Elektroforesis. Marlia Singgih Wibowo School of Pharmacy ITB

Transkripsi

1 Elektroforesis Marlia Singgih Wibowo School of Pharmacy ITB

2 Pendahuluan Suatu elektroforegram Suatu elektroforegram

3 Elektroforesis Electro phoresis = being carried Electrically induced movement of particles : gerakan partikel yang bermuatan di dalam suatu media yang diberi arus listrik Digunakan untuk pemisahan suatu campuran senyawa yang bermuatan : protein atau DNA

4

5 Protein Proteins adalah building blocks of life. Secara kimiawi, protein adalah molekul yang terbentuk dari suatu urutan asam amino yang dihubungkan dengan ikatan peptida. Susunan dari beberapa amino acids sepanjang rantai peptida tersebut disebut struktur primer (primary structure) protein, secara experimen dapat dibuktikan melalui teknik sequencing atau dengan analisis DNA yang meng-encoding specific proteins.

6 Struktur Protein

7 Struktur primer, sekunder, tersier dan kuartener

8 Struktur protein

9 Analisis protein

10 Penggunaan elektroforesis dalam analisis Analisis kualitatif Untuk Protein Analisis kualitatif DNA

11 Penggunaan dalam biologi melekul Proteomic studies : untuk menentukan gen yang bertanggung jawab dalam menghasilkan suatu protein dan menentukan fungsi protein tersebut proteomic : studi tentang struktur, fungsi dan regulasi protein suatu organisme

12 Prinsip dasar elektroforesis Elektroforesis adalah suatu proses migrasi molekul bermuatan di dalam suatu media yang bermuatan listrik, dimana kecepatan migrasinya tergantung pada muatan, ukuran dan bentuk setiap molekul yang terlibat. Pada saat arus listrik diberikan, molekul bermigrasi melalui media (biasanya berupa gel), molekul yang kecil akan bermigrasi lebih cepat daripada yang besar, sehingga akan terjadi pemisahan

13 Elektroforesis vertikal untuk analisis protein

14 Elektroforesis horizontal untuk analisis DNA

15 Elektroforesis DNA Pada gel electrophoresis untuk DNA, enzim restriksi memotong DNA menjadi beberapa fragmen dengan panjang bervariasi. Larutan yang mengandung fragmen2 ini ditempatkan di dalam suatu gel tebal. Bila arus listrik diberikan pada gel tersebut, maka satu sisi gel akanbermuatan positif sedangkan sisi lainnya akan bermuatan negatif. Semua fragmen tadi akan bergerak dari sisi gel yang bermuatan negatif ke arah ujung yang bermuatan positif. Fragmen yang lebih kecil akan bergerak lebih cepat dibandingkan yang berukuran lebih besar. Apabila arus listrik dihentikan, fragmen DNA tadi telah terpisah-pisah di dalam gel tersebut dan yang berukuran lebih kecil akan berada lebih dekat pada ujung postif. Fragmen tersebut akan terlihat seperti bentuk barcode.

16 setiap bar dlm pola tersebut mengandung DNA fragments dgn ukuran tertentu. Scientists dpt mengidentifikasi specific restriction fragments dengan melihat posisinya pada gel. Urutan DNA complement dpt digunakan sbg probe untuk menentukan restriction fragment pada gel yang memiliki urutan nukleotida tertentu. Contoh : Scientists dpt menggunakan DNA darah dilokasi kriminal untuk mengungkap pelaku kejahatan. Jika contoh darah sesuai dengan yg terdapat pada gel elektroforesis, maka proses pairing akan terjadi

17 Elektroforesis Protein Metode yang paling umum untuk memisahkan protein adalah dengan cara electrophoresis menggunakan discontinuous polyacrylamide gel sebagai medium penyangga dan sodium dodecyl sulfate (SDS) untuk men-denaturasi protein. Metode ini disebut Sodium Dodecyl Sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS- PAGE). Metode ini disebut juga Laemmli method karena penemunya U.K. Laemmli, adalah yang pertama kali menggunakan metode SDS-PAGE ini

18 Apa gunanya SDS? SDS (juga disebut Lauril sulfat) adalah suatu deterjen anionik, yang apabila dilarutkan molekulnya memiliki muatan negatif dalam range ph yg luas. Suatu rantai polipeptida dpt berikatan dgn sejumlah tertentu SDS sesuai ukuran molekul (Molecular mass). Muatan negatif SDS akan menghancurkan sebagian besar struktur kompleks protein, dan secara kuat tertarik ke arah anoda (positively-charged electrode) bila ditempatkan pada suatu medan elektrik.

