Lampiran 1 Pembuatan Medium Kultur DMEM Lampiran 2 Pembuatan Larutan PBS Lampiran 3 Prosedur Pewarnaan HE

Transkripsi

1 LAMPIRAN

2 Lampiran 1 Pembuatan Medium Kultur DMEM Medium kultur DMEM merupakan medium Dulbecco s Modified Eagle s Medium (DMEM; Sigma) yang telah dimodifikasi dengan penambahan asam amino non-esensial (AANE; Sigma) 10%, fetal calf serum (FCS; Gibco) 10%, NaHCO 3 3mM, dan gentamisin 5µg/ml. Pembuatan 200 ml DMEM diperlukan 2 gram serbuk DMEM, 0,37 gram serbuk NaHCO 3, 200 µl larutan asam amino nonesensial, dan 250 µl gentamisin. Selanjutnya, ditambahkan aquades hingga volume mencapai 200 ml. penambahan 10 ml FCS dilakukan saat medium akan digunakan untuk kultur. Medium yang telah ditambah FCS selanjutnya disterilisasi dengan menggunakan mikrofilter 0,22 µm. Setelah medium steril, medium diinkubasi di dalam inkubator dengan suhu 37 o C dan 5% CO 2 sebelum digunakan sebagai medium kultur. Lampiran 2 Pembuatan Larutan PBS Larutan PBS merupakan larutan phosphate buffered saline (PBS; Gibco) yang diberi tambahan fetal calf serum 0,1 % dan gentamisin 5µg/ml. Pembuatan 100 ml PBS diperlukan 0,96 gram serbuk PBS, 125 µl gentamisin, lalu ditambahkan aquades hingga volume mencapai 100 ml. Selanjutnya, larutan ditambah FCS sebanyak 100 µl kemudian larutan disterilisasi dengan mikrofilter 0,22 µm. Sebelum digunakan untuk kultur PBS diinkubasi terlebih dahulu di dalam inkubator pada suhu 37 o C dan 5% CO 2. Lampiran 3 Prosedur Pewarnaan HE Kultur sel yang ditumbuhkan di atas cover glass dibilas dengan larutan PBS lalu difiksasi dengan buffer paraformaldehid 4% selama 24 jam. Selanjutnya, kultur sel difiksasi di dalam alkohol 50% selama 2 jam dan dilanjutkan dengan alkohol 70% sampai kultur sel akan diwarnai dengan HE. Saat kultur sel akan diwarnai, terlebih dahulu dilakukan proses stopping point dengan cara merendam kultur sel di dalam alkohol 50% selama 3 menit. Selanjutnya, direndam di dalam aquades selama 5 menit, hematoksilin 4 menit, dan dibilas dengan aquades. Kemudian dilakukan perendaman di dalam eosin selama 2 menit, lalu dibilas dengan aquades. Pewarnaan dilanjutkan dengan dehidrasi bertingkat dalam

3 alkohol 70%, 80%, 90%, 96%, 100%, 100%, 100%, masing-masing selama 10 menit. setelah itu, dilanjutkan dengan xilol sebanyak dua kali ulangan. Terakhir, dilakukan mounting pada object glass dengan menggunakan entelan. Evaluasi morfologi sel dilakukan dengan mikroskop cahaya pada perbesaran 400x. Lampiran 4 Pembuatan Stock Reagent - Pembuatan SDS 10% Serbuk SDS sebanyak 10 gram dilarutkan dalam 60 ml aquades, kemudian dihomogenkan. Setelah larutan homogen, ditambahkan aquades hingga volume mencapai 100 ml. - Pembuatan Amonium Persulfat 10% Sebanyak 100 mg serbuk ammonium persulfat dilarutkan di dalam 1 ml aquades, kemudian dihomogenkan. - Pembuatan Bisakrilamid Pembuatan bisakrilamid membutuhkan 146 gram akrilamid dan 4 gram N,N Methylene-bis Acrylamide, dilarutkan dalam 500 ml aquades. - Pembuatan Tris-HCl 1,5M ph 8,6 Sebanyak 54,45 gram serbuk Tris Base dilarutkan dalam 150 ml aquades. ph larutan diatur dengan penambahan HCl. Setelah ph tercapai, larutan ditambah aquades hingga volume mencapai 300 ml. - Pembuatan Tris-HCl 0,5M ph 6,8 Serbuk Tris Base sebanyak 6 gram dilarutkan dalam 60 ml aquades, kemudian ph diatur dengan penambahan HCl. Selanjutnya larutan ditambah aquades hingga volume mencapai 100 ml. Lampiran 5 Pembuatan Gel Poliakrilamid Gel poliakrilamid terdiri dari dua bagian yaitu separating gel dan stacking gel. - Separating gel Separating gel 12% dibuat dengan memasukkan berturut-turut larutan bisakrilamid sebanyak 6 ml, aquades 5,025 ml, Tris HCl 1,5M (ph 8,6) sebanyak 3,75 ml, SDS 10% 0,15 ml, ammonium persulfat 10% sebanyak 75 µl, dan

