III. METODELOGI PENELITIAN. Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Mei-November 2013 di Laboratorium

Transkripsi

1 24 III. METODELOGI PENELITIAN A. Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Mei-November 2013 di Laboratorium Biokimia dan Laboratorium Instrumentasi Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Lampung. B. Alat dan Bahan Alat-alat yang akan digunakan dalam penelitian ini antara lain alat-alat gelas, jarum ose, pembakar spiritus, autoclave model S-90N, laminar air flow CURMA model 9005-FL, neraca analitik, waterbath shaker incubator STUART SSL2, sentrifuga, lemari pendingin, mikropipet Eppendorff, waterbath, penangas, magnetic stirrer, termometer, batang pengaduk, kantong selofan, waterbath incubator HAAKE dan spektrofotometer UV-Vis Carry Win UV 32. Sedangkan bahan-bahan yang akan digunakan adalah NA (Nutrien Agar), CMC (Carboxy Methyl Cellulose), pepton, (NH 4 ) 2 SO 4, akuades, alkohol, MgSO 4, CaCl 2, CoCl 2, KH 2 PO 4, urea, FeSO 4.7H 2 O, glukosa, ZnSO 4.7H 2 O, Na 2 CO 3, NaOH, reagen follin ciocelteau, Na(K) tartarat, CuSO 4.5H 2 O, NaH 2 PO 4,

2 25 Na 2 HPO 4, DNS (dinitrosalisilic acid), fenol, Na 2 SO 3, Na-sitrat, asam sitrat, Bovine Serum Albumin (BSA) dan CC-PEG (Sianurat Klorida Polietilenglikol). Bakteri penghasil enzim selulase pada penelitian ini adalah Bacillus subtilis ITBCCB148 yang diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi dan Teknologi Bioproses Jurusan Teknik Kimia, Institut Teknologi Bandung. C. Prosedur Penelitian 1. Pembuatan media inokulum, inokulasi Bacillus subtilis ITBCCB148 dan produksi enzim selulase a. Pembuatan media inokulum dan media fermentasi Media yang digunakan terdiri atas (g.l -1 ) (NH 4 ) 2 SO 4 1,4; KH 2 PO 4 2,0; urea 0,3; CaCl 2 0,3; MgSO 4 0,3; FeSO 4.7H 2 O 0,005; ZnSO 4.7H 2 O 0,0014; CoCl 2 0,002 dan pepton 0,75. Sumber karbon utama yang digunakan dalam media inokulum adalah glukosa 7,5 g.l -1 dan digunakan buffer fosfat 0,1 M ph 5,5 sebagai pelarut. Sedangkan pada media fermentasi digunakan CMC 7,5 g.l -1 sebagai sumber karbon utama dan buffer fosfat 0,1M ph 6 sebagai pelarut. Selanjutnya media disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 o C, tekanan 1 atm, selama 15 menit (Sternberg, 1976). b. Inokulasi Bacillus subtilis ITBCCB148 Sebanyak 5 ose Bacillus subtilis ITBCCB148 dari media agar miring dipindahkan ke dalam 100 ml media inokulum secara aseptis lalu

3 26 dikocok pada waterbath shaker incubator dengan kecepatan 130 rpm dan suhu 35 o C selama 48 jam. c. Produksi enzim selulase Produksi enzim selulase dilakukan dengan cara membuat media fermentasi sebanyak 1 L kemudian disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 o C, tekanan 1 atm, selama 15 menit (Sternberg, 1976). Selanjutnya dipindahkan sebanyak 20 ml media inokulum (setara dengan 2% dari jumlah media fermentasi) ke dalam media fermentasi secara aseptis lalu dikocok pada waterbath shaker incubator dengan kecepatan 130 rpm dan suhu 32 o C selama 72 jam. 2. Isolasi enzim selulase Isolasi enzim adalah metode pemisahan enzim dari komponen selnya. Pada penelitian ini isolasi enzim dilakukan dengan cara sentrifugasi. Media fermentasi yang telah diinkubasi, selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan putaran 5000 rpm pada suhu 4 o C selama 25 menit. Filtrat yang diperoleh merupakan ekstrak kasar enzim selulase. Ekstrak kasar enzim selulase kemudian diuji aktivitasnya dengan metode Mandels dan diukur kadar proteinnya dengan metode Lowry.

