LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI

Transkripsi

1 LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI ISOLASI DNA Disusun Oleh : Dinda Fitriana Setia H1A Dosen Pembimbing: Drs. Choirul Muslim, P.hd Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Bengkulu 2015

2 BAB I PENDAHULUAN 1.1Pendahuluan Sampai awal tahun 70an, DNA merupakan molekul seluler yang paling sulit dianalisis, karena strukturnya yang panjang dan secara kimiawi monoton. Sebagai materi genetik suatu organisme nukleotida hanya dapat dianalisis secara tidak langsung melalui analisis urutan protein dan RNA atau melalui analisis genetic. Kini menjadi hal yang mungkin untuk mengisolasi suatu region spesifik dari suatu genome, yaitu total informasi genetic yang dimiliki oleh suatu organisme; dan untuk memproduksi jumlah kopi yang tidak terbatas dari region tersebut, atau untuk mendeterminasi urutan nukleotida dari region tersebut hanya dalam semalam, dengan kecepatan pembacaan 1000 nukleotida per detik. Teknologi rekombinan DNA yang menjadi pusat kegiatan dalam aktifitas Bioteknologi, merupakan suatu teknik yang menggabungkan suatu segmen DNA dengan DNA yang lain, telah menjadi pengetahuan yang memberikan banyak manfaat bagi kehidupan manusia, seperti dalam produksi vaksin dan hormone. Aktifitas utama dalam teknik rekombinan DNA, antara lain: 1. Memotong DNA pada tempat (site) yang spesifik dengan enzim restriksi nuclease. Dengan teknik ini, dimungkinkan untuk mengisolasi dan memanipulasi gen secara individual. 2. Kloning DNA dengan menggunakan suatu vector atau teknik Polymerase Chains Reaction (PCR), yang memungkinkan suatu molekul DNA dapat dikopi untuk meghasilkan jutaan molekul identik. 3. Hibridisasi asam nukleat, teknik untuk menemukan urutan DNA atau RNA yang spesifik dengan tingkat akurasi yang tinggi berdasarkan kemampuannya mengikat urutan asam nukleat komplemennya 4. Pengurutan (sequencing) semua nukleotida dari fragmen DNA yang telah dipurifikasi. Bertujuan untuk mengidentifikasi gen dan memperkirakan urutan asam amino yang membentuk protein. 5. Pemantauan (monitoring) tingkat ekspresi suatu gen di dalam sel dengan menggunakan teknik mircroarry asam nukleat.

3 Pada praktikum kali ini akan dilakukan isolasi DNA dari jaringan dengan menggunakan Genomic DNA Mini Kit (Tissue). Dengan menggunakan maksimal 30 mg 20 jaringan dapat diperoleh ug DNA total (termasuk DNA genom, mitokondria, dan virus). Hasil isolasi DNA disebut baik bila didapatkan DNA dengan konsentrasi 10 ug dengan rasio A260/A280 sebesar 1,8-2,0). 1.2Tujuan Mengisolasi DNA dari jaringan dengan menggunakan Genomic DNA Mini Kit (Tissue)

4 BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Isolasi DNA Prisnsip isolasi DNA pada berbagai jenis sel atau jaringan pada berbagai organisme pada dasarnya sama namun memiliki modifikasi dalam hal teknik dan bahan yang digunakan. Bahkan beberapa teknik menjadi lebih mudah dengan menggunakan kit yang diproduksi oleh suatu perusahaan sebagai contoh kit yang digunakan untuk isolasi DNA pada tumbuhan seperti Kit Nucleon Phytopure sedangkan untuk isolasi DNA pada hewan digunakan GeneJETTM Genomic DNA Purification Kit. Namun tahapan-tahapan isolasi DNA dalam setiap langkahnya memiliki protokol sendiri yang disesuaikan dengan keperluan. Penggunaan teknik isolasi DNA dengan kit dan manual memiliki kelebihan dan kekurangan. Metode konvensional memiliki kelebihan harga lebih murah dan digunakan secara luas sementara kekurangannya membutuhkan waktu yang relatif lama dan hasil yang diperoleh tergantung jenis sampel. Tahap pertama dalam isolasi DNA adalah proses perusakan atau penghancuran membran dan dinding sel. Pemecahan sel (lisis) merupakan tahapan dari awal isolasi DNA yang bertujuan untuk mengeluarkan isi sel (Holme dan Hazel, 1998). Tahap penghancuran sel atau jaringan memiliki beberapa cara yakni dengan cara fisik seperti menggerus sampel dengan menggunakan mortar dan pestle dalam nitrogen cair atau dengan menggunakan metode freezing-thawing dan iradiasi (Giacomazzi et al., 2005). Cara lain yakni dengan menggunakan kimiawi maupun enzimatik. Penghancuran dengan menggunakan kimiawi seperti penggunaan detergen yang dapat melarutkan lipid pada membran sel sehingga terjadi destabilisasi membran sel (Surzycki, 2000). Sementara cara enzimatik seperti menggunakan proteinase K seperti untuk melisiskan membran pada sel darah (Khosravinia et al., 2007) serta mendegradasi protein globular maupun rantai polipeptida dalam komponen sel (Brown, 2010; Surzycki (2000). Pada proses lisis dengan menggunakan detergen, sering digunakan sodium dodecyl sulphate (SDS) sebagai tahap pelisisan membran sel. Detergen tersebut selain berperan dalam melisiskan membran sel juga dapat berperan dalam mengurangi aktivitas enzim nuklease yang merupakan enzim pendegradasi DNA (Switzer, 1999). Selain digunakan SDS, detergen yang lain seperti cetyl trimethylammonium bromide (CTAB) juga sering dipakai untuk

