METODE. Materi. Tabel 1. Jumlah Sampel DNA yang Digunakan dan Asal Pengambilan Sampel Darah.

Transkripsi

1 METODE Lokasi dan Waktu Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Pemuliaan dan Genetika Molekuler, Bagian Pemuliaan dan Genetik Ternak, Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Penelitian ini dilaksanakan selama enam bulan, yaitu dari September 2011 sampai dengan Maret Materi Ternak Sampel darah dan semen yang digunakan merupakan koleksi sampel Laboratorium Genetika Molekuler tahun Jumlah sampel yang digunakan adalah 312 sampel berasal dari lima daerah yang berbeda (Tabel 1). Tabel 1. Jumlah Sampel DNA yang Digunakan dan Asal Pengambilan Sampel Darah. Asal Sampel Jenis Kelamin Asal DNA Jumlah Sampel KPSBU Pasir Kemis Betina Darah 95 KPSBU Cilumber Betina Darah 94 BPPT SP Cikole Betina Darah 81 BBIB Singosari Jantan Darah 32 BIB Lembang Jantan Semen 10 Jumlah 312 Bahan dan Alat Bahan yang digunakan adalah alkohol, es, dan kapas. Alat yang digunakan antara lain jarum vacutainer, tabung vacum 10 ml dan termos. Ekstraksi DNA Bahan yang digunakan adalah DW (Destilation Water), NaCl, Proteinase-K, 1x STE (5M NaCl, 2M tris HCl, 0,2M EDTA), SDS 10% (sodium dodesil sulfat), CIAA (klorofom iso amil alkohol), fenol, etanol absolut, dan buffer TE 80% (tris

2 EDTA). Alat yang digunakan antara lain autoclave, satu set pipet mikro dan tipnya, vortexmixer, alat sentrifugasi, refrigerator, dan freezer. Primer Primer yang digunakan dalam penelitian untuk mengamplifikasi gen Growth Hormone Receptor (GHR) menurut Khatib et al. (2009) adalah forward: 5 -CTT TGG AAT ACT TGG GCT AGC AGT GAC A A T AT-3 ; reverse: 5 -GTC TCT CTG TGG ACA CAA CA-3 Amplifikasi DNA dengan PCR-RFLP Bahan yang digunakan adalah air bebas ion (steril), sampel DNA, buffer, MgCl 2, pasangan primer, enzim taq dan dntp, enzim retriksi SSpI dan buffer G. Alat yang digunakan adalah satu set pipet mikro dan tipnya, alat sentrifugasi, tabung PCR, mesin PCR, vortex, lemari es. Elektroforesis Bahan yang digunakan adalah air destilasi, agarose, 0,5x TBE, EtBr, loading dye (0,01% Xylene Cyanol, 0,01% Bromtimolblue, 50% gliserol), dan marker 100 bp. Alat yang digunakan antara lain satu set alat pencetak gel, power supply 100 volt, pipet mikro, tip dan alat gelas. Genotyping Bahan-bahan yang digunakan yaitu loading dye (bromthymol blue 0,01%, Xylene cyanol 0,01% dan gliserol 50%) dan untuk membuat 1 lembar gel agarose 2% adalah sebagai berikut: agarose 0,6 g, 0,5 x TBE 30 ml, dan 2,5 μl EtBr. Alat-alat yang digunakan antara lain adalah microwive, stirer, magnetic stirer, gelas ukur, tabung erlenmeyer, gel tray, pencetak untuk sumur (comb), power supply 100 volt, gelas ukur, tip, pipet makro dan mikro. Prosedur Pengambilan Sampel Sampel yang digunakan terdiri dari sampel darah dan semen. Pengambilan sampel darah dilakukan pada empat tempat berbeda, yaitu KSPBU Pasir Kemis, KPSBU Cilumber, BPPT SP Cikole, dan BBIB Singosari. Sampel darah diambil 10

