Asam Asetat Glacial = 5,7 ml EDTA 0,5 M ph 8.0 = 10 ml Aquades ditambahkan hingga volume larutan 100 ml

Transkripsi

1 36 Lampiran 1. Pembuatan Larutan Stok dan Buffer A. Pembuatan Larutan Stok Tris HCL 1 M ph 8.0 (100 ml) : Timbang Tris sebanyak 12,114 g. Masukkan Tris ke dalam Erlenmeyer dan ditambahkan 80 ml aquades. Aduk campuran larutan sampai homogen, selanjutnya ditambah 4,2 ml HCL pekat sedikit demi sedikit sampai ph mencapai 8, kemudian volume ditepatkan dengan aquades hingga 100 ml. Larutan disterilkan dengan autoklaf. EDTA 0,5 M ph 8.0 (100 ml) : Timbang EDTA sebanyak 18,612 g dan NaOH 2.0 g. Masukkan kedalam Erlenmeyer dan ditambah 80 ml aquades. Selanjutnya, ditambahkan HCL pekat sedikit demi sedikit sampai ph 8, kemudian volume ditepatkan dengan aquades hingga 100 ml. Larutan disterilkan dengan autoklaf. NaCl 5 M (100 ml) : Timbang NaCl sebanyak 29,22 g. Masukkan kedalam Erlenmeyer dan ditambahkan aquades hingga larutan mendekati 100 ml dan diaduk. Kemudian volume ditepatkan dengan dengan aquades hingga 100 ml. Larutan disterilkan dengan autoklaf. B. Pembuatan Larutan Bufer CTAB 2 % (100 ml) CTAB 2 % = 2 g CTAB 20 mm EDTA = 8 ml EDTA 0,5 M ph mm Tris-HCl = 10 ml Tris-HCl 1 m ph 8.0 1,4 M NaCl = 56 ml NaCl 5 M 0,2 % PVP = 2 g PVP 0,2 % β-merkaptotanol Buffer TAE 50 X (100 ml) Tris = 24,2 g Asam Asetat Glacial = 5,7 ml EDTA 0,5 M ph 8.0 = 10 ml Aquades ditambahkan hingga volume larutan 100 ml

2 37 Buffer TAE 1 X (1000 ml) Buffer TAE 50 X = 20 ml Aquades = 980 ml Kloroform Isoamilalkohol 24:1 (50 ml) Kloroform = 48 ml Isoamilalkohol = 2 ml

3 38 Lampiran 2. Komposisi Medium Y3 yang Digunakan Bahan Unsur Kimia Konsentrasi (mg/l) Makro Elemen NH4Cl 535,000 KNO3 2020,000 MgSO4.7H2O 247,000 CaCl2. 2H2O 294,000 KCL 1492,000 NaH2PO4 312,000 Mikro Elemen KI 8,300 H3BO3 3,100 MnSO4. 4H2O 11,200 ZnSO4. 7H2O 7,200 CuSO4. 5H2O 0,160 CoCl2. 6H2O 0,240 NaMoO4. H2O 0,240 NiCl2 0,024 Fe2SO4. 7H2O 27,800 NaEDTA 37,300 Vitamin Myoinositol Piridixin HCl 0,050 Tiamin HCl 0,500 Glisin 2,000 Asam Amino Glutamin 100,000 Gula 45000,000 Agar 8000 ph 6,0

4 39 Lampiran 3. Data Pengamatan Waktu Terbentuknya Organ (HST) Konsentrasi 2,4-D Ulangan mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l

5 40 Lampiran 4. Matriks kemiripan genetik berdasarkan coefficient dice Sampel P0 P1 P2 P3 P4 P5 P P P P P P

6 41 Lampiran 5. Proses Isolasi DNA Eksplan 0,4 g digerus dalam lumpang porselin dengan bantuan nitrogen cair Eksplan ditambah kedalam tabung yang berisi 1 ml buffer ekstrasi, 2% β-merkaptoetanol dan 1% PVP Eksplan ditambah KIAA (24:1) dan disentrifus dengankecepatan rpm pada suhu 4 o C selama 5 menit Supernatan ditambah 1ml isopropanol dan diinkubasi pada suhu -20 o C selama 1 malam DNA diendapkan dengan penambahan 1/10 kali volume sodium asetat dan dihomogenkan. Supernatan dibuang sedangkan pelet diambil dan dibersihkan dengan alkohol 70% sebanyak 2 kali DNA divakum pada suhu 37 o C selama 10 menit. DNA yang telah kering dilarutkan dengan aquabides (ddh2o) steril Untuk menghilangkan kontaminan RNA dari DNA dengan menambahkan µl RNase (20 mg/ml) pada suhu 37 o C selama 90 menit RNase dinonaktifkan pada suhu 70 o C selama 3 menit dan disimpan pada suhu -20 o C untuk digunakan selanjutnya

7 42 Lampiran 6. Uji Kualitas DNA Agarose 1% ditambahkan dengan 100 ml buffer TAE 1x Campuran dipanaskan dengan hot plate Campuran ditambahkan 5 µl EtBr Larutan gel dituang ke dalam cetakan yang telah dipasang sisir Gel yang telah mengeras dipindahkan kedalam chamber berisi buffer TAE 1x Sample dan loading dye dimasukkan kedalam sumur gel dengan perbandingan (5:1) Alat elektroforesis dihubungkan dengan power supply 80 volt Proses running dimulai selama 45 menit

8 43 Lampiran 7. Proses PCR SSR Komposisi Master Mix Volume 10 µl : Go Taq Green 5 µl DNA template 1 µl Primer R (10 pmol/ µl) 1 µl Primer F (10 pmol/ µl) 1 µl Nuclease free water 2 µl Running PCR sebanyak 35 siklus : Denaturasi awal 95 o C 30 detik Denaturasi 95 o C 1 menit Annealing (Suhu optimum primer) 55 o C dan 58 o C 30 detik Extension 72 o C 1 menit Post Extension 72 o C 5 menit Kondisi akhir PCR 4 o C Tak terbatas ( ) Proses running dimulai selama ± 3 jam

9 44 Lampiran 8. Proses Hasil PCR SSR Agarose 2 gram ditambahkan dengan 100 ml buffer TAE 1x Campuran dipanaskan dengan hot plate Campuran ditambahkan 5 µl EtBr Larutan gel dituang ke dalam cetakan yang telah dipasang sisir Gel yang telah mengeras dipindahkan ke dalam chamber berisi buffer TAE 1x Sampel hasil PCR dan marker dimasukkan ke dalam sumur gel dengan perbandingan (10:5) Alat elektroforesis dihubungkan dengan power supplay pada tegangan 70 V, 100 ma pada suhu ruang. Proses running dimulai selama 90 menit