Elisa, PCR dan. Dr.Ozar Sanuddin, SpPK(K) Bagian Patologi Klinik. Medan

Transkripsi

1 Prinsip pemeriksaan metode Elisa, PCR dan Elektroforese Dr.Ozar Sanuddin, SpPK(K) Bagian Patologi Klinik Fakultas kedokteran kt USU/UISU Medan

2 Prinsip pemeriksaan Imunologis Umumnya berdasarkan pada interaksi antigen(ag) dan antibodi(ab). Interaksi antigen dan antibodi tba : - Tingkat primer. - Tingkat sekunder. - Tingkat tertier.

3 Tingkat primer Merupakan awal reaksi ikatan molekuler antara Ag dan Ab Reaksi tidak terlihat dengan mata telanjang(biasa) Perlu indikator

4 indikator : - Radioisotop - Enzim atau - zat warna flouresen. Indikator dilengketkan ke Ag atau Ab.

5 Nama metode pemeriksaan, untuk menentukan interaksi antara Ag dan Ab disesuaikan dengan nama indikator diatas. Ilmu yang mempelajari tentang reaksi Ag dan Ab serologi

6 Radioisotop Radio Immuno Assay (RIA). Enzim Enzyme Immuno Assay (EIA) Elisa Flouresen Immunoflouresensi Metode ini untuk menentukan kadar Ag atau Ab yang rendah ng

7 Tingkat sekunder Presipitasi Aglutinasi.

8 Tingkat tertier Interaksi antara Ag dan Ab terjadi Interaksi antara Ag dan Ab terjadi dalam tubuh manusia/ invivo.

9 Teknik ELISA Untuk menentukan kadar Ag atau Ab. Indikator berupa enzim dilenketkan pada Ag atau Ab. Ada beberapa metode.

10 Prinsip Metode Elisa Bila kita mau menditeksi i antigen(ag): Ag(serum) + Ab E Ag- Ab E komplek cuci i Inkubasi dengan substrat kromogenik (semula tak berwarna) berwarna,bila bil dihidrolisis oleh enzim intensitas warna yang terjadi diukur dengan fotometer/ spektrofotometer kadar antigen.

11 Prinsip Metode Elisa[Sambungan] Hidrolisis oleh enzim berlangsung dalam waktu ttt. Reaksi berhenti bila ditambahkan asam atau au basa kuat. Reaksi harus berlangsung dalam keaadan optimal dimana - kadar reaktan - temperatur - masa inkubasi yang telah ditentukan secara eksperimental setiap reagen dari fabrik ber beda prosedur berbeda.

12 Reaksi optimal sudah ditentukan secara eksperimental,dengan penetapan - kadar reaktan - temperaturt - masa inkubasi setiap reagen dari fabrik berbeda prosedur p berbeda.

13 Metode Elisa Metode kompotitif Non kompotitif [Langsung] Indirek atau sandwich

14 Metode kompotitif Umumnya untuk menentukan Ag. Ab spesifik [dilekatkan pada partikel /sumur ] dicampur bersama sama Ag * tambahkan serum [Ag] yang akan bersaing dengan Ag*untuk mengikat Ab diatas kompleks Ag*-Ab-Ag

15 Metode Elisa[sambungan] Non kompotitif[ menentukan Ab atau Ag Indirek/sandwich menentukan Ab dan Ag - Ag-Ab-AntiAb* Ab A antibodi yang dicari - Abs Ag Ab* Ag yang dicari

16 Elektroforese Dikenalkan oleh Tiselius,1930 berkembang menentukan protein serum dan urin Elektroforese merupakan teknik pemeriksaan yang berguna untuk pemisahan dan mengukur kadar makromolekul (protein)

17 Komponen komponen Elektroforese Dapar/Buffer Media pendukung. - Media gel agarosa - Media selulosa asetat Power suply unit Pewarna Protein Densitometer

18 Power suply unit Menghasilkan energi pada kedua elektroda pergerakan dan pemisahan molekul protein. Tegangan dan besar arus dapat dikendalikan.

