EKSTRAKSI DAN PEMURNIAN PROTEASE DARI Bacillus pumiiius (Y1)

Transkripsi

1 EKSTRAKSI DAN PEMURNIAN PROTEASE DARI Bacillus pumiiius (Y1) 1994 FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR

2 Julius. F Ekstraksi dan Pemurnian Protease Dari Bacillus pumillus (Y1). Di bawah bimbingan Dr. Ir. Maggy T. Suhartono dan Ir. Sutrisno Koswara. RINGKASAN Bacillus adalah bakteri yang sangat potensial untuk dijadi kan sumber enzim protease. Bacillus yang digunakan dalam penelitian ini adalah jenis B. pumillus (Y1) yang diisolasi dari limbah cair tahu (Li kumahwa, 1993). Sedangkan penelitian ini bertujuan untuk mela- kukan ekstraksi dan pemurnian enzim protease dari B. purnillus (Y1) dengan menggunakan berbagai kolom kromatografi [DEAE (dietilaminoetil) Sephadex A-50 dan Amberlitel untuk mendapatkan enzim protease yang relatif murni. Dalam penelitian ini dilakukan fermentasi bakteri untuk menghasilkan enzim protease dalam limbah cair tahu dengan penambahan 2% skim, lalu diikuti ekstraksi enzim dengan garam ammonium sulfat 55% (w/v), besi (111) klorida, aluminium (111) klorida dan aseton dan dilarutkan kembali dalam buffer sodium sitrat, sodium ditionat dan fosfat 0.01 M ph 8.0, kemudian didialisis dalam kantung selofan. Dialisat lalu di kromatografi dalam resin penukar anion (Amberlite IRA 400 dan DEAE Sephadex A - 50) dan penukar kation (Amberlite DP-1). Fraksi-fraksi yang diperoleh, dipekatkan dengan pengeringan beku dan selanjutnya dielektroforesis dalam gel SDS-poliakrilamid. Dari hasil ekstraksi dengan berbagai macam garam pengendap (ammonium sulfat, besi (111) klorida, aluminium (111) klorida), maka

3 setelah dilarutkan kembaii hasil larutan enzim yang mempunyai aktifitas tinggi dihasilkan pada pengendapan oleh besi (111) klorida yang kernudian dilarutkan dalam buffer sitrat yaitu sebesar IU/ml, aktifitas spesifiknya IU/mg dan konsentrasi proteinnya rng/ml dan diikuti dengan ammonium sulfat (0.348 IU/ml; IU/mg; mg/ml). Sedangkan untuk pengendapan dengan peiarut organik (aseton teknis), aktifitas tertinggi didapatkan pada perbandingan aseton dengan ekstrak kasar enzim sebesar 1 : 3 yaitu IU/ml dengan konsentrasi protein mg/mi. Namun karena pertimbangan keamanan pangan oleh logam berat (Fe) yang cukup riskan dan dilihat dari segi ekonomis, maka larutan enzim yang berasal dari pengenda- pan dengan ammonium sulfatlah (0.393 IU/ml) yang dipakai untuk tahap pemurnian selanjutnya. Dari hasil penelitian pemurnian protease dari Bacillus pumillus (Yl), setelah pernisahan dengan Amberlite IRA 400 didapatkan dua kelompok gabungan fraksi-fraksi dengan aktifitas protease cukup tinggi yaitu A (fraksi nomor 2-5) dan B (fraksi nomor 11-18) dengan aktifitas masing-masing IU/ml dan IU/ml serta aktifitas spesifiknya IU/mg dan IU/mg. Konsentrasi pro- tein untuk A dan B berturut-turut adalah mg/ml dan rng/ml. Pada pemisahan dengan Amberlite DP-1 hanya didapat satu kelompok fraksi dengan aktifitas tertinggi yaitu C (fraksi nomor 2-6 dengan aktifitas protease 0.194, aktifitas spesifik IU/mg, konsentrasi protein mg/ml). Sedangkan untuk DEAE Sephadex A - 50 didapatkan dua kelompok gabungan fraksi-fraksi yaitu E (nomor 6-15) dan G (nomor 22-24) dengan aktifitas protease IU/ml; aktifitas spesifik IU/mg; konsentrasi protein mg/ml dan

4 0.131 IU/ml; IU/mg; rng/ml. Untuk kelipatan pemurnian, niiai terbesar didapat pada pemur- nian dengan resin DEAE Sephadex A - 50 (sebesar kali) kernudian Arnberiite penukar anion (IRA 400) (sebesar kali) dan Arnberlite penukar kation (DP-1) (1.9 kali). Dari perhitungan hasil elektroforesis, untuk fraksi A didapat- kan perkiraan berat rnolekul enzim adalah Dalton; fraksi 6 didapat dua pita dengan perkiraan berat rnolekul enzimnya Dalton dan Dalton. Untuk fraksi C tidak dapat ditentukan berat rnolekul aproksimatnya karena pita yang dihasilkan dari elektro- foresis tidak cukup jelas terlihat. Sedangkan untuk fraksi E dan G didapat dua pita dengan berat moiekul dugaannya Dalton dan Dalton.

