.11 2,01± ,40±2.91 W2 1,44±0.12 b 1,81± ,77±3.39 b WS 1,39±0.11 b 1,85± ,50±3.10 b Huruf superskrip yng berbed pd kolom yng sm menunjukkn pengruh perlkun yng berbed signifikn (P<0.05) ntr perlkun. Keterngn: CN: kontrol negtif; CP: kontrol positif; W1: : 1 minggu pemberin/buln (wl pemelihrn); W2: 2 minggu pemberin/buln (intervl 7 hri); WS: Setip hri pemberin selm sebuln.