POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

Transkripsi

1 POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) Disusun oleh: Hanif Wahyuni ( ) Prayoga Wibhawa Nu Tursedhi Dina Putri Salim ( ) ( )

2 SEJARAH Teknik ini dirintis oleh Kary Mullis pada tahun 1985 dan ia memperoleh hadiah Nobel pada tahun 1994 berkat penemuannya tersebut

3 DEFINISI Reaksi berantai polimerase atau lebih umum dikenal sebagai PCR merupakan suatu teknik atau metode perbanyakan (replikasi) DNA secara enzimatik tanpa menggunakan organisme PCR merupakan suatu teknik amplifikasi DNA secara in vitro yang mampu mengamplifikasi segmen tertentu dari keseluruhan genom bakteri PCR hanya dapat menyalin fragmen pendek DNA PCR prosesnya berupa siklus termal

4 KOMPONEN-KOMPONEN PCR I. DNA cetakan/target. Merupakan keseluruhan DNA terkandung fragmen DNA target sampel yang di dalamnya. Ukuran target amplifikasi biasanya kurang dari 1000 bp atau 1 kb. Hasil amplifikasi yang efisien adalah bp. Kemurnian DNA target sangat penting. Pemilihan target yang akan diamplifikasi perlu memperhatikan kestabilan genetik dari daerah/urutan nukleotida yang ditargetkan. Jumlah DNA yang dibutuhkan sangat sedikit, yaitu sekitar 1 µl

5 II. Enzim DNA Polymerase Dalam sejarahnya, PCR dilakukan dengan menggunakan Klenow fragment DNA Polimerase I selama reaksi polimerisasinya. Enzim ini ternyata tidak aktif secara termal selama proses denaturasi, sehingga peneliti harus menambahkan enzim di setiap siklusnya. Selain itu, enzim ini hanya bisa dipakai untuk perpanjangan 200 bp dan hasilnya menjadi kurang spesifik. Untuk mengatasi kekurangan tersebut, dalam perkembangannya kemudian dipakai enzim Taq DNA polymerase yang memiliki keaktifan pada suhu tinggi. Taq polymerase ditemukan oleh David Gelfant dan Susanne Stoffel yang diisolasi dari bakteri Thermus aquaticus Biasanya untuk setiap 100 µl volume reaksi, ditambahkan 2,0-2,5 unit

6 III. Primer Primer merupakan oligonukleotida pendek rantai tunggal yang mempunyai urutan komplemen dengan DNA templat yang akan diperbanyak. Panjang primer berkisar antara basa. Untuk merancang urutan primer, perlu diketahui urutan nukleotida pada awal dan akhir DNA target. Primer oligonukleotida disintesis menggunakan suatu alat yang disebut DNA synthesizer. Pemilihan primer yang tidak sesuai dapat menyebabkan tidak terjadinya reaksi polimerasi antara gen target dengan primer. Berikut adalah kriteria pemilihan primer, yaitu :. Memiliki panjang sekitar nukleotida. Memiliki titik didih relatif tinggi. Sekuens primer hanya hadir satu kali pada template DNA. Tidak berkomplementer dengan primer pasangannya. Tidak membentuk struktur sekunder dengan primer pasangannya

7 IV. dntp. dntp atau deoxynukleotide triphosphates merupakan suatu nukleotida bebas yang berperan dalam perpanjangan primer melalui pembentukkan pasangan basa dengan nukleotida dari DNA target (polimerisasi) N = A/T/G/C. Konsentrasi dntp yang digunakan berkisar 0,1-1,5 mm untuk setiap reaksi

8 V. Reagen lainnya. Buffer standar untuk PCR tersusun atas 50 mm KCl, 10 mm Tris-HCl (ph 8,3), dan 1,5 mm MgCl2 Digunakan larutan buffer yang mengandung MgCl 2. Konsentrasi ion Mg2+ dalam campuran reaksi merupakan hal yang sangat kritis. Konsentrasi ion Mg 2+ ini sangat mempengaruhi proses primer annealing, denaturasi, spesifisitas produk, aktivitas enzim dan fidelitas reaksi. Minyak mineral ringan. Akrilamida (grade elektroforesis). N, N -Methylenebisacrylamide (grade elektroforesis, Ultra-Pure/BRL, # 5516UB). Amonium persulfat (Ultra-Pure/BRL, # 5523UA). TEMED (N, N, N N Tetramethylethylenediamine, Ultra-Murni / BRL, # 5524UB)

9 INSTRUMEN PCR Perkin-Elmer/Cetus Thermal Cycler Sterile Thin-wall 0.5 ml Thermocycler microfuge tubes: (TC-5, Midwest Scientific) Mighty-small II SE-250 vertical gel electrophoresis unit (Hoefer)

10 TAHAP-TAHAP PCR I. Denaturasi Selama proses denaturasi, DNA untai ganda akan membuka menjadi dua untai tunggal. Hal ini disebabkan karena suhu denaturasi yang tinggi menyebabkan putusnya ikatan hidrogen di antara basa-basa yang komplemen. Denaturasi biasanya dilakukan antara suhu 90oC 95oC.

