Lampiran 1 Ekstraksi dan isolasi DNA dengan metode GeneAid

Transkripsi

1 LAMPIRAN

2 9 Lampiran 1 Ekstraksi dan isolasi DNA dengan metode GeneAid Satu ruas tungkai udang mantis dalam etanol dipotong dan dimasukkan ke dalam tube 1,5 ml. Ruas tungkai yang telah dipotong (otot tungkai) kemudian dicuci dengan air destilata sebanyak 2 kali ulangan menggunakan mesin sentrifuse. Sampel yang telah dicuci kemudian dihomogenasi menggunkana grinder dan ditambahkan 200 µl buffer STE (NaCl 1M, Tris-HCL 10mM, EDTA 0.1mM, ph 8) ke dalam tube. Sebanyak 50 mg/ml proteinase K 20 µl ditambahkan ke dalam tabung dan vortex selama beberapa detik. Inkubasi pada suhu 60 0 C selama 30 menit. Setiap 5 menit sekali tabung dibolak-balik secara perlahan. Sebanyak 200 µl buffer GB ditambahkan ke dalam tabung dan vortex selama 5 detik. Inkubasi pada suhu 70 0 C selama 20 menit. Setiap 5 menit sekali tabung dibolak-balik secara perlahan. Pada saat yang bersamaan, inkubasi buffer elusi pada suhu yang sama untuk step elusi DNA. Sebanyak 200 µl etanol ditambahkan ke dalam tabung dan vortex selama 10 detik. Sampel dipindahkan ke dalam kolom GD pada tube 2 ml. Sentrifugasi rpm selama 2 menit. Kolom GD dipindahkan ke dalam tabung koleksi yang baru dan supernatan dibuang. Sebanyak 400 µl buffer W1 ditambahkan ke dalam tabung. Sentrifugasi rpm selama 30 detik. Supernatan dibuang dan kolom GD diletakkan kembali ke dalam tabung. Sebanyak 600 µl wash buffer (mengandung etanol) ditambahkan ke dalam kolom GD. Sentrifugasi rpm selama 30 detik. Supernatan dibuang dan kolom GD diletakkan kembali ke dalam tabung. Sentrifugasi rpm selama 3 menit. Kolom GD dipindahkan ke dalam tube 1,5 ml yang baru. Sebanyak 100 µl buffer elusi yang telah diinkubasi ditambahkan ke dalam kolom GD (tepat bagian tengah matriks kolom GD). Diamkan selama 5 menit. Sentrifugasi rpm selama 30 detik. Kolom GD dibuang dan didapatkan DNA yang telah berhasil diekstraksi.

3 10 Lampiran 2 Visualisasi fragmen DNA (penyajian produk PCR) Gel yang telah dielektroforesis kemudian dikeluarkan dari kaca dan dibilas dengan DW (air destilata) sebanyak 200 ml. Air destilata dibuang*, gel direndam dalam larutan A. Gel direndam dalam larutan A selama 8 menit. Pada saat yang bersamaan, larutan B dipanaskan pada suhu 55 0 C. Kemudian air larutan A dibuang ke dalam botol khusus Ag. Gel dibilas dengan DW sebanyak 200 ml, kemudian DW dibuang. Gel direndam dalam larutan B yang telah ditambahkan formaldehid. Gel direndam hingga muncul pita. Air larutan B dibuang Gel direndam dalam larutan C selama 2 menit. Catatan: Larutan A: DW 200 ml AgNO 3 0,2 gram NaOH 10N 80 µl (sebaiknya dibuat fresh) amonia 0,8 ml Larutan B: DW 200 ml NaOH 6 gram Formaldehid 100 µl ( ditambahkan sesaat sebelum dituang) Larutan C: DW 100 ml Asetat 100 µl *Setiap larutan dibuang dengan cara dihisap/disedot menggunakan alat vakum penyedot.

