Lampiran 1 Rancangan penelitian

Transkripsi

1 LAMPIRAN 18

2 19 Lampiran 1 Rancangan penelitian Cacing tanah E. foetida dewasa Kering oven vakum (Setiawan) Tepung cacing kering Ekstraksi buffer dan sentrifugasi Ekstrak kasar protease Salting-out dengan amonium sulfat Pengukuran bobot molekul (SDS-PAGE metode Laemmli 1970) Konsentrasi protein (Bradford 1976) Presipitat Dialisis Dialisat Kromatografi kolom Aktivitas enzim dengan pengaruh suhu, ph, waktu inkubasi (Jackson 1988) Spesifisitas substrat secara spektrofotometri Eluat

3 20 Lampiran 2 Daftar faktor pembekuan darah Faktor Pembekuan Keterangan Faktor I Fibrinogen Faktor II Protrombin Faktor III Tromoboplastin jaringan (faktor jaringan) Faktor IV Ion kalsium (Ca 2+ ) Faktor V Faktor labil (proaccelerin) Faktor VI Belum didefinisikan* Faktor VII Faktor stabil (serum prothrombin conversion accelerator (SPCA) proconvertin) Faktor VIII Faktor antipembekuan darah, faktor VIII:C (protein pembekuan darah) Faktor IX Faktor Christmas (plasma thromboplastin component (PTC), faktor B antihemofilia) Faktor X Faktor Stuart-Prower Faktor XI Plasma thromboplastin antecedent (PTA) Faktor XII Faktor Hageman (faktor kontak) Faktor XIII Fibrin-stabilizing factor (FSF) Faktor Fitzgerald High-molecular-weight kininogen (HMWK) Faktor Fletcher Prekallikrein * Penamaan faktor VI dibatalkan karena senyawa yang dahulu dianggap sebagai faktor pembekuan darah sebenarnya adalah prekursor dari faktor V, dan untuk menghindari kekeliruan, faktor VI belum didefinisikan hingga saat ini.

4 21 Lampiran 3 Pembuatan bufer-bufer 1. Bufer fosfat ph 7 Sebanyak 8.9 g NaH 2 PO 4 ditambahkan dengan 2 g NaOH lalu dilarutkan dalam 525 ml akuades. 2. Bufer 50 mm Tris-HCl ph 7.5 Sebanyak 1.63 g Tris dilarutkan dalam 200 ml akuades, lalu ph diukur. Larutan kemudian dititrasi menggunakan HCl hingga ph menjadi 7.5. Volum ditera menggunakan akuades hingga 250 ml. 3. Bufer 1.5 M Tris-HCl ph 8.8 Sebanyak g Tris dilarutkan dalam 60 ml akuabides, kemudian dititrasi menggunakan NaCl hingga ph mencapai 8.8. Bufer ditera menggunakan akuabides hingga volum 100 ml. Simpan bufer pada suhu 4 C. 4. Bufer 0.5 M Tris-HCl ph 6.8 Sebanyak 6 g Tris dilarutkan dalam 60 ml akuabides lalu dititrasi menggunakan NaCl hingga ph 6.8. Bufer ditera menggunakan akuabides hingga volum 100 ml. Simpan bufer pada suhu 4 C. 5. Bufer sampel elektroforesis Bufer 0.5 M Tris-HCl ph 6.8 sebanyak ml ditambahkan 2.5 ml gliserol, 1 ml SDS 10% ( v), 5 ml 2-merkaptoetanol, 0.5 ml bromofenol biru 1% ( v), lalu dilarutkan dalam 5 ml akuades. Simpan dalam lemari pembeku 6. Bufer running Sebanyak g Tris ditambahkan g glisina, dan 0.6 g SDS, kemudian dilarutkan dalam 500 ml akuades. Larutan dititrasi menggunakan 1 M HCl hingga ph menjadi 8.3. Tera dengan akuades hingga volum 600 ml. Simpan pada suhu 4 C. 7. Bufer 0.1 M glisina-naoh ph 8 Ditimbang 75 g glisina dilarutkan dalam 50 ml akuades, kemudian ph ditera menggunakan NaOH hingga mencapai ph 8.