3 melalui vena jugularis menggunakan jarum vacutainer tabung vacum yang ditambahkan alkohol 70%. Sampel disimpan dalam termos es atau lemari es sampai akan digunakan lebih lanjut. Sampel semen didapatkan dengan cara membeli ke BIB Lembang. Sampel kemudian ditambahkan dengan alcohol 70 % dan disimpan pada suhu ruang. Ekstraksi DNA Sampel darah dan semen diambil sebanyak 200 µl, kemudian ditambahkan μl DW untuk sampel darah dan 1000 µl untuk sampel semen. Sampel divortex lalu didiamkan selama 5 menit. Setelah itu disentrifuse pada kecepatan rpm selama 5 menit, lalu supernatan dibuang, dan diulangi seperti proses sebelumnya, kemudian ditambahkan 10 µl proteinase-k yang berfungsi untuk menghancurkan protein, 350 µl 1xSTE (sodium tris-edta) dan 40 µl 10% SDS (sodium dodesil sulfat) yang berfungsi untuk melisiskan membran sel. Campuran tersebut kemudian diinkubasi pada suhu 55 o C selama 2 jam sambil dikocok pelan menggunakan alat pemutar (tilting). Molekul DNA kemudian dimurnikan dengan metode fenol-chloroform, yaitu dengan menambahkan 40 µl 5M NaCl, 400 µl larutan fenol dan CIAA (chloroform iso amil alcohol), lalu dikocok pelan (tilting) pada suhu ruang selama 1 jam. Molekul DNA yang larut dalam fase air dipisahkan dari fase fenol dengan alat sentrifugasi pada kecepatan rpm selama 5 menit. Setelah terbentuk fase DNA, diambil sebanyak 400 µl pada fase DNA untuk dipindahkan ke tabung baru 1,5 ml. Kemudian ditambahkan 5M NaCl sebanyak 40 µl dan etanol absolut sebanyak 800 µl. Molekul DNA kemudian disimpan selama semalam (over night) pada suhu -20 o C. Molekul DNA kemudian dipisahkan dari etanol absolut dengan cara sentrifugasi pada kecepatan rpm selama 5 menit, kemudian supernatan yang diperoleh dibuang. Endapan tersebut didiamkan sampai kering. Lalu endapan DNA disuspensikan dalam 100 µl 80% buffer TE (tris EDTA). Amplifikasi DNA Amplifikasi gen GHR dilakukan dengan menggunakan campuran yang terdiri dari 1 µl sampel DNA yang sudah diekstraksi, 10,85 µl DW, 0,3 µl primer, 0,05 µl taq polymerase, 1,5 µl buffer, 0,3 µl dntp dan 1 µl MgCl2. Campuran tersebut 11