5 melisiskan membran sel pada isolasi DNA tumbuhan (Bettelheim dan Landesberg, 2007). Parameter keberhasilan dalam penggunaan CTAB bergantung pada beberapa hal. Pertama, Konsentrasi NaCl harus di atas 1.0 M untuk mencegah terbentuknya kompleks CTAB-DNA. Karena jumlah air dalam pelet sel sulit diprediksi, maka penggunaan CTAB sebagai pemecah larutan harus dengan NaCl dengan konsentrasi minimal 1.4 M. Kedua, ekstrak dan larutan sel yang mengandung CTAB harus disimpan pada suhu ruang karena kompleks CTAB-DNA bersifatinsolublepada suhu di bawah 15 C. Ketiga, penggunaan CTAB dengan kemurnian yang baik akan menentukan kemurnian DNA yang didapatkan dan dengan sedikit sekali kontaminasi polisakarida. Setelah ditambahkan CTAB, sampel diinkubasikan pada suhu kamar. Tujuan inkubasi ini adalah untuk mencegah pengendapan CTAB karena CTAB akan mengendap pada suhu 15 C. Karena efektivitasnya dalam menghilangkan polisakarida, CTAB banyak digunakan untuk purifikasi DNA pada sel yang mengandung banyak polisakarida seperti terdapat pada sel tanaman dan bakteri gram negatif seperti Pseudomonas, Agrobacterium, dan Rhizobium (Surzycki, 2000). Dalam penggunaan buffer CTAB seringkali ditambahkan reagen-reagen lain seperti NaCl, EDTA, Tris-HCl, dan 2-mercaptoethanol. NaCl berfungsi untuk menghilangkan polisakarida sementara 2-mercaptoethanol befungsi untuk menghilangkan kandungan senyawa polifenol dalam sel tumbuhan (Ranjan et al., 2010). 2-mercaptoethanol dapat menghilangkan polifenol dalam sel tanaman dengan cara membentuk ikatan hidrogen dengan senyawa polifenol yang kemudian akan terpisah dengan DNA (Lodhi et al., 1994). Senyawa polifenol perlu dihilangkan agar diperoleh kualitas DNA yang baik (Moyo et al., 2008). Polifenol juga dapat menghambat reaksi dari enzim Taq polimerase pada saat dilakukan amplifikasi. Disamping itu polifenol akan mengurangi hasil ektraksi DNA serta mengurangi tingkat kemurnian DNA (Porebskiet al., 1997). Penggunaan 2-mercaptoethanol dengan pemanasan juga dapat mendenaturasi protein yang mengkontaminasi DNA (Walker dan Rapley, 2008). Konsentrasi dan ph dari bufer yang digunakan harus berada dalam rentang ph 5 sampai 12. Larutan buffer dengan ph rendah akan mengkibatkan depurifikasi dan mengakibatkan DNA terdistribusi ke fase fenol selama proses deproteinisasi. Sedangkan ph larutan yang tinggi di atas 12 akan mengakibatkan pemisahan untai ganda DNA. Fungsi larutan buffer adalah untuk menjaga struktur DNA selama proses penghancuran dan purifikasi sehingga memudahkan dalam menghilangkan protein dan RNA serta mencegah aktivitas enzim pendegradasi DNA dan mencegah perubahan pada molekul DNA. Untuk