19

20 1-D Electrophoresis Ketika protein dan macromolecules lain di treatment dengan SDS suatu strong detergent, maka mereka akan ter denaturasi dan akan bermuatan negatif. Jumlah yang terikat akan proposional dengan massa. Jumlah yang tertarik per unit massa di electric field adalah sama dan seluruh molekul akan bergerak dengan kecepatan yang sama bila tidak ada friksi. Pada proses electrophoresis dengan SDS dilakukan di dalam suatu gel yang akan melewati pori-pori gel., sehingga kemudahan pergerakan melalui pori tergantung pada diameter molekul.

21 Molekul yg lebih besar akan tertahan dan akibatnya bergerak lebih lambat. Karena molekul terdenaturasi, diameter nya tergantung dari berat molekulnya. Makin besar diameter molekulnya, semakin lambat gerakannya. Dengan demikian electrophoresis + SDS akan memisahkan molekul berdasarkan molecular weight, tidak hanya native charge. Catatan : Protein dgn panjang yang sama biasanya tidak dapat dipisahkan dengan by gel electrophoresis + SDS. Perbedaan MW yg disebabkan oleh perbedaan R groups tidak cukup untuk terjadinya pemisahan. Jika dua protein bermigrasi bersamaan maka diasumsikan bahwa mereka memiliki BM yang sama karena panjangnya kurang lebih sama. (walaupun jenis aa berbeda tapi jumlahnya mgk sama).

22 2-Dimensional Electrophoresis Umum digunakan : 2-D polyacrylamide gel electrophoresis Memisahkan, identifikasi, dan mengukur seluruh protein yang terdapat dalam suatu sample sel Pada dimensi pertama, Protein dipisahkan pada titik isoelektriknya yaitu pada ph dimana muatan tiap protein sama dengan 0. Pada dimensi kedua, protein lalu didenaturasi sedemikian sehingga setiap residu asam amino mempunyai muatan tertentu. Selanjutnya protein dipisahkan berdasarkan ukurannya.

23 Bahan penyangga Berupa gel (sediaan semisolid transparan) Utk pemisahan protein : digunakan gel polyacrylamide Utk pemisahan DNA : digunakan gel agarose

24 Komposisi gel untuk pemisahan protein Gel dengan komposisi 7 sampai 15% acrylamide, tergantung pada rentang protein yang akan Separating gel buffer stock (4x conc) terdiri dari 0.4% SDS, 1.5 M Tris-Cl, ph 8.8.

25 Denaturasi sampel protein Berbagai larutan dapar (buffer) digunakan dalam SDS-PAGE, namun untuk proses denaturasi sample dapat digunakan prinsip yg sama : Denaturasi : campuran protein sample 1:1 dengan 2x kons buffer yg mengandung 2% SDS, 20% glycerol, 20 mm Tris-Cl, ph 6.8, 2 mm ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA), plus suatu reducing agent spt dithiothreitol (DTT) atau 2-mercaptoethanol, dan sejumlah kecil bromophenol blue t, dye utk tracking (0.1 mg/ml)

26 Proses pembuatan gel Acrylamide akan berpolimerasi secara spontan bila tidak ada oxygen, jadi sangat penting membuang oxygen dari larutan Polimerasi akan lebh sempurna bila larutan dilakukan de-gassing dibawah vacuum selama 5 min Awali polimerisasi dengan menambahkan freshly prepared10% ammonium persulfate (AP) ke dalam campuran lalu diikuti dengan menambahkan N, N, N', N'- tetramethylethylenediamine (TEMED). Umumnya : 100 µl AP dan 10 µl TEMED per 10 ml gel mix

27 Hal penting yang harus diperhatikan dalam pembuatan gel Acrylamide adalah senyawa toksik sehingga harus menggunakan gloves saat bekerja dengan larutan ini. Pekerrjaan dilakukan di ruang yg berventilasi dan Stock solutions harus disimpan di fume hood. Labu erlenmeyer digunakan utk mencampur acrylamide, lebih baik yg bertutup sehingga mudah untuk mengeluarkan oksigen dengan cara vakum. Acrylamide gel stock harus di label sesuai dengan acrylamide monomer content. Formulasi yg diusulkan : acrylamide stock 29.2% acrylamide dan 0.8% bis-acrylamide, sebagai crosslinker (cross linking gives the gel its mechanical stability). The stock solution is labeled 30% T ( = 30), 2.5% C bis (0.8 is 2.5% of 30).