19 Pewarna Protein Panceou red amino black Coomassie blue

20 Densitometer Alat pengukur kuantitas berdasarkan intensitas warna pita pada elektroforese, saat media pendukung melalui sistem optik yang bekerja seperti fotometer

21 Prinsip Dasar Elektroforese Tergantung pada : A. Muatan partikel B. Kecepatan migrasi. i

22 A. Muatan : Partkel bermuatan, dalam media pendukung nya, bila terpapar dengan medan listrik, akan bergerak kearah elektroda yang berlawanan. Molokul protein bersifat ampoter. Bila protein berada pada lingkungan ph dibawah titik iso elektrisnya protein akan bermuatan neto positip dan sebaliknya Pada ph isoelektrik protein tidak bermuatan listrik atau muatannya nol

23 B. Kecepatan Migrasi. Kecepatan migrasi protein tergantung pada : 1.Kekuatan medan listrik. Makin besar perbedaan muatan neto makin cepat gerakan. 2.Ukuran molekul : Makin kecil mol makin cepat gerakan

24 3.Media pendukung : Pori pori media bersifat filter. 4.Viscositas media Makin tinggi viscositas makin lambat gerakan 5.Kekuatan medan listrik : tegangan listrik besar migrasi cepat. 6.Endoosmosis yaitu gerakan berlawanan arah dalam media pendukung. 7.Kadar ion dalam dapar: kadar ion rendah migrasi cepat 8.Suhu: suhu tinggi migrasi cepat.

25 6.Endoosmosis: yaitu gerakan berlawanan arah dalam media pendukung. 7.Kadar ion dalam dapar: kadar ion rendah migrasi cepat 8.Suhu: suhu tinggi migrasi cepat.

26 Fraksi fraksi Serum Protein Elektroforesis Dengan gel agarosa : - Prealbumin - Albumin - Alfa 1 globulin - Alfa 2 globulin - Beta globulin - Gama globulin Fraksi fraksi protein terlihat berupa pita pita yang spesifik letaknya dan digambarkan densitometer berupa kurva

27 Fraksi fraksi protein terlihat berupa pita pita yang spesifik letaknya. Densitometer menghasilkan fraksi protein berupa kurva

28 Berdasarkan Pergerakan SPE Prealbumin - Fraksi protein yang bermigrasi i paling dekat ke anoda. Albumin, - Fraksi protein terbanyak. - Fungsi mempertahankan tekanan osmotik

29 Alfa1 globulin Alfa 2 globulin. Beta1globulin. li Beta 2 globulin. Gamma globulin migrasi terdekat ke katoda.

30 Polymerase Chain Reaction(PCR). Metode yang cepat dan sederhana, untuk mengkopi dan memperbanyak urutan DNA spesifik yang dinginkan dan divisualisasikan sebagai pita yang jelas pada agarose gel.

31 Scara mendasar sebenarnya PCR mengulangi siklus : - Denaturasi - Hibridasi dari DNA yang dinginkan dengan bantuan DNA primer - Extensi regio DNA tsb oleh enzim DNA polymerase.

32 Pada PCR konvensional - Target amplifikasi adalah asam nukleat harus dilakukan terlebih dahulu sampai selesai - Baru diditeksi. i Pada PCR yang baru amplifikasi dilakukan terhadap sinyal sedangkan target asam nukleat tidak diamplifikasi.

33 Pada PCR yang baru Amplifikasi dilakukan terhadap sinyal. T t kl t tid k di Target asam nukleat tidak di amplifikasi.

34 Prinsip PCR 1. Ekstraksi DNA 2. Alat PCR a. Target DNA b. Persiapan larutan reaksi PCR (d NTP,,bufer,primer DNA dantaq DNA polymerase c. Denaturasi DNA Initial denaturation : 5 menit,t 94 C Denaturation : 1 menit 94 C Primer annealing : 1 menit 50 C Copying of DNA by DNA polymerase final elongation 10 menit,72 C Program alat PCR bisa dilakukan siklus

35