6 mengoptimalkan fungsi larutan buffer, dibutuhkan konsentrasi, ph, kekuatan ion, dan penambahan inhibitor DNAase dan detergen (Surzycki 2000). Pada tahapan ekstraksi DNA, seringkali digunakan chelating agent seperti ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) yang berperan menginaktivasi enzim DNase yang dapat mendenaturasi DNA yang diisolasi, EDTA menginaktivasi enzim nuklease dengan cara mengikat ion magnesium dan kalsium yang dibutuhkan sebagai kofaktor enzim DNAse (Corkill dan Rapley, 2008). DNA yang telah diekstraksi dari dalam sel selanjutnya perlu dipisahkan dari kontaminan komponen penyusun sel lainnya seperti polisakarida dan protein agar DNA yang didapatkan memiliki kemurnian yang tinggi. Fenol seringkali digunakan sebagai pendenaturasi protein, ekstraksi dengan menggunakan fenol menyebabkan protein kehilangan kelarutannya dan mengalami presipitasi yang selanjutnya dapat dipisahkan dari DNA melalui sentrifugasi (Karp, 2008). Bettelheim dan Landesberg (2007) menyebutkan bahwa setelah sentrifugasi akan terbentuk 2 fase yang terpisah yakni fase organik pada lapisan bawah dan fase aquoeus (air) pada lapisan atas sedangkan DNA dan RNA akan berada pada fase aquoeus setelah sentrifugasi sedangkan protein yang terdenaturasi akan berada pada interfase dan lipid akan berada pada fase organik (Gambar 1). Selain fenol, dapat pula digunakan campuran fenol dan kloroform atau campuran fenol, kloroform, dan isoamil alkohol untuk mendenaturasi protein. Ekstrak DNA yang didapat seringkali juga terkontaminasi oleh RNA sehingga RNA dapat dipisahkan dari DNA ekstrak dengan cara pemberian RNAse (Birren, et al., 1997; Clark, 2010). Asam nukleat adalah molekul hidrofilik dan bersifat larut dalam air. Disamping itu, protein juga mengandung residu hidrofobik yang mengakibatkan protein larut dalam pelarut organik. Berdasarkan sifat ini, terdapat beberapa metode deproteinisasi berdasarkan pemilihan pelarut organik. Biasanya pelarut organik yang digunakan adalah fenol atau kloroform yang mengandung 4% isoamil alkohol. Penggunaan kloroform isoamil alkohol (CIA) berdasarkan perbedaan sifat pelarut organik. Kloroform tidak dapat bercampur dengan air dan kemampuannya untuk mendeproteinisasi berdasarkan kemampuan rantai polipeptida yang terdenaturasi untuk masuk atau termobilisasi ke dalam fase antara kloroform air. Konsentrasi protein yang tinggi pada fase antara tersebut dapat menyebabkan protein mengalami presipitasi. Sedangkan lipid dan senyawa organik lain akan terpisah pada lapisan kloroform (Clark, 2010). Proses deproteinisasi yang efektif bergantung pada besarnya fase antara kloroform-air. Proses ini dapat dilakukan dengan membentuk emulsi dari air dan kloroform. Hal ini hanya dapat dilakukan dengan penggojogan atau sentrifugasi yang kuat karena kloroform tidak

7 dapat bercampur dengan air. Isoamil alkohol berfungsi sebagai emulsifier dapat ditambahkan ke kloroform untuk membantu pembentukan emulsi dan meningkatkan luas permukaan kloroform-air yang mana protein akan mengalami presipitasi. Penggunaan kloroform isoamil alkohol ini memungkinkan untuk didapatkan DNA yang sangat murni, namun dengan ukuran yang terbatas ( bp). Fungsi lain dari penambahan CIA ini adalah untuk menghilangkan kompleks CTAB dan meninggalkan DNA pada fase aquoeus. DNA kemudian diikat dari faseaquoeus dengan presipitasi etanol (Surzycki, 2000). Setelah proses ekstraksi, DNA yang didapat dapat dipekatkan melalui presipitasi.pada umumnya digunakan etanol atau isopropanol dalam tahapan presipitasi. Kedua senyawa tersebut akan mempresipitasi DNA pada fase aquoeus sehingga DNA menggumpal membentuk struktur fiber dan terbentuk pellet setelah dilakukan sentrifugasi (Switzer, 1999).Hoelzel (1992) juga menambahkan bahwa presipitasi juga berfungsi untuk menghilangkan residu-residu kloroform yang berasal dari tahapan ekstraksi. Menurut Surzycki (2000), prinsip-prinsip presipitasi antara lain pertama, menurunkan kelarutan asam nukleat dalam air. Hal ini dikarenakan molekul air yang polar mengelilingi molekul DNA di larutan aquoeus. Muatan dipole positif dari air berinteraksi dengan muatan negatif pada gugus fosfodiester DNA. Interaksi ini meningkatkan kelarutan DNA dalam air. Isopropanol dapat bercampur dengan air, namun kurang polar dibandingkan air. Molekul isopropanol tidak dapat berinteraksi dengan gugus polar dari asam nukleat sehingga isopropanol adalah pelarut yang lemah bagi asam nukleat; kedua, penambahan isopropanol akan menghilangkan molekul air dalam larutan DNA sehingga DNA akan terpresipitasi; ketiga, penggunaan isopropanol dingin akan menurunkan aktivitas molekul air sehingga memudahkan presipitasi DNA. Pada tahapan presipitasi ini, DNA yang terpresipitasi akan terpisah dari residu-residu RNA dan protein yang masih tersisa. Residu tersebut juga mengalami koagulasinamun tidak membentuk struktur fiber dan berada dalam bentuk presipitat granular.pada saat etanol atau isopropanol dibuang dan pellet dikeringanginkan dalam tabung, maka pellet yang tersisa dalam tabung adalah DNA pekat.proses presipitasikembali dengan etanol atau isopropanol sebelum pellet dikeringanginkan dapat meningkatkan derajat kemurnian DNA yang diisolasi (Bettelheim dan Landesberg, 2007). Keller dan Mark (1989) menerangkan bahwa pencucian kembali pellet yang dipresipitasi oleh isopropanol dengan menggunakan etanol bertujuan untuk menghilangkan residu-residu garam yang masih tersisa. Garam-garam yang terlibat dalam proses ekstraksi bersifat kurang larut dalam isopropanol sehingga dapat terpresipitasi