4 kemudian dimasukan ke dalam mesin PCR dengan kondisi suhu pradenaturasi 95 o C selama 5 menit, 35 siklus (denaturasi 95 o C selama 45 detik, annealing 60 o C selama 45 detik dan elongasi 72 o C selama 1 menit) dan elongasi akhir 72 o C selama 5 menit. Elektroforesis Elektroforesis produk PCR dilakukan menggunakan 5 μl produk PCR pada gel agarose 1,5% dengan tegangan 100 volt selama 30 menit. Gel dibuat dengan cara memanaskan agarose 0,45 g yang dilarutkan dalam larutan 0,5xTBE 30 ml serta menambahkan 2,5 μl EtBr pada saat distearer sampai didapatkan larutan jernih. Larutan yang masih cair dituangkan ke dalam pencetak gel serta menempatkan sisir di dekat tepian gel dan gel dibiarkan mengeras. Apabila gel sudah mengeras, sisir dicabut sehingga akan terbentuk sumur-sumur yang digunakan untuk menempatkan sebanyak 5μl produk PCR dicampur dengan loading dye (bromthymol blue 0,01%, Xylene cyanol 0,01% dan gliserol 50%). Gel ditempatkan ke dalam gel tray elektroforesis yang sudah terisi larutan buffer dan dialiri listrik, molekul DNA yang bermuatan negatif pada ph netral akan bergerak (migrasi) ke arah positif (anode). Setelah elektroforesis selesai gel agarose diambil untuk dilihat panjang pita DNA dengan menggunakan sinar Ultraviolet yaitu dengan menarik garis lurus antara posisi pita dari masing-masing sampel DNA yang ingin diukur dengan posisi pita DNA marker, kita dapat mengestimasi ukuran sampel DNA karena ukuran DNA pengukur telah diketahui. Genotyping Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP) dilakukan dengan menggunakan sebanyak 2 μl produk PCR yang dipindahkan ke dalam tabung 0,5 ml dan ditambahkan 1 μl DW, 0,3 μl enzim restriksi SspI dan 0,7 μl buffer G. Campuran tersebut diinkubasikan dalam inkubator pada suhu 37 C selama 16 jam. Sampel DNA yang telah dipotong dengan enzim restriksi kemudian dielektroforesis pada gel agarose 2% dengan tegangan 100 volt selama 30 menit. Setelah elektroforesis selesai gel agarose diambil untuk dilihat panjang pita DNA dengan menggunakan sinar Ultraviolet dan dibandingkan dengan marker untuk mengetahui panjangnya. Setiap pita DNA dari setiap sampel diperbandingkan untuk menentukan genotipe pita DNA. 12

5 Satu posisi migrasi yang sama dianggap sebagai satu tipe atau alel. Menurut Khatib et al. (2009), alel yang dihasilkan dari genotyping adalah alel A sepanjang 230 bp dan alel T sepanjang 200 bp dan 30 bp. Hasil pemotongan fragmen GHR oleh SSpI menghasilkan tiga genotipe yaitu AA (230 bp), AT (230 bp, 200 bp, 30 bp), dan TT (200 bp, 30 bp) (Khatib et al., 2009). Rancangan dan Analisa Data Frekuensi Genotipe dan Alel Keragaman genotipe pada masing-masing sampel dapat dilihat dari pita-pita yang ditemukan. Frekuensi genotipe dapat diperkirakan dengan menghitung perbandingan jumlah genotipe pada populasi bedasarkan rumus Nei dan Kumar (2000) : Keterangan: = frekuensi genotipe ke-ii = jumlah individu bergenotipe ii = jumlah individu sampel Frekuensi alel merupakan rasio suatu alel terhadap keseluruhan alel pada suatu lokus dalam populasi. Frekuensi alel masing-masing alel setiap lokus dihitung berdasarkan rumus Nei (1987) : Keterangan: Xi = frekuensi alel ke-i nii = jumlah individu bergenotipe ii nij = jumlah individu bergenotipe ij n = jumlah individu sampel Keseimbangan Hardy-Weinberg Keseimbangan Hardy-Weinberg diuji dengan Chi-Kuadrat (Hartl and Clark, 1997): Keterangan: x 2 = uji Chi-Kuadrat (obs-exs) 2 13

6 obs exp = jumlah pengamatan genotipe ke-ii = jumlah harapan genotipe ke-ii Derajat bebas (db) dihitung untuk mendapatkan nilai x 2 tabel. Nilai derajat bebas dihitung berdasarkan Allendorf dan Luikart (2007) dengan menggunakan rumus : Db = (Genotipe-1) (Alel-1) Heterozigositas Keragaman genetik (genetic variability) dilakukan melalui estimasi frekuensi heterozigositas pegamatan (H 0 ), heterozigositas harapan (H e ) (Weir, 1996) : Keterangan : H o Nij N = nilai heterozigositas pengamatan = jumlah individu heterozigositas = jumlah individu yang dianalisis Keterangan : H e P 1i n = nilai heterozigositas harapan = frekuensi alel homozigot = jumlah alel 14