4 27 3. Uji aktivitas dan kadar protein enzim selulase a. Pembuatan pereaksi untuk pengukuran aktivitas enzim selulase metode Mandels( Mandels et al,1976) Ke dalam labu ukur 100 ml, dimasukkan 1% DNS (dinitrosalisilic acid), 1% NaOH, 1 ml Na(K) tartarat 40%, 0,2% fenol dan 0,05% Na 2 SO 3, kemudian dilarutkan dalam 100 ml akuades hingga tanda batas. b. Pengujian aktivitas enzim selulase metode Mandels Metode ini berdasarkan glukosa yang terbentuk (Mandels et al.,1976). Sebanyak 0,25 ml enzim, 0,25 ml larutan CMC 0,5% dalam bufer fosfat ph 5,0; dicampur lalu diinkubasi selama 60 menit pada suhu 50 o C. Kemudian ditambahkan 1 ml pereaksi DNS (dinitrosalisilic acid) dididihkan selama 10 menit pada penangas air dan didinginkan. Setelah dingin, campuran ditambahkan 1,5 ml akuades dan diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 510 nm. Kadar glukosa yang terbentuk ditentukan dengan menggunakan kurva standar glukosa. c. Pembuatan pereaksi untuk penentuan kadar protein enzim selulase metode Lowry Pereaksi A : 2 gram Na 2 CO 3 dilarutkan dalam 100 ml NaOH 0,1 N. Pereaksi B : 5 ml larutan CuSO 4.5H 2 O 1% ditambahkan ke dalam 5 ml larutan Na(K) tartarat 1%.

5 28 Pereaksi C : 2 ml pereksi B ditambahkan 100 ml pereaksi A Pereaksi D : reagen folin ciocelteau diencerkan dengan akuades 1:1. Larutan standar : larutan BSA (Bovine Serum Albumin) dengan kadar 0, 20, 40, 60, 80, 100, 120 dan 140 ppm. d. Penentuan kadar protein enzim selulase metode Lowry Kadar protein enzim ditentukan dengan metode Lowry (Lowry et al., 1951). Penentuan kadar protein ini bertujuan untuk mengatur aktivitas spesifik dari protein enzim selulase. Sebanyak 0,1 ml enzim selulase ditambah dengan 0,9 ml akuades, direaksikan dengan 5 ml pereaksi C dan diaduk rata kemudian dibiarkan selama 10 menit pada suhu ruang. Setelah itu, ditambahkan dengan cepat 0,5 ml pereaksi D dan diaduk dengan sempurna selama 30 menit pada suhu kamar. Untuk kontrol, digunakan 1 ml akuades, selanjutnya diperlakukan sama seperti sampel. Serapannya diukur menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada λ 750 nm. Untuk menentukan kadar protein enzim digunakan kurva standar BSA (Bovine Serum Albumin). 4. Pemurnian enzim selulase Pada penelitian akan dilakukan pemurnian enzim dengan fraksinasi menggunakan ammonium sulfat dan dialisis. Proses pengerjaannya sebagai berikut:

6 29 a. Pengendapan dengan amonium sulfat [(NH 4 ) 2 SO 4 ] Ekstrak kasar enzim yang diperoleh diendapkan dengan garam amonium sulfat pada berbagai derajat kejenuhan yaitu (0-30)%; (30-60)%; dan(60-90)%. Skema proses pengendapan protein enzim dengan penambahan amonium sulfat ditunjukkan pada Gambar 9. Sejumlah ekstrak kasar enzim yang diperoleh ditambahkan garam amonium sulfat yang telah dihaluskan secara perlahan sambil diaduk dengan magnetik stirer pada suhu 4 o C. Endapan protein enzim yang didapatkan pada tiap fraksi kejenuhan amonium sulfat dipisahkan dari filtratnya dengan sentrifugasi dingin pada kecepatan 5000 rpm selama 20 menit. Kemudian endapan yang diperoleh dilarutkan dengan bufer fosfat 0,1 M ph 6,0 dan diuji aktivitasnya dengan metode Mandels, serta diukur kadar proteinnya dengan metode Lowry. Selanjutnya, filtrat yang didapat dari fraksi 0-30% digunakan untuk diendapkan kembali dengan fraksi kejenuhan 30-60% dengan prosedur yang sama (Yandri et al., 2010).

7 30 Ekstrak Kasar Enzim + (NH 4 ) 2 SO 4 (0-30%) Endapan(F1) Filtrat + (NH 4 ) 2 SO 4 (30-60%) Endapan(F2) Filtrat + (NH 4 ) 2 SO 4 (60-90%) Endapan(F3) Filtrat Gambar 9. Skema pengendapan protein enzim dengan amonium sulfat. b. Dialisis Endapan enzim yang telah dilarutkan dari tiap fraksi amonium sulfat dengan aktivitas spesifik yang tinggi dimasukkan ke dalam kantong selofan dan didialisis dengan bufer fosfat 0,01 M ph 6 selama 24 jam pada suhu dingin (Pohl, 1990). Selama dialisis, dilakukan pergantian bufer setiap 6 jam agar konsentrasi ion-ion di dalam kantong dialisis dapat dikurangi. Proses ini dilakukan secara kontinyu sampai ion-ion di dalam kantong dialisis dapat diabaikan. Untuk mengetahui bahwa sudah tidak ada lagi ion-ion garam dalam kantong, maka diuji dengan menambahkan larutan Ba(OH) 2 atau BaCl 2, bila masih ada ion sulfat dalam kantong, maka akan terbentuk endapan putih BaSO 4. Semakin banyak endapan yang terbentuk, maka semakin banyak ion sulfat yang ada dalam kantong. Selanjutnya dilakukan uji aktivitas dengan metode Fuwa, serta diukur kadar proteinnya dengan metode Lowry.