8 bersama DNA, oleh sebab itu dibutuhkan presipitasi kembali dengan etanol setelah presipitasi dengan isopropanol untuk menghilangkan residu garam (Ausubel et al., 2003). Setelah dilakukan proses presipitasi dan dilakukan pencucian dengan etanol, maka etanol kemudian dibuang dan pellet dikeringanginkan, perlakuan tersebut bertujuan untuk menghilangkan residu etanol dari pelet DNA. Penghilangan residu etanol dilakukan dengan cara evaporasi karena etanol mudah menguap (Surzycki, 2000). Pada tahap pencucian biasanya etanol dicampur dengan ammonium asetat yang bertujuan untuk membantu memisahkan kontaminan yang tidak diinginkan seperti dntp dan oligosakarida yang terikat pada asam nukleat (Sambrook et al., 2001). Setelah pellet DNA dikeringanginkan, tahap selanjutnya adalah penambahan buffer TE ke dalam tabung yang berisi pellet dan kemudian disimpan di dalam freezer dengan suhu sekitar -20ºC. Verkuil et al. (2008) menyatakan bahwa buffer TE dan penyimpanan suhu pada -20ºC bertujuan agar sampel DNA yang telah diekstraksi dapat disimpan hingga waktu berminggu-minggu. Keller dan Mark (1989) juga menjelaskan bahwa pelarutan kembali dengan buffer TE juga dapat memisahkan antara RNA yang mempunyai berat molekul lebih rendah dibandingkan DNA sehingga DNA yang didapatkan tidak terkontaminasi oleh RNA dan DNA sangat stabil ketika disimpan dalam keadaan terpresipitasi pada suhu -20ºC. Isolasi DNA juga dapat dilakukan dengan menggunakan kit yang sudah diproduksi oleh beberapa perusahan untuk mempermudah dan mempercepat proses isolasi DNA. Kit isolasi juga disesuaikan dengan kebutuhan oleh konsumen dan jenis sel yang akan digunakan. Berikut adalah bagan contoh isolasi DNA tanaman dengan menggunakan Kit Nucleon Phytopure.

9 2.2 DNA DNA adalah polimer dari nukleotida-nukleotida. Nukleotida-nukleotida dalamdna dihubungkan satu dengan yang lainnya oleh ikatan fosfodiester, yaitu ikatan yang terjadi antara Carbon katida dari satu nukleotida terdiri dari sebuah gula pantosa (deoksiribosa), satu buah fosfat dan satu basa nitrogen. Basa nitrogen tersebut berikatan dengan carbon pertama dari gula deoksiribosa, sedangkan fosfat berikatan dengan Carbon kelima dari gula yang sama. Basa nitrogen yang menyusun nukleotida dikelompokan menjadi 2 yaitu: Purine, yaitu basa nitrogen yang strukturnya berupa dua cincin. Termasuk diantaranya adalah : adenin dan guanin. Primidin, yaitu basa nitrogen yang strukturnya berupa satu cincin. Termasuk diantaranya adalah : citosin dan timin.

10 Gb. 5. Struktur kimia dari DNA. Setiap molekul DNA terdiri dari sub unit deoksiribonukleotida monofosfat. Setiap unit tersebut tersusun dari kelompok fosfat yang berikatan dengan gula pada atom karbon no. 5 dengan Carbon no.3 dari gula berikutnya disebut ikatan fosfodiester (Wolf, 1993) Hukum Chargaff: Chargaff meneliti proporsi relatif dari purin dan purimidin dalam suatu DNA dari sejumlah organisma. Hasil penelitiannya menunjukkan bahwa dalam DNA dari organisma apapun jumlah A=T dan C=G. Dengan menggunakan difraksi sinar X diketahui bahwa DNA mempunyai susunan helix.

11 Watson dan Crick: Watson dan Crick menemukan bahwa DNA berbentuk doubel helix. Setiap molekul DNA terdiri dari dua rantai polinukleotida yang tersusun secara anti paralel membentuk struktur duobel helix. Gb. 6. DNA doubel helix. (a) Pengaturan gula, kelompok fosfat dan basa dalam DNA. (b) Letak atom-atom dan ikatan-ikatan dalam DNA. Basa-basa berpasangan dalam posisi mendatar, (c) Diagram yang menunjukkan DNA dalam konformasi B (Wolf, 1993). Dua rantai polinukleotida tersebut tersusun dalam a coiled double helix. Rantai gula dan fosfat membentuk rangka luar dari helix. Basa nitrogen-basa nitrogen yang melekat pada gula menonjol ke dalam pusat helix. Jarak antara 2 strand adalah 1,1 nm yang diisi oleh basa nitrogen Jarak antara 2 basa adalah 3,4 A Setiap putaran dalam helix terdapat 10 basa Setiap putaran dalam helix mempunyai jarak 34 A Kedua stran (rantai polinukleotida) anti paralel artinya suatu rantai mempunyai arah yang berlawanan dengan rantai pasangannya. Misalnya suatu stran berakhir dengan gugus 5 fosfat sedang rantai pasangannya berakhir dengan gugus 3 OH (hidroksil). Kedua rantai polinukleotida komplementer artinya urytan nukleotida pada suatu rantai menentukan urutan nukleotida pada rantai pasangannya. Antara satu basa nitrogen dengan basa pasangannya dihubungkan oleh ikatan hidrogen.