5 22 Lampiran 4 Prosedur regenerasi kolom DEAE-Selulosa Sigma D6418 Langkah-langkah regenerasi berikut sebaiknya dilakukan di dalam corong Buchner. Regenerasi yang dilakukan di dalam kolom dapat mengakibatkan penyumbatan yang tak kasatmata. 1. Resin disuspensikan di dalam akuades sebanyak 5 kali volum resin dan didiamkan selama menit. 2. Volum resin diukur. Volum yang didapat dicatat sebagai Volum Kolom (VK) yang akan digunakan untuk mengukur volum larutan pencuci kolom. Lanjutkan ke langkah 3. Untuk resin dalam keadaan tersuspensi (baru atau bekas) 3. Suspensi kolom disaring. 4. Resin yang telah disaring disuspensikan ke dalam 2 VK 0.1 M NaOH yang mengandung 0.5 M NaCl selama 10 menit, maksimum selama 30 menit, kemudian dituang ke dalam corong Buchner dan pompa cairan secara PERLAHAN (laju alir 1 VK bufer/ 5 menit). Resin dicuci kembali menggunakan larutan yang sama sebanyak 2 VK. 5. Langkah nomor 4 diulangi kembali menggunakan 0.5 M NaCl (tanpa 0.1 M NaOH). Jika resin dalam keadaan sangat kotor, ditambahkan 0.5 M NaCl sebanyak 3-5 VK setelah pencucian menggunakan asam dan/atau basa dan corong dibiarkan terbuka agar larutan dapat mengalir tanpa hambatan. 6. Langkah nomor 4 diulangi kembali menggunakan 0.1 M HCl yang mengandung 0.5 M NaCl. 7. Langkah nomor 4 diulangi kembali menggunakan akuades. 8. Pencucian dilanjutkan menggunakan akuades sebanyak 5-10 VK atau hingga ph efluen lebih besar dari Resin disuspensikan di dalam 2 VK 1 M NaCl dan dititrasi menggunakan NaOH hingga ph suspensi berkisar antara 7-8. Simpan (Langkah 10) atau gunakan (Langkah 11). 10. Menyimpan resin: kemasan diberi label dan disimpan pada 0-5 C (Lanjutkan pada langkah 11 untuk menggunakan resin. Jika diperkirakan terjadi kontaminasi bakteri, mulailah pada Langkah 4). 11. Menggunakan resin: resin disaring kemudian dicuci menggunakan 5 VK akuades. Resin diresuspensi menggunakan 10x bufer (sesuai yang akan digunakan) sebanyak 2 VK lalu disaring. Resuspensi resin di dalam 1x bufer yang sama sebanyak 2 VK lalu ph filtrat diukur. Jika ph filtrat berkisar 0.15 dari ph 1x bufer, resin siap digunakan. Jika tidak, ulangi Langkah Resin dikemas ke dalam kolom. Biarkan kolom terkemas secara alami. Pemompaan dapat menyebabkan penyumbatan. 13. Sampel dimasukkan ke dalam kolom, dicuci, lalu dielusi. 14. Regenerasi kolom seperti pada Langkah 3-8.

6 23 Lampiran 5 Data aktivitas protease Suhu 25 C, ph 6 Waktu Aktivitas (menit) Ul 1 Ul 2 Ul 3 Rerata Blanko Standar ( U m ) ± ± ± ± ± ± Suhu 37 C, ph 6 Waktu Aktivitas (menit) Ul 1 Ul 2 Ul 3 Rerata Blanko Standar ( U m ) ± ± ± ± ± ± Suhu 60 C, ph 6 Waktu Aktivitas (menit) Ul 1 Ul 2 Ul 3 Rerata Blanko Standar ( U m ) ± ± ± ± ± ± Suhu 25 C, ph 7.4 Waktu Aktivitas (menit) Ul 1 Ul 2 Ul 3 Rerata Blanko Standar ( U m ) ± ± ± ± ± ±

7 24 Lanjutan lampiran 5 Suhu 37 C, ph 7.4 Waktu Aktivitas (menit) Ul 1 Ul 2 Ul 3 Rerata Blanko Standar ( U m ) ± ± ± ± ± ± Suhu 60 C, ph 7.4 Waktu Aktivitas (menit) Ul 1 Ul 2 Ul 3 Rerata Blanko Standar ( U m ) ± ± ± ± ± ± Suhu 25 C, ph 8 Waktu Aktivitas (menit) Ul 1 Ul 2 Ul 3 Rerata Blanko Standar ( U m ) ± ± ± ± ± ± Suhu 37 C, ph 8 Waktu Aktivitas (menit) Ul 1 Ul 2 Ul 3 Rerata Blanko Standar ( U m ) ± ± ± ± ± ±

