: ASTRID SAFIRA IDHAM

Transkripsi

1 A S T R I D S A F I R A I D H A M a blog with many benefit SKIP TO CONTENT HOME ABOUT LAPORAN PRAKTIKUM : ISOLASI DNA MAY 29, 2014 / ASTRIDSAFIRAIDHAM LAPORAN PRAKTIKUM GENETIKA PERCOBAAN II ISOLASI DNA NAMA : ASTRID SAFIRA IDHAM NIM : H HARI/TANGGAL : KAMIS, 13 MARET 2014 KELOMPOK : VI (ENAM) B ASISTEN : ANDRI NINDYA LABORATORIUM GENETIKA JURUSAN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS HASANUDDIN MAKASSAR 2014

2 BAB I PENDAHULUAN I.1 Latar Belakang Deoxyribonucleic acid atau DNA merupakan senyawa kimia yang paling penting dalam makhluk hidup.dna merupakan senyawa yang mengandung informasi genetik makhluk hidup dari satu generasi ke generasi selanjutnya. Keseluruhan DNA dalam suatu sel akan membentuk genom. Genom meliputi bagian gen yang fungsional maupun non-fungsional dalam sel organisme. DNA genom meliputi gen danintergen (Suryo, 2004). DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler. DNA terdapat pada nukleus, mitikondria, dan kloroplas. Perbedaan ketiganya adalah DNA nukleus berbentuk linier dan berasosiasi sangat erat dengan protein histon, sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular dan tidak berasosiasi dengan protein histon. Selain itu DNA mitokondria dan kloroplas memiliki ciri khas, yaitu hanya mewariskan sifat-sifat yang berasal dari garis ibu. Sedangkan DNA nukleus memiliki pola pewarisan sifat dari kedua orangtua. Dilihat dari organismenya, struktur DNA prokariot tidak memiliki protein histon dan berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk linier dan memiliki protein histon (Kirsman, 2010). Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari DNA. Salah satu prinsipisolasi DNA yaitu dengan sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan teknik untukmemisahkan campuran berdasarkan berat

3 molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung. Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah (Rachmat, 2012). I.2 Tujuan Percobaan Adapun tujuan yang akan dicapai pada percobaan isolasi DNA ini yaitu untuk mengetahui cara memisahkan (mengisolasi) DNA dari 2 jenis buah yang dijadikan sebagai sampel, serta untuk mengetahui keaktifan detergen dalam proses isolasi DNA pada sampel buah. I.3 Waktu dan Tempat Percobaan Percobaan ini dilaksanakan pada hari Kamis, 13 Maret 2014, pukul WITA. Percobaan ini bertempat di Laboratorium Biologi Dasar, Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Hsanuddin, Makassar.

4 BAB II TINJAUAN PUSTAKA Isolasi DNA adalah proses pengeluaran DNA dari tempatnya berada (ekstraksi atau lisis) biasanya dilakukan dengan homogenasi dan penambahan buffer ekstraksi atau buffer lisis untuk mencegah DNA rusak (Yuwono, 2008). Pada sel eukariotik termasuk tanaman dan hewan bagian terbesar dari DNA berada pada nukleus yaitu organel yang dipisahkan dari sitoplasma dengan membran. Nukleus terdiri dari 90 % keseluruhan DNA seluler. Sisa DNA adalah organel lain seperti mitokondria dan kloroplas. Karena DNA terdapat pada nukleus, maka perlu adanya metode pelisisan sel sampai pemanenan sel. Dimana metode tersebut merupakan bagian dari metode isolasi DNA (Elrod, 2007). Pemisahan DNA dari materi seluler lainnya merupakan hal yang signifikan dan mengharuskan penyallinan DNA menjadi RNA dan translasi RNA menjadi protein berlangsung dalam kompartemen( ruang ) yang berbeda yaitu secara berturut-turut dalam nucleus dan sitoplasma ( Elrod, 2007 ).