11 II. Penempelan Primer (Annealing) Pada tahap ini, primer akan menuju daerah yang spesifik yang komplemen dengan urutan primer. Pada proses annealing ini, ikatan hidrogen akan terbentuk antara primer dengan urutan komplemen pada templat. Proses ini biasanya dilakukan pada suhu 50oC 60oC. Selanjutnya, DNA polymerase akan berikatan sehingga ikatan hidrogen tersebut akan menjadi sangat kuat dan tidak akan putus kembali apabila dilakukan reaksi polimerisasi selanjutnya, misalnya pada 72oC.

12 Suhu Annealing MP = {(G + C) x 4oC + (A + T) x 2o C} Misalnya diketahui suatu fragmen DNA: CATAAGTCTGATACTTGCTG Jumlah basa C = 4, A = 5, T = 7, G = 4 maka MP = {(4 +4) x 4oC + (5 +7) x 2o C} MP = 56o C

13 III. Reaksi Polimerisasi (extension) Umumnya reaksi polimerisasi atau perpanjangan rantai ini terjadi pada suhu 72oC. Primer yang telah menempel tadi akan mengalami perpanjangan pada sisi 3 -nya dengan penambahan dntp yang komplemen dengan templat oleh DNA polimerase. Jika siklus dilakukan berulang-ulang maka daerah yang dibatasi oleh dua primer akan diamplifikasi secara eksponensial (disebut amplikon yang berupa untai ganda), sehingga mencapai jumlah copy yang dapat dirumuskan dengan x = 2n. Dimana n adalah jumlah siklus dan x adalah jumlah awal molekul DNA.

14 SIKLUS PCR

15 APLIKASI PCR 1). Isolasi Gen DNA makhluk hidup memiliki ukuran yang sangat besar, DNA manusia saja panjangnya sekitar 3 miliar basa, dan di dalamnya mengandung ribuan gen. Fungsi utama DNA adalah sebagai sandi genetik, yaitu sebagai panduan sel dalam memproduksi protein, DNA ditranskrip menghasilkan RNA, RNA kemudian diterjemahkan untuk menghasilkan rantai asam amino alias protein. Dari sekian panjang DNA genome, bagian yang menyandikan protein inilah yang disebut gen, sisanya tidak menyandikan protein atau disebut junk DNA, DNA sampah yang fungsinya belum diketahui dengan baik. Untuk mengisolasi gen, diperlukan DNA pencari atau dikenal dengan nama probe yang memiliki urutan basa nukleotida sama dengan gen yang kita inginkan. Probe ini bisa dibuat dengan teknik PCR menggunakan primer yang sesuai dengan gen tersebut

16 2). DNA Sequencing Urutan basa suatu DNA dapat ditentukan dengan teknik DNA Sequencing, metode yang umum digunakan saat ini adalah metode Sanger (chain termination method) yang sudah dimodifikasi menggunakan dye-dideoxy terminator, dimana proses awalnya adalah reaksi PCR dengan pereaksi yang agak berbeda, yaitu hanya menggunakan satu primer (PCR biasa menggunakan 2 primer) dan adanya tambahan dideoxynucleotide yang dilabel fluorescent. Karena warna fluorescent untuk setiap basa berbeda, maka urutan basa suatu DNA yang tidak diketahui bisa ditentukan

17 3). Identifikasi Forensik Seseorang yang terlibat kejahatan (baik pelaku maupun korban), atau korban kecelakaan/bencana kadang sulit dibuktikan. Jika identifikasi secara fisik sulit atau tidak mungkin lagi dilakukan, maka pengujian DNA adalah pilihan yang tepat. DNA dapat diambil dari bagian tubuh manapun, kemudian dilakukan analisa PCR untuk mengamplifikasi bagian-bagian tertentu DNA yang disebut fingerprints alias DNA sidik jari, yaitu bagian yang unik bagi setiap orang

18 4). Tissue typing 5). Analisis mutasi 6). Deteksi virus, bakteri atau patogen lain 7). Analisis filogeni: menentukan kekerabatan mahluk hidup

19 Beberapa hal penting yang perlu diperhatikan dalam PCR: Negatif dan positif kontrol perlu diamplifikasi secara bersama-sama Bekerja dengan sarung tangan untuk menghindari kontaminasi dan tetap aseptik. Idealnya, ruangan tempat kerja untuk mempersiapkan bahan PCR adalah di dalam laminar air flow yang disediakan khusus Pipet untuk PCR sebaiknya disediakan khusus dan tidak dicampur penggunaannya dengan yang lain Jika bekerja dengan jumlah probe yang banyak, maka perlu menyiapkan mastermix untuk menjamin konsistensi komposisi komponen PCR Agar tidak terjadi pertukaran probe, maka setiap sampel probe perlu diberi etiket/label yang jelas Pada saat melakukan kontrol produk PCR, jika memungkinkan standar DNA yang sudah diketahui identitasnya perlu diikutsertakan

20 DAFTAR PUSTAKA Bintang, Maria Biokimia Teknik Penelitian. Jakarta: Erlangga. Fatchiyah, dkk Biologi Molekular Prinsip Dasar Analisis. Jakarta: Erlangga. Jamsari Bioteknologi Pemula Prinsip Dasar dan Aplikasi Analisis Molekuler. Pekanbaru: UNRI Press. Kurniawan, Annas Makalah Reaksi Polimerase Berantai atau Polymerase Chain Reaction (PCR). Singaraja: Universitas Pendidikan Ganesha. Kusuma, Sri Agung Fitri Makalah PCR. Bandung: Universitas Padjadjaran.

21 TERIMA KASIH