TEKNIK IMUNOLOGI. Ika Puspita Dewi

Transkripsi

1 TEKNIK IMUNOLOGI Ika Puspita Dewi 1

2 ELISA Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay 2

3 ELISA ELISA Test yang dirancang berdasarkan prinsip imunologi (Antigen antibodi) mengunakan label enzim yang dapat ditujukan untuk Mendeteksi keberadaan protein target, Pengikatan enzim / labeling memungkinkan untuk Melacak keberadaan protein target Kualitatif Berapa banyak jumlah protein target Kuantitatif 3

4 PRINSIP Ikatan antigen-antibody Antigen epitope Antibodi 4

5 KOMPONEN ELISA Plate mikrotiter /Solid phase portion of assay. Konjugate (suatu Ab yang telah berlabel enzim) Subtrate (Substansi yang akan mengatifkan enzim setelah berikatan dg bagian aktif enzim perubahan warna) Blocking Bufer pencuci/detergen (Washing buffer) 5

6 METODE ELISA Dapat didesain berdasarkan pengikat targetnya : Antigen Capture Antibody Capture Prosedur deteksinya Direct ELISA : Bila konjugate (Berlabel enzim) berikatan langsung dengan protein target / antigen Indirect ELISA : Bila konjugate (Berlabel enzim) tidak berikatan langsung dengan protein target / antigen 6

7 7

8 8

9 INDIRECT ELISA Mendeteksi antibody Untuk analisis kuantitatif Tahapan : Serum atau sampel lain yg mengandung Ab primer (Ab1) tambahkan pada microtiter well yg telah dilapisi antigen beri waktu utk reaksi cuci (Ab yg bebas dibersihkan) tambahkan Ab sekunder yg terkonjugasi enzim (Ab2) yg mengikat Ab1 cuci Ab2 yg bebas tambahkan substrat utk memberi warna (bias fluorescent atau luminescent) baca pada plate reader 9

10 INDIRECT ELISA 10

11 INDIRECT ELISA Aplikasi deteksi antibody terhadap human immunodeficiency virus (HIV) 11

12 SANDWICH ELISA Mendeteksi Antigen Antibody ditanam di sumuran pada microtiter tambahka sampel yg mengandung antigen reaksikan cuci tambahkan Ab sekunder yg terkonjugasi enzim yg terikat pada epitope yg berbeda dari antigen reaksikan cuci tambahkan substrat timbul warna ukur pada ELISA reader 12

13 SANDWICH ELISA 13

14 SANDWICH ELISA 14

15 SANDWICH ELISA Aplikasi pengukuran sitokin yg soluble pada serum atau cairan tubuh 15

16 COMPETITIVE ELISA Untuk mengukur jumlah antigen (Ag) Tahapan : Ab1 direaksikan dg sampel yg mengandung Ag campuran tsb kmd ditambahkan pada microtiter well yg telah dilapisi Ag kalau Ag pada sampel sedikit, Ab1 yg bebas jumlahnya kan banyak yg terikat pada Ag pada microtiter well cuci Ab1 yg tak terikat tambahkan an enzyme-conjugated Ab2 yg spesifik thd Ab1 tambhakan substrat ukur warna Interpretasi hasil Ag pada sampel >> intensitas warna << Aplikasi : pengukuran sitokin 16

17 COMPETITIVE ELISA 17

18 WESTERN BLOT 18

19 WESTERN BLOT Disebut juga immunoblotting Untuk deteksi dan analisis protein Dasar : antibody dapat mengikat protein tertentu (antigen) pada protein yg diimobilisasi pada membrane shg dapat dideteksi 19

20 WESTERN BLOT Reaksi antara antibodi dengan antigen pada membrane nitrocellulose dg terlebih dahulu memisahkan antigen tsb menurut berat molekul (MW dalam Da atau kda) Western blot untuk protein, Southern blot untuk DNA dan Northern blot untuk RNA Tahapan SDS-Page pemisahan protein berdasarkan berat molekul menggunakan arus listrik Transfer membrane Pengikatan protein dengan antibody spesifik Penambahan substrat untuk membentuk warna 20

21 SDS PAGE Electrophoresis metod epemisahan berdasarkan pergerakan molekul pada lingkungan yg bermuatan listrik Digunakan untuk analisis dan purifikasi makromolekul spt protein dan asam nukleat 21

22 TRANSFER PROTEIN PADA WESTERN BLOT 22

23 23

24 APLIKASI Diagnosis penyakit HIV Penelitian deteksi protein tertentu 24

25 gp160 gp120 p66 p55 p51 gp41 Interpretation band present p31 p24 p17 kontrol HIV-2 Indeterminate Indeterminate p24, p55, gp160 p24, p55 Indeterminate p24, gp41, p55, p66, gp120, gp160 Positive p17, p24, p31, gp41, p51, p55, p66,gp120 gp160 25

26 FLOWCYTOMETRY 26

27 WHAT IS FLOW CYTOMETRY? Flow refers to a fluid stream Cyto refers to a cell metry refers to measurement.

28 WHAT IS FLOW CYTOMETRY? Simultaneous measurements of multiple characteristics of a single cell Measurements are made on a per-cell basis at routine rates of 500 to 4000 cells per second

29 FLOWCYTOMETRY Teknik analisis untuk menghitung frekuensi sel yg terikat pada antibody yg berfluoresens dan di hamburkan pada cahaya tertentu Dapat digunakan untuk mendeteksi : Penanda permukaan pada suatu sel Faktor intraseluler Faktor tertentu yg disekresikan sel Deteksi kandungan DNA 29

30 30

31 APLIKASI Mengetahui frekuensi sel-sel tertentu dalam campuran sel HIV immunophenotyping (CD4/CD8 ratio) Leukocytes Subsets Leukemia and lymphoma immunophenotyping Cell cycle and ploidy analysis of tumors 31

32 ANY QUESTIONS?