12 *) Dua ikatan hidrogen antara A dan T *) Tiga ikatan hidrogen antara C dan G Basa nitrogen A hanya dapat berpasangan dengan T, sedangkan C dengan G Kemungkinan jumlah urutan basa adalah tidak terbatas, urutan yang berbeda menkode informasi yang berlainan. Gb. 7. (a) Ikatan antara nukleotida-nukleotida membentuk asam nukleat dalam DNA dan (b) RNA (Wolf, 1993).

13 Gb. 8. Struktur fisik DNA. Perhatikan bahwa dua rantai gula-fosfat mempunyai arah yang berbeda. Orientasi demikian memungkinkan basa-basa nitrogen berpasangan secara komplemen (Wolf, 1993). Gb. 9. Diagram skematis yang menunjukkan ikatan hidrogen antara Adenin dengan Timin dan antara Goanin dengan Citosin (Wolf, 1993).

14 2.3 Komponen Sel Nukleus Nukleus, ditunjukkan pada gambar di bawah ini, hanya terdapat di sel eukariotik. Merupakan lokasi untuk sebagian besar pembuatan asam nukleat sel, seperti DNA dan RNA. Ahli biologi Denmark Joachim Hammerling melaksanakan percobaan ekperimental pada tahun Pekerjaan yang dilakukannya adalah menunjukkan peranan nukleus dalam mengatur bentuk dan ciri-ciri sel. Asam deoksiribosa, DNA, adalah pembawa fisik dari pewarisan dan dengan perkecualian DNA plastid (cpdna dan mdna, berturut-turut ditemukan dalam kloroplas dan mitokondria), semua DNA terbatas pada nukleus. Asam ribonukleat, RNA, dibentuk dalam nukleus menggunakan sekuen basa DNA sebagai template. RNA bergerak keluar ke dalam sitoplasma dan berfungsi dalam perakitan protein. Nukleolus adalah wilayah dari nukleus (biasanya dua nukleoli per nukleus) dimana ribosom dibangun. Gambar 1. Struktur nukleus. Kromatin, DNA yang terurai yang menempati ruangan dalam selubung nukleus. Selubung nukleus yang ditunjukkan di atas adalah struktur membran ganda. Berbagai pori terdapat pada selubung tersebut, menyebabkan RNA dan senyawa kimia lainnya dapat lewat, tetapi DNA tidak dapat lewat. Gambar 2. Struktur selubung nukleus dan pori nukleus

15 Gambar 3. Nukleus dengan pori nukleus. Sitoplasma juga berisi banyak ribosom Fungsi nukleus Memuat da 098n menyimpan informasi genetik, DNA, yang mentukan bagaimana sel Sakan berfungsi, sebagaimana struktur dasar dari sel. (beberapa organela: mitokondria dan kloroplas, memiliki beberapa DNA, tapi mayoritas sangat banyak DNA sel terdapat didalam nukleus Membuat semua RNA, termasuk RNA ribosomal, transfer dan messenger. Menyalin DNA sel utama melalui pembelahan sel Struktur Nukleus Gambar 4. Struktur nukleus dengan selubung nukleus

16 Selubung Nukleus Nukleus dibatasi oleh selubung nukleus Struktur membran ganda Dilubangi dengan pori-pori, terdiri dari RNA dan protein, dengan saluran untuk pertukaran substansi dengan sitoplasma sel. Pada elektron scaning mikrograf, permukaan pori-pori dari selubung nukleus menarik perhatian. Protein-protein melapisi pori-pori menentukan molekul mana yang dapat masuk dan meninggalkan nukleus. Permukaan terluar dari selubung nukleus dilapisi dengan ribosom Gambar 5. struktur ribosom. Gambar 6. Ribosom dan poliribosom pada sel hepar Nukleolus Massa DNA, RNA dan protein dengan konsentrasi kecil Dipergunakan dalam sintesis subunit ribosom Ribosom merupakan tempat untuk perakitan protein Ribosom terdiri dari dua subunit dan tersusun atas RNA dan protein, pada eukariot, ribosom adalah 80s, sedangkan ribosom pada prokariot adalah 70s, salah satu alasan beberapa antibiotik efektif melawan bakteri dan tidak merugikan kita. Gen-gen yang dibutuhkan untuk pembuatan gugus RNA ribosomal dalam nukleolus, dimana mereka mensintesis langsung RNA ribosomal. Subunit ribosomal dirakit dalam nukleolus dari rrna dan protein.