8 25 Lanjutan lampiran 5 Suhu 60 C, ph 8 Waktu Aktivitas (menit) Ul 1 Ul 2 Ul 3 Rerata Blanko Standar ( U m ) ± ± ± ± ± ± Contoh perhitungan: Misal, suhu 25 C, ph 6, menit ke-5 Ulan an Ulan an Ulan an Rerata Rerata... Rerata = 89 ktivitas U m sampel - standar - lanko lanko aktor pen enceran Waktu inku asi ktivitas U m ktivitas U m -.. ktivitas -. U m

9 26 Lampiran 6 Penentuan panjang gelombang maksimum aktivitas enzim metode Jackson Suhu 25 C, ph 6 Puncak Panjang gelombang (nm) Suhu 37 C, ph 6 Puncak Panjang gelombang (nm) Suhu 60 C, ph 6 Puncak Panjang gelombang (nm)

10 27 Lanjutan lampiran 6 Suhu 25 C, ph 7.4 Puncak Panjang gelombang (nm) Suhu 37 C, ph 7.4 Puncak Panjang gelombang (nm) Suhu 60 C, ph 7.4 Puncak Panjang gelombang (nm)

11 28 Lanjutan lampiran 6 Suhu 25 C, ph 8 Puncak Panjang gelombang (nm) Suhu 37 C, ph 8 Puncak Panjang gelombang (nm) Suhu 60 C, ph 8 Puncak Panjang gelombang (nm)

12 29 Lampiran 7 Contoh hasil pengukuran aktivitas enzim Lampiran 8 Penentuan panjang gelombang maksimum aktivitas fibrinolitik Puncak Panjang gelombang (nm)

13 30 Lampiran 9 Kurva standar pewarna karmoisin y = x R² = Konsentrasi pewarna (ppm) Lampiran 10 Hasil pengukuran aktivitas fibrinolitik S S S B Keterangan: B= blanko S= sampel

14 31 Lampiran 11 Pengukuran bobot molekul dengan PhotoCaptMW Lampiran 12 Prosedur pembuatan reagen Bradford Reagen Bradford (Bradford 1976): mg Coomassie Brilliant Blue G-250 dilarutkan dalam 25 ml etanol 95%. 2. Ditambahkan 50 ml asam fosfat 85% ( v). 3. Ditera menggunakan akuades hingga volum 0.5 liter ketika pewarna telah larut sempurna. 4. Larutan disaring menggunakan kertas Whatman no. 1 ketika akan digunakan. 5. Jika sampel tidak larut, tambahkan 1 M NaOH sebanyak 1x volume sampel. Jika sampel ditambahkan NaOH, standar juga harus diberi perlakuan yang sama.

15 32 Lampiran 13 Penentuan kurva standar protein metode Bradford Hari ke-1 Konsentrasi ( mg / ml ) Ulangan 1 Ulangan 2 Ulangan 3 Rerata y = x x R² = Konsentrasi BSA ( mg / ml ) Berdasarkan daerah linier kurva di atas, [BSA] yang dipilih setelah disesuaikan dengan [sampel] adalah antara mg/ml. Hari ke-2 Konsentrasi ( mg / ml ) Ulangan 1 Ulangan 2 Ulangan 3 Rerata Terkoreksi

16 33 Lanjutan lampiran y = x R² = Konsentrasi BSA ( mg / ml ) Hari ke-3 Konsentrasi ( mg / ml ) Ulangan 1 Ulangan 2 Ulangan 3 Rerata Terkoreksi

17 34 Lanjutan lampiran 13 5 y = x R² = Konsentrasi BSA ( mg / ml ) Hari ke-4 Konsentrasi Ulangan 1 Ulangan 2 Ulangan 3 Rerata y = x R² = Konsentrasi BSA ( mg / ml )

18 35 Lampiran 14 Penentuan konsentrasi protein No Konsentrasi Sampel. Ulangan 1 Ulangan 2 Ulangan 3 Rerata protein ( mg / ml ) 1 Ekstrak kasar ± Presipitat ± Dialisat ± Dialisat kering beku ± Ekstrak kolom ± Ekstrak kolom ± Ekstrak kolom ± Ekstrak kolom ± Ekstrak kolom ± Catatan: perhitungan konsentrasi protein menggunakan kurva standar hari ke-4 Contoh perhitungan: Rerata Ulan an Ulan an Ulan an kstrak kasar... kstrak kasar. onsentrasi protein ekstrak kasar sor an.. onsentrasi protein ekstrak kasar... onsentrasi protein ekstrak kasar. m m onsentrasi protein ekstrak kasar. m m