4 11 Lampiran 3 Hasil pensejajaran tujuh runutan DNA mantis dengan referensi genbank sepanjang 430 nt _H. stephensoni TTGATTATTCGTGCAGAATTAGGACAGCCTGGTAGGCTAATTGGAGATGATCAAATTTACAACGTTATTGTTACAGCACACGCTTTCGTTATAATTTTTT 2 2_H. stephensoni TTGATTATTCGTGCAGAATTAGGACAGCCTGGTAGGCTAATTGGAGATGATCAAATTTACAACGTTATTGTTACAGCACACGCTTTCGTTATAATTTTTT 3 9_C. multicarinata TTTATCATTCGAGCAGAACTAGGACAACCAGGTAGTTTAATTGGAGACGACCAAATTTATAATGTTATCGTTACAGCCCATGCTTTCATTATGATTTTTT 4 11_C. multicarinata TTAATCATTCGAGCAGAACTAGGACAACCAGGTAGTTTAATTGGAGACGACCAAATTTATAATGTTATCGTTACAGCCCATGCTTTCATTATGATTTTTT 5 22_C. multicarinata TTAATTATTCGAGCAGAATTAGGACAACCAGGTAGATTAATTGGAGATGATCAAATCTACAACGTTATTGTTACAGCACATGCTTTTATTATAATTTTTT 6 34_H. harpax TTAATCATTCGAGCCGAATTAGGGCAACCCGGTAGGTTAATTGGAGATGATCAAATTTATAATGTTATTGTCACAGCCCACGCCTTTATTATAATTTTTT 7 37_H. harpax TTAATCATTCGAGCCGAATTAGGGCAACCCGGTAGGTTAATTGGAGATGATCAAATTTATAATGTTATTGTCACAGCCCACGCCTTTATTATAATTTTTT 8 H. glyptocercus TTAATTATTCGAGCAGAATTAGGACAACCCGGTAGATTAATTGGAGACGATCAAATCTACAACGTTGTAGTCACAGCCCATGCCTTCATTATAATTTTTT 9 H. harpax TTGATTATTCGTGCAGAATTAGGACAGCCTGGTAGGCTAATTGGAGATGATCAAATTTACAACGTTATTGTTACAGCACACGCTTTCGTTATAATTTTTT 10 S. mantis TTGATTATTCGAGCTGAGCTAGGTCAACCAGGTAGGTTAATTGGAGATGACCAAATCTACAATGTTATCGTTACAGCACACGCTTTTGTTATAATTTTTT TCATGGTTATACCAATTATAATTGGAGGTTTTGGAAACTGATTAGTTCCTTTAATGTTAGGGGCCCCAGATATAGCCTTCCCCCGTATAAACAACATAAG 2 TCATGGTTATACCAATTATAATTGGAGGTTTTGGAAACTGATTAGTTCCTTTAATGTTAGGGGCCCCAGATATAGCCTTCCCTCGTATAAACAACATAAG 3 TTATGGTAATGCCAATTATAATTGGAGGGTTTGGGAATTGACTAGTCCCTCTTATACTAGGAGCTCCTGATATAGCTTTCCCTCGAATAAACAATATGAG 4 TTATGGTAATGCCAATTATAATTGGAGGGTTTGGGAATTGACTAGTCCCTCTTATACTAGGAGCTCCTGATATAGCTTTCCCTCGAATAAACAATATGAG 5 TTATGGTTATACCAATCATAATTGGAGGTTTCGGGAATTGATTAGTACCACTTATATTAGGAGCCCCTGATATGGCATTTCCCCGTATAAACAACATAAG 6 TTATGGTAATACCAATTATAATTGGAGGTTTCGGAAACTGATTAGTTCNCTTGATATTGGGGGCCCCAGATATAGCCTTCCCACGAA-AAATAATATAAG 7 TTATGGTAATACCAATTATAATTGGAGGTTTCGGAAACTGATTAGTTCCCTTGATATTGGGAGCCCCAGATATAGCCTTCCCACGAATAAATAATATAAG 8 TTATAGTTATACCAATTATAATTGGAGGATTTGGAAACTGGCTAGTGCCTTTAATGCTAGGGGCACCTGATATGGCTTTCCCCCGAATAAATAACATAAG 9 TCATGGTTATACCAATTATAATTGGAGGTTTTGGAAACTGATTAGTTCCTTTAATGTTAGGGGCCCCAGATATAGCCTTCCCTCGTATAAACAACATAAG 10 TTATAGTTATACCTATTATAATTGGGGGGTTTGGAAACTGATTAGTGCCTTTAATATTAGGGGCCCCTGATATAGCATTCCCCCGTATAAATAACATAAG TTTTTGACTACTACCGCCTGCACTTACTTTACTTTTATGTAGTGGATTAGTAGAAAGAGGGGTAGGAACAGGATGAACAGTTTATCCTCCTTTATCAGCG 2 TTTTTGACTACTACCGCCTGCACTTACTTTACTTTTATGTAGTGGATTAGTAGAAAGAGGGGTAGGAACAGGATGAACAGTTTATCCTCCTTTATCAGCG 3 ATTCTGATTATTACCACCTGCTCTCACGCTTTTACTCTCAAGTGGCTTAGTAGAAAGAGGAGTAGGAACAGGATGAACGGTTTACCCTCCTTTATCTGCA