5 INSTITUT PERTANIAN BOGOR FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN EKSTRAKSI DAN PEMURNIAN PROTEASE DARI Bacillus purnillus (Y1 ) SKRIPSI sebagai salah satu syarat untuk mernperoleh gelar SARJANA TEKNOLOGI PERTANIAN pada Jurusan Teknologi Pangan dan Gizi Fakultas Teknologi Pertanian Institut Pertanian Bogor Oleh J U L I U S F JURUSAN TEKNOLOGI PANGAN DAN GIZI FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR

6 INSTITUT PERTANIAN BOGOR FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN EKSTRAKSI DAN PEMURNIAN PROTEASE DARI Bacillus pumillus (Y1 ) SKRIPSI sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar SARJANA TEKNOLOGI PERTANIAN pada Jurusan Teknologi Pangan dan Gizi Fakultas Teknologi Pertanian Institut Pertanian Bogor Oleh J U L I U S F Disetujui, Bogor, September ?/,p-.-r i A/'.& Dr. Ir. M&y T. Suhartono Dosen Pembirnbing I Dosen Pembirnbing I1

7 KATA PENGANTAR Puji syukur kepada Tuhan Yang Maha Kasih, karena berkat karunia-nyalah penulis dapat rnenyelesaikan penulisan skripsi ini dengan baik dan tepat pada waktunya. Dengan tersusunnya laporan ini, rnaka penulis hendak rnengha- turkan terirna kasih kepada : 1. Ibu Dr. Ir. Maggy Thenawijaya Suhartono, selaku dosen pernbirnbing I dan Bapak Ir. Sutrisno Koswara selaku dosen pernbirnbing 11, yang telah rnernberi kan bantuan dan pengarahan selarna berlangsungn ya penelitian dan proses penyusunan skripsi, serta atas kesediaannya rnenjadi dosen penguji I dan Bapak Ir. Feri K. yang telah bersedia untuk menjadi dosen penguji I11 pada ujian skripsi. 3. Yang kukasihi di Jakarta, Ibu, Ayah, Saudara-saudaraku dan Rok kida yang telah rnernberi kan kasi h sayang, dorongan, sernangat dan bantuan baik rnoril dan rnateriil. 4. Sernua ternan-ternan se-lab dan para laboran (Pak Putu "you're the most", Junaidi, Marcella, Mardi, Agus, Lili, Ricki, Kang Yaya, Ibu Eni, Ibu Ika, Pak Angga, Pak Ujang dan lain-lain) yang telah rnernberi kan banyak bantuan dan suasana kerja yang rnenyenangkan. 5. Sernua ternan-ternanku di Bogor, Narto Sunarno, Evi Wiratma, Ong Hui Yung, Elingsari, Fiametta, Grace, St. Agung

8 8 I N., Suciono, Durrnan, Herijanto dan lain-lain yang telah memberi kan arti sebuah persahabatan. 6. Semua pihak yang turut pula rnernbantu penulis daiarn rnenyeiesai kan penyusunan laporan ini. Penulis menyadari bahwa dalam pelaksanaan rnaupun daiarn penyusunan skripsi ini masih jauh dari sernpurna dan tidak lepas dari kesalahan, sehingga kritik dan saran untuk kesempurnaan iaporan ini sangat diharapkan. Akhirnya, semoga tuiisan ini dapat rnemberi kan manfaat bagi yang rnembutuhkannya. Bogor, September 1994 Penulis,

9 DAFTAR IS1 KATA PENGANTAR... i DAFTAR IS1... iii DAFTAR GAMBAR... vi DAFTAR TABEL... vii DAFTAR LAMPIRAN... viii... I. PENDAHULUAN 1 I1 A. LATAR BELAKANG... 1 B. TUJUAN TINJAUAN PUSTAKA... 4 A. PROTEASE MIKROBA... 4 B. PROTEASE Baci77us pumi77us... 6 C. EKSTRAKSI DAN PEMURNIAN... 7 D. ELEKTROFORESIS I11. METODA PENELITIAN A. BAHAN DAN ALAT BAHAN ALAT METODA PENELITIAN PRODUKSI ENZIM a. Produksi Inokulum b. Produksi Enzirn PEMURNIAN ENZIM a. Pengendapan dengan berbagai pereaksi.. 21 b. Dialisis... 22

10 c. Kromatografi... Persiapan kolom DEAE Seahadex A-50.. Persiapan kolom Amberlite oenukar anion dan kation... d. Elektroforesis... Persiapan Sampel (Hames, 1987)... Persiapan buffer reservoir (Sigma,1988)... Pembuatan Gel elektroforesis SDS (10%) (Hames, 1987)... Pewarnaan (Staininq) dan penghilangan warna (destainingl (Sigma, 1988)... Mo 7ecu7ar marker (Sigma, 1988) ANALISIS... a. Pengukuran jumlah protein... b. Pengujian aktifitas protease... IV. HASIL DAN PEMBAHASAN... A. Pemurnian Enzim Protease Dengan Kolom Amberlite Penukar Anion... B. Pemurnian Enzim Protease Dengan Kolom Amberlite Penukar Kation... C. Pemurnian Enzim Protease Dengan Kolom DEAE Sephadex A

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

27

28

29

30

31

32

33

34

35

36

37

38

39

40

41

42

43

44

45

46

47

48

49

50

51

52

53

54

55

56

57

58

59

60

61

62

63

64

65

66

67

68

69

70

71

72

73

74

75

76

77

78

79

80

81

82