EKSTRAKSI DNA. 13 Juni 2016

Transkripsi

1 EKSTRAKSI DNA 13 Juni 2016

2 Pendahuluan DNA: polimer untai ganda yg tersusun dari deoksiribonukleotida (dari basa purin atau pirimidin, gula pentosa,dan fosfat). Basa purin: A,G Basa pirimidin: C,T DNA merupakan komponen penyusun kromosom ( materi penyimpan informasi genetik)

3 Komponen DNA

4 DNA berada dalam sel sehingga untuk mendapatkannya harus merusak dinding dan membran sel

5 Ekstraksi DNA Ekstraksi DNA : memisahkan DNA dari komponen seluler lainnya. Ekstraksi DNA merupakan langkah yang tepat untuk mempelajari DNA.

6 Prinsip Ekstraksi DNA Prinsipnya ada dua, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Sentrifugasi : teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung. Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah. Presipitasi merupakan langkah yang dilakukan untuk mengendapkan suatu komponen dari campuran.

7 Aplikasi Ekstraksi DNA 1. Sains: DNA digunakan dalam beberapa aplikasi, seperti pengenalan DNA dalam sel dan hewan atau tanaman untuk tujuan diagnostik (kloning gen). 2 Obat: Untuk memprediksi virulensi mikroorganisme. 3 Sains forensik: DNA untuk identifikasi individu (misalnya untuk kasus perkosaan, pencurian, kecelakaan, atau korban perang) dan uji paternitas.

8 Tahapan Ekstraksi dan Purifikasi DNA 1. Perusakan dinding dan membran sel (Lisis sel) 2. Purifikasi DNA dari komponen lain : Ekstraksi organik & presipitasi Salting out Kromatografi Adsorpsi Menggunakan kit purifikasi DNA komersial 3. Pencucian dan Resuspensi

9 Pemilihan Metode Tergantung Banyak Faktor: 1. Jumlah dan berat molekul DNA 2. Tingkat kemurnian yang diperlukan untuk aplikasi 3. Waktu dan biaya

10 Lisis Sel Pada ekstraksi DNA dari tanaman, tahapan ini terjadi perusakan dinding sel dan membran seluler (membran plasma dan nukleus). 1. Dinding sel (terbuat dari selulosa) dirusak dengan kekuatan mekanik (misal, menggerus daun). 2. Penambahan detergen akan menghancurkan membran sel. Detergen mampu merusak membran karena amphipatic (memiliki bagian hidrofilik dan hidrofobik), sehingga molekul detergen dapat memisahkan membran. 3. Akhir dari lisis yaitu bagian sel tanaman tersebar di dalam larutan.

11 Lisis Sel Merusak dinding sel: -mekanik (digerus), mesin micro smash, sonikasi, tekanan tinggi, beku-leleh. -enzimatik (bakteri: lisozim), (kapang:kitinase & selulase)

12 Lisis Sel Penggunaan detergen untuk merusak membran lipid.

13 Purifikasi DNA Memisahkan DNA dari komponen seluler lainnya seperti protein, lipid, RNA, dll. Secara efektif menginaktivasi endogenous nucleases (enzim DNase) dan mencegahnya dari memotong DNA genom adalah langkah kunci dalam proses purifikasi. DNAse dapat diinaktivasi dengan panas atau chelating agents.

14 Ekstraksi Organik & Presipitasi 1. Menggunakan fenol/kloroform untuk menghilangkan protein dari DNA. Fenol mendenaturasi protein dan melarutkan protein yang terdenaturasi. Kloroform juga merupakan protein denaturan. 2. Penambahan garam. Garam mengganggu ikatan hidrogen antara air dan molekul DNA. 3. DNA lalu dipresipitasi dari protein dengan isopropanol/etanol Dengan adanya kation, etanol menginduksi perubahan struktur molekul DNA yang menyebabkan molekul DNA terpresipitasi dari larutan. 4. Dihasilkan pelet DNA dari sentrifugasi dan supernatan dibuang.

15 Ekstraksi Organik & Presipitasi Tahap 1: Ekstraksi dengan pelarut organik

16 Ekstraksi Organik & Presipitasi Tahap 2: Presipitasi DNA

17 Metode Salting Out Lisis sel Pemecahan protein dengan enzim proteinase. Presipitasi protein dengan konsentrasi garam tinggi Sentrifugasi akan menghilangkan protein terpresipitasi Supernatan berisi DNA DNA lalu terpresipitasi dengan penambahan etanol DNA yang terpresipitasi diresuspensi dalam buffer

18 Kromatografi Adsorpsi Tahapan kromatografi adsorpsi DNA dan kontaminan akan berikatan dengan silika Silika dicuci untuk menghilangkan kontaminan Silika dielusi untuk mendapatkan DNA

19 Menggunakan Kit Purifikasi DNA Komersial Larutan lisis pada umumnya berisi: A. Sodium klorida B. Trimethamine (tris ), yang merupakan buffer untuk menjaga ph kagar konstan. C. Ethylendiaminetetraacetic (EDTA), yang mengikat ion metal. D. Sodium deodecyl sulfate (SDS) berupa detergen. E. Enzim yang digunakan ekstraksi DNA adalah proteinase K.

20 Pencucian dan Resuspensi Pencucian: DNA yang terpresipitasi mengandung garam asetat. DNA tersebut dicuci dengan larutan etanol 70% untuk menghilangkan garam dan impurities lain yang larut air, tanpa meresuspensi DNA. Resuspensi: DNA yang bersih diresuspensi dalam buffer untuk meyakinkan stabilitas dan penyimpanan jangka panjang. Buffer yang umum digunakan untuk resuspensi yaitu 1xTE.

21 Overview Ekstraksi DNA Penghancuran dinding dan membran sel Sentrifugasi untuk memisahkan larutan dari DNA terlarut Presipitasi DNA menggunakan isopropanol Sentrifugasi untuk memisahkan DNA dari garam dan gula terlarut Larutkan DNA dalam buffer (resuspensi) Cuci pelet DNA dengan etanol dan keringkan pelet

22 Ekstraksi DNA pada Prokariot Isolasi DNA diawali dengan perusakan dan atau pembuangan dinding sel, yang dapat dilakukan baik dengan cara mekanis seperti sonikasi, tekanan tinggi, beku-leleh maupun dengan cara enzimatis seperti pemberian lisozim. Langkah berikutnya adalah lisis sel. Bahan-bahan sel yang relatif lunak dapat dengan mudah diresuspensi di dalam medium bufer nonosmotik, sedangkan bahan-bahan yang lebih kasar perlu diperlakukan dengan deterjen yang kuat seperti triton X-100 atau dengan sodium dodesil sulfat (SDS).

23 Ekstraksi DNA pada Eukariot Pada eukariot langkah ini harus disertai dengan perusakan membran nukleus. Setelah sel mengalami lisis, remukan-remukan sel harus dibuang. Biasanya pembuangan remukan sel dilakukan dengan sentrifugasi. Protein yang tersisa dipresipitasi menggunakan fenol atau pelarut organik seperti kloroform untuk kemudian disentrifugasi dan dihancurkan secara enzimatis dengan proteinase. DNA yang telah dibersihkan dari protein dan remukan sel masih tercampur dengan RNA sehingga perlu ditambahkan RNAse untuk membersihkan DNA dari RNA. Molekul DNA yang telah diisolasi tersebut kemudian dimurnikan dengan penambahan amonium asetat dan alkohol atau dengan sentrifugasi kerapatan menggunakan CaCl.

24