4 TEMED 7,5 µl ke dalam tabung erlenmeyer. Setelah tercampur homogen, larutan dimasukkan ke dalam celah diantara dua lempeng kaca sampai memenuhi tiga perempat lempeng kaca tersebut. Diamkan beberapa menit, hingga gel mengeras. - Stacking gel Stacking gel 4% dibuat dengan mencampurkan berturut-turut larutan bisakrilamid sebanyak 0,325 ml, aquades 1,5025 ml, Tris HCl 0,5M (ph 6,8) sebanyak 0,625 ml, SDS 10% 25 µl, ammonium persulfat 10% 12,25 µl, dan TEMED 2,5 µl. Larutan stacking gel dimasukkan di atas separating gel yang telah mengeras sampai batas atas lempeng kaca, kemudian sisir disisipkan diantara kedua lempeng kaca untuk membentuk sumur tempat sampel diletakkan. Gel dibiarkan hingga memadat, lalu sisir dilepas dan lempeng kaca dipasang pada chamber alat elektroforesis. Lampiran 6 Pembuatan Stock Buffer dan Running Buffer Sebelum pembuatan running buffer, terlebih dahulu dilakukan pembuatan stock buffer. Stock buffer dibuat dengan mencampurkan serbuk Tris Base sebanyak 1,5 gram, glycine 7,2 gram, dan SDS 0,5 gram. Kemudian, untuk membuat running buffer 1x yang siap pakai, maka 100 ml stock buffer diencerkan dalam 400 ml aquades. Larutan tersebut kemudian diatur ph-nya hingga mencapai 8,3 dengan menambah NaOH atau HCl. Lampiran 7 Prosedur Pewarnaan Silver Nitrat Proses fiksasi dilakukan selama 30 menit. Larutan fiksasi dibuat dengan cara mencampurkan 100 ml etanol absolut dengan 25 ml asam asetat glasial, lalu ditambah aquades hingga volume mencapai 250 ml. Proses sensitisasi dilakukan selama 30 menit sambil digoyangkan secara perlahan. Larutan sensitisasi dibuat dengan cara mencampurkan 75 ml etanol absolut dengan 1,25 ml glutaraldehid, 10 ml sodium tiosulfat, dan 10 ml sodium asetat, lalu ditambah aquades hingga volume mencapai 250 ml. Proses pencucian gel dilakukan dengan aquades selama 5 menit dengan 3 kali pengulangan. Proses pewarnaan dilakukan selama 20 menit sambil menggoyangkan wadah secara perlahan. Pembuatan larutan pewarna (larutan silver nitrat) dengan cara mencampurkan 25 ml larutan silver nitrat

5 dengan 0,1 ml formaldehid, lalu ditambah aquades hingga volume mencapai 250 ml. Proses pencucian kembali dengan aquades selama 1 menit sebanyak 2 kali pengulangan. Proses developing dilakukan selama 2 menit, hingga larutan developing tampak berwarna cokelat. Proses ini menggunakan campuran sodium carbonate 6,25 g dengan 0,05 ml formaldehid, lalu ditambah aquades hingga volume mencapai 250 ml. Proses stopping selama 10 menit menggunakan larutan EDTA-Na 2.2H 2 O (3,65 g) dalam 250 ml aquades. Terakhir, gel dicuci dengan aquades selama 5 menit dengan 3 kali pengulangan.