5 12 4 ATTCTGATTATTACCACCTGCTCTCACGCTTTTACTCTCAAGTGGCTTAGTAGAAAGAGGAGTAGGAACAGGATGAACGGTTTACCCTCCTTTATCTGCA 5 ATTTTGATTATTACCACCAGCTCTTACTCTCCTTTTATCAAGAGGCCTAGTAGAAAGAGGAGTTGGAACAGGATGAACTGTTTACCCTCCTTTGTCTGCA 6 ATTTTGGTTACTACCCCCAGCTCTCACACTTCTTTTATCAAGAGGTCTAGTAGAAA-AGGAGTTGGGACCGGATGAACCGTTTATCCCCCACTATCTGCT 7 ATTTTGGTTACTACCCCCAGCTCTCACACTTCTTTTATCAAGAGGTCTAGTAGAAAGAGGAGTTGGGACCGGATGAACCGTTTATCCCCCACTATCTGCT 8 ATTTTGATTACTTCCCCCCGCACTTACTTTATTACTTTCAAGAGGTATAGTAGAAAGAGGAGTAGGAACAGGATGAACAGTTTATCCTCCTTTAGCCGCC 9 TTTTTGACTACTACCGCCTGCACTTACTTTACTTTTATGTAGTGGATTAGTAGAAAGAGGAGTAGGAACAGGATGAACAGTTTATCCTCCTTTATCAGCG 10 ATTTTGATTACTACCTCCCGCACTCACCTTATTACTATCTAGGGGCTTAGTTGAAAGAGGGGTTGGTACTGGATGAACAGTTTATCCCCCTTTATCAGCA GGAATTGCTCATGCTGGGGCTTCAGTAGACATGGGTATTTTTTCTTTACACTTAGCCGGAGCTTCATCAATTTTAGGAGCTGTTAACTTCATTACAACAG 2 GGAATTGCTCATGCTGGGGCTTCAGTAGACATGGGTATTTTTTCTTTACACTTAGCCGGAGCTTCATCAATTTTAGGAGCTGTTAACTTCATTACAACAG 3 GGAATTGCACACGCAGGAGCGTCTGTGGATATGGGTATTTTTTCTTTACATCTAGCAGGGGCCTCTTCGATTTTAGGGGCAGTAAACTTTATTACTACCG 4 GGAATTGCACACGCAGGAGCGTCTGTGGATATGGGTATTTTTTCTTTACATCTAGCAGGGGCTTCTTCGATTTTAGGGGCAGTAAACTTTATTACTACCG 5 GGAATTGCTCATGCAGGAGCTTCTGTAGACATGGGTATTTTTTCGTTACATTTAGCAGGAGCTTCTTCTATTTTAGGTGCCGTAAACTTCATTACTACTG 6 GGAATCGCACACGCAGGGGCTTCAGTAGATATGGGTATTTTTTCTCTACACATAGACGGAGGT-CATCTAATGTAGGAGCTGTAA-TTTTATTACAACCG 7 GGAATCGCACACGCAGGGGCTTCAGTAGATATGGGTATTTTTTCTCTACACCTAGCCGGAGCTTCATCTATCTTAGGAGCTGTAAATTTTATTACAACCG 8 GGAATTGCCCACGCAGGAGCGTCTGTAGATTTAGGAATTTTTTCATTGCACATAGCAGGAGCTTCATCAATCCTAGGAGCAGTAAACTTTATTACAACAG 9 GGAATTGCTCATGCTGGGGCTTCAGTAGACATGGGTATTTTTTCTTTACACTTAGCCGGAGCTTCATCAATTTTAGGAGCTGTTAACTTCATTACAACAG 10 GGAATTGCGCATGCCGGGGCTTCTGTAGATATGGGTATTTTCTCTTTACATTTAGCAGGAGCTTCTTCAATTTTAGGAGCTGTAAATTTCATTACTACGG TTATTAATATACGATCAAATGGGATAACTA 2 TTATTAATATACGATCAAATGGGATAACTA 3 TAATCAATATACGATCTAATGGAATAACTA 4 TAATCAATATACGATCTAATGGAATAACTA 5 TAATCAACATACGATCTAACGGAATAACTA 6 TAATTAATATCCG-TCCAACGGAATAACTA 7 TAATTAATATACGATCCAACGGAATAACTA 8 TTATTAATATACGATCTAACGGAATAACAA 9 TTATTAATATACGATCAAATGGGATAACTA 10 TAATTAATATACGATCAAACGGAATGACTA

6 13