28 Mempersiapkan gel

29

30

31 Loading ke dalam gel Hamilton syringes digunakan untuk loading samples ke dalam sumuran (wells) Idealnya glycerol di dalam sample dapat membantu sample menggenang (sink) dengan baik pada dasar sumuran Jumlah sample yg baik kira-kira 20 µl atau lebih.

32 Menjalankan gel Anode (+ electrode) harus dihubungkan pada bagian dasar chamber dan Cathode pada bagian atas chamber. Protein yang bermuatan negatif akan bergerak menuju anode,gel biasanya dialiri listrik pada voltase kira-kira 150 Volts untuk mencegah overheating Overheating dapat mendistorsi acrylamide bahkan dpt merusak pelat.

33 Staining the gel Yang biasa digunakan utk deteksi proteins dlm polyacrylamide gels adalah 0.1% Coomassie Blue dye in 50% methanol, 10% glacial acetic acid. Acidified methanol akan mengendapkan proteins. Staining biasanya dilakukan semalam dengan agitasi. Agitasi akan membantu sirkulasi dye, fasilitasi penetrasi, dan membantu uniformity staining. Pewarna (The dye) hanya terikat dengan protein, Excess dye akan dikeluarkan dengan cara 'destaining' dgn acetic acid/methanol, dan agitasi. Paling efficient destaining dilakukan 2 tahap :50% methanol dan 10% acetic acid for 1-2 hours, Kedua 7% methanol, 10% acetic methanol. Pada cucian pertama gel akan shrinks, squeeze out liquid component, Pada cucian kedua gel akan swells and clears in the second solution. Pola pita yang terbentuk akan berwarna biru dengan latar belakang jernih.

34 Hasil elektroforesis

35

36 Elektroforesis DNA DNA marker Produk PCR

37 PCR Fingerprints of Replicates of an isolate of Metarhizium anisopliae, After 2 Years of Preservation with Mr Primer L to R:1, bp ladder,2-6 lyophilised,7-11 mycelial plugs in water, cryopreserved, 17 control M. Ryan

38 Pengukuran dan perhitungan

39

40 Perhitungan dan Interpretasi Membrane 7 MW, log 1,20 1,00 0,80 0,60 0,40 0,20 y = -1,2916x + 1,2809 R 2 = 0,9949 0,00 0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 Distance, cm

41

42 Normalisasi pola elektroforesis 6,00 H37Rv Pattern 5,00 4,00 MW (kb) 3,00 2,00 1,00 0, Numbers of Repeated Experiment

43 Blotting Southern Blot : untuk identifikasi DNA Western Blot : untuk identifikasi Protein Northern Blot : untuk identifikasi RNA

44 Southern Blot

45 Prosedur Southern Blot DNA (genomic or other source) is digested with a restriction enzyme and separated by gel electrophoresis, usually an agarose gel. Because there are so many different restriction fragments on the gel, it usually appears as a smear rather than discrete bands. The DNA is denature into single strands by incubation with NaOH. The DNA is transfered to a membrane which is a sheet of special blotting paper. The DNA fragementsw retain the same pattern of separation they had on the gel. The blot is incubated with many copies of a probe which is singlestranded DNA. This probe will form base pairs with its complementary DNA sequence and bind to form a double-stranded DNA molecule. The probe cannot be seen but it is either radioactive or has an enzyme bound to it (e.g. alkaline phosphatase or horseradish peroxidase). The location of the probe is revealed by incubating it with a colorless substrate that the attached enzyme converts to a colored product that can be seen or gives off light which will expose X-ray film. If the probe was labeled with radioactivity, it can expose X-ray film directly.

46 The figure on the left shows a photograph of a 0.7% agarose gel that has 14 different samples loaded on it (plus molecular weight marker in the far right lane and a glowing ruler used for analysis of the results). Each sample of DNA has been digested with the same restriction enzyme (EcoRI). Notice that the DNA does not appear as a series of discrete bands but rather as a smear. The DNA was transferred to nitrocellulose and then probed with a radioactive fragment of DNA that was derived from the transformed gene. The figure on the right is a copy of the X-ray film and reveals which strains contain the target DNA and which ones do not.

47 Western Blot Lyme disease reactive Western blot Description of lanes: Lane 1 - molecular weight marker Lane 2 - positive patient sample Lane 3 - positive patient sample Lane 4 - monoclonal antibodies for 39 and 41kD bands Lane 5 - monoclonal antibodies for 41kD band Lane 6 - monoclonal antibodies for 39 and 41kD bands Lane 7 - monoclonal antibodies for 31 and 34kD bands Lane 8 - positive control pool

48 Northern Blot