5 Terdapat organel-organel bermembran ganda di dalam sitoplasma, termasuk mitokondria baik pada tumbuhan maupun hewan. Oleh karena itu perlu dilakukan isolasi DNA pada tanaman dan hewan untuk mengetahui dan mempelajari DNA dari tanaman dan hewan tersebut. Sel eukariotik memiliki DNA lebih banyak, lengkap dengan komponen-komponen lain. DNA tanaman dan hewan tersimpan dalam nucleusyang terbungkus oleh membran. Isolasi DNA merupakan langkah yang tepat untuk mempelajari DNA. Prinsipnya ada dua, yaitu sentrifugasi dan presipitasi.sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung. Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah. Presipitasi merupakan langkah yang dilakukan untuk mengendapkan suatu komponen dari campuran (Albert, 1994). DNA pada makhluk hidup dapat diisolasi secara sederhana. Pengisolasian DNA secara sederhana dapat dilakukan dengan memecahkan dinding sel, membran plasma dan membran inti baik secara mekanik maupun secara kimiawi. Isolasi DNA merupakan suatu teknik yang digunakan untuk memperoleh DNA murni, yaitu tanpa protein dan RNA dari suatu sel dalam jaringan. Pemecahan dinding sel secara mekanik dapat dilakukan dengan pemblenderan atau penggerus menggunakan mortar dan pistil. Sedangkan secara kimiawi dapat dilakukan dengan pemberian detergen. Penambahan

6 sabun cair dan garam dapur adalah untuk melisiskan membran inti untuk mengeluarkan isi inti sel yang berisi DNA (Rachmat, 2012). Isolasi DNA dapat dilakukan melalui tahapan-tahapan antara lain: preparasi ekstrak sel, pemurnian DNA dari ekstrsk sel dan presipitasi DNA. Meskipun isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis atau bagian tanaman dapat memberikan hasil yang berbeda, hal ini dikarenakan adanya senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA. Jika isolasi DNA dilakukan dengan sample buah, maka kadar air pada masing-masing buah berbeda, dapat memberi hasil yang berbeda-beda pula. Semakin tinggi kadar air, maka sel yang terlarut di dalam ekstrak akan semakin sedikit, sehingga DNA yang terpretisipasi juga akan sedikit (Kirsman, 2010). Penambahan deterjen dalam isolasi DNA dapat menyebabkan rusaknya membrane sel, melalui ikatan yang dibentuk melalui sisi hidrofobik deterjen dengan protein dan lemak pada membrane membentuk senyawa lipid protein-deterjen kompleks. Senyawa tersebut dapat terbentuk karena protein dan lipid memiliki ujung hidrofilik dan hidrofobik, demikian juga dengan deterjen, sehingga dapat membentuk suatu ikatan kimia (Kirsman, 2010). Prinsip prinsip dalam mengisolasi DNA (Tohib, 2012) : 1. melisis sel secara fisik, dengan cara penggerusan. 2. pemecahan dinding sel.

7 3. pemecahan membran sel. 4. pemisahan DNA dari bahan yang lain. Dalam isolasi DNA, bahan yang kita gunakan biasanya berupa jaringan tumbuhan atau jaringan hewan, untuk itu langkah pertama yang harus kita lakukan adalah memecahkan jaringan menjadi sel-sel yang mandiri. Proses dilakukan secara mekanik atau fisik dengan menumbuk atau menggerus bahan yang akan kita gunakan dengan mortar atau blender. Kedua adalah memecahkan dinding sel dan membran sel lapisan pembungkus DNA. struktur utama pembentuk membran dan dinding sel adalah lemak, untuk itu kita gunakan deterjen dan garam dapur. Kedua bahan ini digunakan untuk melubangi dan merusak sel sehingga isi inti sel (DNA) bisa keluar (Tohib, 2012). Tahap selanjutnya adalah pemisahan DNA dari bahan yang lain. Pemisahan dilakukan dengan menggunakan ethanol/alkohol dingin berkonsentrasi 90-95%. Ethanol/Alkohol tidak melarutkan DNA dan berat jenis alkohol yang lebih ringan dari air membuat DNA naik dan melayang-layang di permukaan (Tohib, 2012). CTAB atau Cetyl trimethylammonium bromide merupakan sejenis deterjen yang dapat mendegradasi dinding sel, denaturasi protein, memisahkan karbohidrat, merusak membran sel dan melarutkan DNA. Apabila dinding sel terdegradasi maka semua isi sel dapat keluar termasuk DNA dan dilepaskan ke dalam buffer ekstraksi.dalam proses isolasi DNA tanaman, penambahan senyawa pereduksi seperti merchaptoetanol dapat mencegah