17 Subunit ribosomal yang lengkap bergerak ke dalam sitoplasma untuk melakukan fungsinya, dimana banyak terdapat pada permukan retikulum endoplasma kasar. Beberapa ribosom terdapat bebas didalam sitosol. Kromatin Kromatin terdiri dari kromosom, DNA molekul panjang, dikelilingi oleh protein yang dikenal sebagai histon. Kromatin nampak granular ketika diamati dengan mikroskop Beberapa tipe organism memiliki nomor set kromosom. Beberapa contoh : nyamuk = 6; Lili = 24; manusia = 46; simpanse, orangutan, gorilla, dan kentang = 48; amuba = 50, buntut kuda=216; pakis lidah ular = 1262 Sistem Endomembran Sel Tidak hanya melakukan pembentukan membran untuk membatasi sel, membran plasma, tapi di dalam sel kita menemukan sistem membran yang terdiri dari beberapa komponen, tiap komponen menghubungkan dengan membran plasma pada suatu waktu dan di lain waktu, dan pada selubung nukleus juga. Sebagai tambahan, fragmen membran kecil mungkin membentuk vesikel, digunakan untuk transport. Lipid dibentuk dalam sistem endomembran dan rantai polipeptida protein dimodifikasi dan ditranslokasi. Komponen Endomembran Retikulum endoplasma kasar dan ribosom yang berhubungan Retikulum endoplasma halus Komplek golgi Lisosom

18 Gambar 7. Komponen yang menyusun endomembran Retikulum Endoplasma Rangkaian membran berbentuk pipa rata atau saluran yang saling berhubungan dan kantung yang mengadakan pembagian pada sitoplasma, dan berjalan sepanjang sitosol. Proyeksi retikulum endoplasma berhubungan dengan selubung nukleus dengan reticulum endoplasma dan proyeksi lain berhubungan dengan membran plasma. Retikulum endoplasma mensintesis, mentranspor dan memisahkan kandungan intraseluler. Terdapat dua bentuk retikulum endoplasma : halus dan kasar. Retikulum endoplasma yang mempunyai ribosom yang melekat pada permukaannya disebut retikulum endoplasma protein. kasar. REK paling berlimpah dalam sel yang mensekresikan banyak

19 Gambar 8. Perbandingan retikulum endoplasma kasar dengan retikulum endoplasma halus Badan golgi Komplek golgi terdiri dari tumpukan membran seperti cakram rata yang memperoleh materialnya dari retikulum endoplasma. Fungsi golgi sebagai pusat pengolah untuk material yang kemudian dikemas dan didistribusikan pada organela-organela atau diekspor (sekresikan) dari sel dalam suatu vesikel yang diambil dari ujung-ujung membran golgi. Enzim pencernaan akan dikemas untuk lisosom dan hormon-hormon dikemas dalam vesikel untuk disekresikan. Vesikel dibentuk pada saat migrasi RE ke badan golgi, bergabung dan menerobos golgi dan dikemas dan ditandai untuk ekspor pada vesikel golgi. Badan-badan golgi juga memodifikasi material utama untuk diekspor. Karbohidrat bagian dari glikoprotein, sebagai contoh, ditambahkan dalam badan golgi.

20 Gambar 11. Vesikel: lisosom Vesikel Golgi Sebagian besar vesikel golgi adalah struktur sementara, dibentuk untuk mengirim molekul yang dimanufaktur untuk diekspor dari sel. Vesikel mungkin juga dibentuk di membran plasma untuk impor substansi ke dalam sel, sebuah proses yang disebut pinositosis, yang akan dibahas kemudian. Vesikel lainnya membentuk organela, yang mengandung enzim yang dibutukan untuk fungsi-fungsi khusus di dalam sel. Lisosom mengandung enzim hidrolitik, yang dapat memecah karbohidrat, protein, asam nukleat dan bermacam lipid. Lisosom Lisosom dimanufaktur dari enzim dan membran dari REK dan dikemas dalam komplek golgi. Lisosom bertanggung jawab untuk pembongkaran atau pemecahan komponen sel ketika tidak dibutuhkan lagi atau ketika rusak atau untuk kebutuhan daur ulang. Ini merupakan bagian normal dari pembaharuan dan pemeliharaan. Lisosom dapat juga menghancurkan atau mendegradasi bakteri dan substansi asing. Makrofag sebagai contoh, mengandung sejumlah besar lisosom. Amoba makan dari proses fagositosis. Vakuola makanan dibentuk bergabung dengan lisosom untuk pencernaan. Selama perkembangan, lisosom penting dalam sebagian pencernaan.

21 Peroksisom Peroksisom mengandung enzim-enzim yang memindahkan hidrogen dalam reaksi biokimia pada oksigen, membentuk hidrogen peroksida sebagai hasil samping. Karena H2O2 beracun, peroksisom juga mengandung enzim-enzim, katalase, yang merusak H2O2. Membran Sel Membran Sel Membran sel tersusun atas lemak dan protein (lipoprotein) sehingga bersifat permeabel (selektif permeabel). Fungsinya mengatur peredaran zat dari dan ke dalam sel. Organel ini terletak di luar sitoplasma, bersifat tipis dan elastis.