8 31 5. Modifikasi kimia enzim selulase hasil pemurnian dengan polietilenglikol teraktivasi Modifikasi enzim selulase dengan polietilenglikol teraktivasi dilakukan sesuai dengan prosedur yang dilaporkan oleh Hernaiz et al. (1999) dalam menstabilkan enzim lipase dari Candida rugosa. Modifikasi kimia enzim selulase dilakukan dengan tiga variasi perbandingan antara kadar protein enzim hasil pemurnian dengan CC-PEG, yaitu 1:10; 1:20; dan 1:40. Reaksi dilakukan pada suhu 4 o C dan distirrer secara perlahan selama 2 jam dalam bufer fosfat ph Karakterisasi enzim selulase hasil pemurnian dan hasil modifikasi Karakterisasi enzim selulase hasil pemurnian dan hasil modifikasi yang dilakukan meliputi : a. Penentuan ph optimum Untuk mengetahui ph optimum enzim sebelum dan sesudah modifikasi kimia, digunakan bufer fosfat 0,05 M dengan variasi ph sebagai berikut: 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; dan 8,0. Suhunya dipertahankan pada 50 o C. Kemudian diukur aktivitasnya menggunakan metode Mandels. b. Penentuan suhu optimum Suhu yang rendah menyebabkan reaksi kimia berlangsung lambat, sedangkan pada suhu tinggi reaksi kimia akan berlangsung cepat. Namun pada suhu tinggi, enzim dapat mengalami denaturasi. Oleh

9 32 karena itu, variasi suhu yang digunakan adalah 45; 50; 55; 60; 65; dan70, ph tetap dijaga pada ph optimum. Selanjutnya aktivitas enzim diukur dengan metode Mandels. c. Penentuan data kinetika enzim (nilai K M dan V maks ) Konstanta Michaelis-Menten (K M ) dan laju reaksi maksimal (V maks ) enzim sebelum dan sesudah modifikasi kimia ditentukan dari kurva Lineweaver-Burk. Kurva Lineweaver-Burk dibuat dengan menguji aktivitas enzim selulase dengan variasi konsentrasi substrat 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; dan 1% dalam bufer fosfat ph 5 dan suhu 50 o C selama 60 menit. Selanjutnya aktivitas enzim diukur dengan metode Mandels. d. Uji stabilitas termal dan ph enzim (Yang et al., 1996) Penentuan stabilitas termal dan ph enzim dilakukan dengan mengukur aktivitas sisa enzim setelah diinkubasi selama periode waktu 100 menit pada suhu dan ph optimum. Caranya adalah dengan mengukur aktivitas enzim setelah proses pemanasan setelah interval waktu 10 menit. Aktivitas awal enzim (tanpa proses pemanasan) diberi nilai 100%. (Virdianingsih, 2002)

10 33 e. Perubahan waktu paruh (t 1/2 ), konstanta laju inaktivasi (k i ) dan perubahan energi akibat denaturasi ( G i Perubahan nilai k i (konstanta laju inaktivasi) enzim selulase hasil pemurnian dan setelah modifikasi kimia dilakukan dengan menggunakan persamaan kinetika inaktivasi orde 1 (Kazan et al., 1997) dengan persamaan : ln (E i/ E 0 )= -k i t Sedangkan untuk perubahan energi akibat denaturasi ( G i enzim selulase hasil pemurnian dan setelah modifikasi kimia dilakukan dengan menggunakan persamaan (Kazan et al., 1997): G i = - RT ln (k i h/k B T) Keterangan: R = konstanta gas (8,3 J K -1 mol -1 ) T = suhu absolut (K) k i = konstanta laju inaktivasi termal h = konstanta Planck (6,63 x J det) k B = konstanta Boltzmann (1,381 x J K -1 ) Secara keseluruhan, penelitian ini terangkum dalam diagram alir penelitian yang ditunjukkan dalam Gambar 9.

11 34 Produksi enzim Ekstrak kasar Fraksinasi dengan ammonium sulfat Dialisis Uji aktivitas enzim selulase metode Mandels dan penentuan kadar protein metode Lowry Enzim hasil pemurnian Enzim hasil pemurnian pemurnian Modifikasi kimia Enzim modifikasi Penentuan ph dan suhu optimum Penentuan Km dan Vmaks Penentuan stabilitas termal dan ph optimum Uji aktivitas enzim selulase metode Mandels Gambar 10. Diagram alir penelitian.