LAMPIRAN. Lampiran 1. Pembuatan Larutan Stok dan Buffer

Transkripsi

1 LAMPIRAN Lampiran 1. Pembuatan Larutan Stok dan Buffer A. LARUTAN STOK CTAB 5 % (100 ml) - Ditimbang NaCl sebanyak 2.0 gram - Ditimbang CTAB sebanyak 5.0 gram. - Dimasukkan bahan kimia ke dalam erlenmeyer dan ditambahkan 100 ml aquades. Tris HCl 1 M ph 8.0 (100 ml) - Ditimbang Tris sebanyak gram. - Dimasukkan Tris ke dalam erlenmeyer dan ditambahkan 80 ml aquades, diaduk di atas hot plate menggunakan stirrer. - Diatur ph mencapai 8 dengan HCl (4.2 ml) - Dimasukkan ke dalam gelas ukur, lalu ditambahkan aquades hingga volume larutan mencapai 100 ml. Tris HCl 1 M ph 7.4 (50 m) - Ditimbang Tris sebanyak gram. - Dimasukkan Tris ke dalam erlenmeyer dan ditambahkan 30 ml aquades, diaduk di atas hot plate menggunakan stirrer. - Diatur ph mencapai 7.4 dengan NaOH 2.5 M. - Dimasukkan ke dalam gelas ukur lalu ditambahkan aquades hingga volume larutan mencapai 50 ml. EDTA O.5 M ph 8.0 (100 ml) - Ditimbang EDTA (ethylenediamine tetraacetic) sebanyak gram

2 29 - Ditimbang NaOH sebanyak 2.0 gram. - Dimasukkan ke dalam erlenmeyer dan ditambahkan 80 ml aquades, diaduk di atas hot plate menggunakan stirrer. - Diatur ph mencapai 8 dengan HCl. - Dimasukkan ke dalam gelas ukur, lalu ditambahkan aquades hingga volume larutan mencapai 100 ml. NaCl 5 M ph 7.7 (l00 ml) - Ditimbang NaCl sebanyak gram. - Masukkan ke dalam erlenmeyer dan ditambahkan 80 ml aquades, diaduk di atas hot plate menggunakan stirrer. - Dimasukkan ke dalam gelas ukur,, lalu ditambahkan aquades hingga volume larutan mencapai 100 ml. B. LARUTAN BUFFER Buffer Ekstraksi/CTAB (100 ml) - Dicampurkan 40 ml CTAB 5%, 25.1 ml NaCl 5 M, 4 ml EDTA 0.5 M ph 8.0, 10 ml Tris HCl 1 M ph 8.0 dan 20.8 ml aquades. Buffer TAE 50 X (100 ml) - Dicampurkan 24.2 ml Tris HCl 1 M ph 7.4, 5.7 ml Asam Asetat Glasial, 10 ml EDTA 0.5 M PH 8.0, dan aquades hingga volume larutan menjadi 100 ml. Buffer TAE 1X (700 ml) - Dilarutkankan 70 ml Buffer TAE 10 X dengan dan 630 ml aquades. Buffer TE (50 ml) - Dicampurkan 0.5 ml Tris HCl 1 M ph 8.0, 0.1 ml EDTA 0.5 M ph 8.0 dan 49.4 ml aquades.

3 30 KIAA (Kloroform : Isoamilalkohol = 24 : 1 (50 ml) - Dicampurkan 48 ml Kloroform dan 2 ml Isoamilalkohol. Etanol 70 % (100 ml) - Dicampurkan 70 ml Etanol dengan 30 ml aquades.

4 31 Lampiran 2. Alur Penelitian Sampel Daun Bawang Merah Isolasi DNA Uji Kuantitas PCR-RAPD Elektroforesis Analisis Hasil mplifikasi PCR

5 32 Lampiran 3. Proses Isolasi dan Purifikasi Sterilisasi alat dan bahan dengan autoklaf (121 o C 1 atm) Daun dibersihkan dan ditimbang sampel 3 gr Daun digerus ditambahkan 0.1 g PVPP dan 0.5 ml b.e CTAB Dimasukkan ke tabung mikro 2 ml yang diisi 1 ml b.e CTAB Ditambahkan 10 µl β-mercaptoetanol, lalu divortex hingga rata. Tabung diinkubasi dalam waterbath selama 30 menit pada suhu 65 0 C, setiap 10 menit sekali tabung dibolak balik dengan perlahan Ditambahkan 1 ml larutan KIAA ke dalam tabung dan dikocok hingga homogen. Tabung disentrifugasi selama 10 menit kecepatan rpm Fase atas dipindahkan ke tabung lain, ditambahkan 1 ml larutan KIAA. Tabung disentrifugasi selama 10 menit kecepatan rpm Fase atas dipindahkan ke tabung lain, ditambahkan 1 ml isopropanol dingin Tabung dikocok perlahan dan diperhatikan adanya benang-benang halus putih yang muncul. Inkubasi suhu 4 o C selama 30 menit. Tabung disentrifugasi selama 10 menit kecepatan rpm, lalu cairan isopropanol dibuang Setelah cairan dibuang, kemudian pellet dicuci dengan etanol absolut lalu dikeringanginkan

6 33 Ditambahkan 30 µl buffer TE dan pellet DNA disuspensikan ke dalam buffer. Stok DNA yang diperoleh disimpan salam freezer pada suhu ± 20 o C bila tidak digunakan.

7 34 Lampiran 4. Proses PCR-RAPD Komposisi Master Mix volume 25 µl Go Taq PCR 12.5 µl Nuclease free wter 8.0 µl Primer c.p 2.5 µl DNA templak 2.0 µl Tabel 1. Proses Amplifikasi PCR No. Tahapan Suhu Jumlah Siklus Waktu 1 Denaturasi awal 94 o C 1 2 menit 2 Denaturasi 94 o C 45 1 menit 3 Annealing 36 o C 45 1 menit 4 Ekstension 72 o C 45 2 menit 5 Ekstension akhir 72 o C 1 10 menit 6 Kondisi akhir PCR 4 o C 1 Tak terbatas Total waktu ± 3 jam 51 menit