22 BAB III METODOLOGI PENELITIAN 3.1 Alat dan Bahan Alat a. Micropipet 0,5-10 ul, ul, ul. b. Tip biru. c. Tip kuning. d. Tip putih. e. Vortex. f. Microcentrifugator. g. Timbangan analitik. h. Inkubator. i. Kulkas. j. Alarm/stopwatch Bahan a. Genomic DNA mini kit (tissue) GT100, yang terdiri dari: - GT buffer. - GBT buffer. - W1 buffer. - Proteinase K. - GD column. - 2 ml collection tube. - Micropestle. b. Etanol absolut. c. Microtube 1,5 ml. d. Aquabidest. e. Jaringan 30 mg. 21 f. Aluminum foil.

23 3.2 Cara Kerja Ada empat (4) tahap dalam proses isolasi/purifikasi DNA dari sel: a. Menghancurkan jaringan secara mekanik dengan micropestle. b. Melisiskan sel secara kimiawi dengan GT buffer. c. Mempresipitasikan protein dengan proteinase K dan GBT buffer (mengandung garam chaotropic guanidine hidroklorida), kemudian (opsional) memurnikan DNA dari RNA dengan RNase A (10 mg/ml). d. Mengkonsentrasikan DNA genom yang diperoleh Urutan cara kerja: 1. Potong 20 mg jaringan dan masukkan dalam microtube. 2. Masukkan micropestle dalam microtube dan hancurkan jaringan hingga menjadi bubur. 3. Tambahkan 200 ul GT buffer ke microtube dan lanjutkan proses penghancuran dengan micropestle. 4. Tambahkan 20 ul proteinase K dan kocok dengan kuat. Inkubasi selama 30 menit pada suhu 60oC (selama inkubasi, bolak-balik tabung setiap 5 menit). 5. Tambahkan 200 ul GBT buffer dan kocok kuat selama 5 detik. 6. Inkubasi pada suhu 60oC selama minimal 20 menit hingga lisat jernih (selama inkubasi, bolak-balik tabung setiap 5 menit). 7. Panaskan elution buffer (100 ul per sampel) pada suhu 60oC. 8. Tambahkan 200 ul etanol absolut pada lisat kemudian kocok dengan kuat selama 10 detik. 9. Pasang GD column pada 2 ml collection tube. 10. Transfer campuran ke GD column. 11. Sentrifugasi pada g selama 2 menit. 12. Buang collection tube lalu transfer GD column ke collection tube baru. 13. Tambahkan 400 ul W1 buffer ke GD column lalu sentrifugasi pada g selama 1 menit. 14. Buang cairan hasil penyaringan lalu pasang kembali GD column pada collection tube. 15. Sentrifugasi pada g selama 3 menit. 16. Transfer GD column ke microtube baru. 17. Tambahkan 100 ml elution buffer yang telah dipanaskan ke bagian tengah matriks kolom. 18. Diamkan selama 5 menit. 19. Sentrifugasi pada g selama 1 menit.

24 20. Masukkan kembali cairan hasil penyaringan ke bagian tengah matriks kolom. 21. Ulangi sentrifugasi pada g selama 1 menit. 22. Simpan DNA pada suhu -20oC.

25 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN Pada praktikum ini digunakan hepar ayam sebanyak 20 mg, kemudian dimasukan kedalam microtube dan dengan bantuan micropestle jaringan hepar ayam dihancurkan hingga menjadi bubur, yang akan memudahkan proses isolasi DNA. Kemudian di tambahkan 200 ul GT Buffer pada microtube dan proses penghancuran dilanjutkan dengan micropestle. GT Buffer mengandung semacam detergent yang berfungsi untuk mendenaturasi protein dan menghancurkan protein histon dengan cara melilit protein histon tersebut sehingga yang tertinggal hanya DNA saja. Selanjutnya, ditambahkan 20 ul proteinase K yang bersifat katalisator dan berfungsi sebagai perusak enzim, melisiskan membran pada sel darah dan mendegradasi protein globular dalam komponen sel. Setelah itu di kocok dengan kuat untuk mencampur atau menghomogenasikan bahan-bahan tersebut. Lanjutkan dengan menginkubasi pada suhu 60 oc selama 30 menit dan setiap 5 menit tabung dibolak-balik. Setelah diinkubasi, ditambahkan 200 ul GBT Buffer dan kocok dengan kuat selama 5 detik. Penambahan GBT Buffer berfungsi untuk mengendapkan protein. Kemudian inkubasi lagi pada suhu 60oc selama 20 menit sampai lisat jernih dan bolak-balik setiap 5 menit sekali. Kemudian, tambahkan 200 ul etanol absolut pada lisat dan kocok dengan kuat selama 10 detik. Etanol absolut berfungsi untuk mendenaturasi DNA. Campuran tersebut kemudian di transfer ke GD Coloumn. GD coloumn akan menyaring DNA dengan prinsip afinitas sehingga DNA akan lengket pada saringan GD Coloumn. Selanjutnya di sentrifugasi selama 2 menit pada kecepatan rpm, lalu transfer GD coloumn ke collection tube yang baru. Kemudian ditambahkan 400 ul W1 buffer ke GD coloumn lalu sentrifugasi pada rpm selama 1 menit. Lalu di tambahkan 600 ul wash buffer ke dalam GD coloumn dan sentrifugasi pada rpm selama 1 menit. Hasil penyaringan dibuang dan pasang kembali GD coloumn pada collection tube lalu sentrifugasi pada rpm selama 3 menit. GD coloumn di transfer ke microtube baru, dan ditambahkan 100 ul elution buffer yang telah dipanaskan ke bagian tengah matriks coloumn dan diamkan selama 5 menit.

26 Pada saat praktikum pemberian elution buffer dibagi menjadi 2 kali pemberian, pertama 75 ul selama 3 menit dan 25 ul selama 2 menit. Elution buffer merupakan buffer untuk stabilitas DNA yang memiliki ph 7,8-8,2. Elution buffer ini berfungsi untuk mengelusi dan melepas DNA dari Coloumn. Lanjutkan dengan sentrifugasi pada rpm selama 1 menit. Cairan hasil penyaringan dimasukan kembali ke bagian tengah matriks coloumn dan ulangi sentrifugasi selama 1 menit pada rpm. Hasil sentrifugasi inilah yang didapatkan sebagai DNA murni. DNA dari sel hepar ayam ini bisa dianalisis dengan 2 cara yaitu elektroforesis dan spektofotometer. Jika DNA belum digunakan simpan DNA pada suhu -20oc. Prinsip-prinsip dalam melakukan isolasi DNA ada 2, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas. Teknik sentrifugasi tersebut dilakukan di dalam sebuah mesin yang bernama mesin sentrifugasi dengan kecepatan yang bervariasi. Proses Isolasi/ Purifikasi DNA dari sel ada 4 tahap yaitu menghancurkan jaringan secara mekanik, melisiskan sel secara kimiawi dengan GT Buffer, mempresipitasikan protein dengan proteinase K dan GBT Buffer(mengandung garam chaotropic guanidine hidrokloida), kemudian (opsional) memurnikan DNA dari RNA dengan RNAase (10 mg/ml) dan mengkonsentrasikan DNA genom yang diperoleh. Hasil dari isolasi DNA adalah didapatkan DNA yang murni, namun p ada saat praktikum tahap presipitasi protein tidak sempurna karena tidak ada Proteinase K sehingga hasil akhir yang seharusnya didapatkan DNA murni masih terdapat atau tercampur dengan Protein.

27 BAB V KESIMPULAN Isolasi DNA merupakan tahap awal dalam proses identifikasi DNA, sampel yang dapat diambil dalam isolasi dna pada manusia bisa dari sel mukosa pipi ( Saliva ) dan darah vena, untuk pengindentifikasian haruslah teliti agar hasil yang didapatkan bisa akurat. Ada empat (4) tahap dalam proses isolasi/purifikasi DNA dari sel yaitu, Menghancurkan jaringan secara mekanik dengan micropestle, Melisiskan sel secara kimiawi dengan GT buffer, Mempresipitasikan protein dengan proteinase K dan GBT buffer (mengandung garam chaotropic guanidine hidroklorida), kemudian (opsional) memurnikan DNA dari RNA dengan RNase A (10 mg/ml), Mengkonsentrasikan DNA genom yang diperoleh. DNA pada sampel hepar ayam dapat di isolasi dengan cara merusak dinding sel, mendenaturasi protein, mensentrifuge, dan presipitasi. Setelah DNA di isolasi, hasil yang didapatkan adalah DNA murni. DNA dapat dianalisis lebih lanjut dengan menggunakan teknik-teknik tertentu.

28 DAFTAR PUSTAKA Albert, B., Johnson, A., Lewis, J. Raff, M., Roberts, K., Walter, P Molecular Biology of the Cell. 4 th ed. Garland Science. New York [[ Arhan Laporan Pratikum isolasi DNA. Farabee, M.J Cells II: Cellular Organization. Wikibook. Guyton and Hall.2007.Buku Ajar Fisiologi Kedokteran.Jakarta: EGC. Istanti, Annie Biologi Sel. Malang: jurusan Biologi FMIPA UM. Murray, Robert K.2009.Biokimia Harper.Jakarta:EGC Sadikin, Mohamad Biokimia Enzim. Jakarta : Widya Medika. Soewoto, Hafiz, dkk Biokimia Eksperimen Laboratorium.Jakarta: Widya Medika. Solomon, E.P, Berg, L.R, Martin, D.W Biology. 6th Ed. Brooks/Cole Thompson Learning. USA Stryer, L Biochemistry. 3rd ed. W.H. Freeman and Company. New York White J. M Cell Structure and Function. University of Virginia Health System Wolfe, S.L Molecular and Cellular Biology. Wadsworth Publishing Company. California Yusminah, Oslan Jumadi.2009.Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta: BambatangHala.

29 LAMPIRAN

30