8 proses oksidasi senyawa fenolik sehingga menghambat aktivitas radikal bebas yang dihasilkan oleh oksidasi fenol terhadap asam nukleat. Merchaptoetanol juga berfungsi untuk melindungi RNA dari senyawa quinon, disulphide, peroksida, poliphenoksidase, dan protein. Proses pemansan pertama bertujuan untuk melarutkan CTAB dan mercaptoetanol. Sedangkan pemanasan yang kedua bertujuan untuk memdegradasi protein dan dinding sel (Tohib, 2012). Klorofrom dan isoamilalkohol (CIAA) berfungsi untuk mengekstrak dan dan mengendapkan komponen polisakarida di dalam buffer ektraksi yang mengkontaminasi larutan DNA. Pemberian isopropanol dan etanol dilakukan agar terjadi dehidrasi DNA sehingga terjadi presipitasi. Setelah pemberian etanol, pellet yang dipeoleh dikeringanginkan. Hal ini bertujuan untuk mengeringkan pellet dari sisa-sisa buffer maupun etanol.tahapan terakhir dari ektraksi ini adalah penambahan buffer TE. Buffer TE tris electrophoresisberfungsi untuk melarutkan DNA yangdihasilkan dan menjagadna agar tidak mudah rusak. Dalam buffer TE mengandung EDTA atau Ethylene Diamine Tetra Acid yang berfungsi sebagai senyawa pengkelat yang mengikat ion Magnesium, yaitu kofaktor yang diperlukan untuk altivtas berbagai enzim nuclease. Metode ekstraksi DNA dengan CTAB akan menghasilkan pita DNA yang berukuran tebal dan dapat memisahkan DNA dari polisakarida karena adanya perbedaan karakteristik kelarutan (differensial of solubility). Disamping deperoleh fragmen DNA, dengan metode CTAB juga akan diperoleh RNA dengan pita tipis yang terletak jauh berada di bawah pita DNA. Keberadaan pita RNA tergantung bahan yang diekstraksi (Asris, 2010).

9 Metode ini tidak membutuhkan biaya yang lebih mahal dibandingkan dengan menggunakan kit. Selain itu, kelebihan dari ektraksi ini adalah pita DNA yangdiproleh lebih tebal bila dibandinglan dengan ektraksi metode fenol dan tanpa fenol. Akan tetapi, dari hasil dengan metode ini masih terdapat pita smear dan DNA yang dihasilkan lebih sedikit daripada ektraksi dengan menggunakan kit. Kendala yang umum terjadi dalam ekstraksi CTAB adalah adanya inhibitor pada inang, rendahnya konsentrasi vius dan pengaruh cara maupun lama waktu penyimpanan (Asris, 2010). BAB III

10 METODE PERCOBAAN III.1 Alat dan Bahan III.1.1 Alat Alat alat yang digunakan dalam percobaan ini adalah alat tulis menulis, tabung reaksi, timbangan, gelas aqua, pisau, batang pengaduk, spatula, blender, pipet tetes, dan mesin vortex. III.1.2 Bahan Bahan yang digunakan dalam percobaan ini adalah buah tomat Solanum lycopercium dan pepaya Carica papaya, detergen (Rinso cair, Surf bubuk, dan sabun bukrim), Aquades, garam dapur, Ethanol 96 %, dan kertas saring. III.2 Prosedur Kerja Adapun langkah-langkah kerja yang dilakukan dalam percobaan ini adalah sebagai berikut: 1. Buah dipotong menjadi ukuran yang lebih kecil. 2. Buah yang telah dipotong kemudian ditimbang sampai beratnya 100 gr. 3. Diambil 100 gr buah dan 100 ml aquades, kemudian diblender hingga halus, kira-kira diblender selama 40 detik. 4. Masing-masing buah yang telah diblender dimasukkan kedalam 3 tabung reaksi yang berbeda sebanyak 4 ml. 5. Dilarutkan detergen (Rinso, Surf, dan Bukrim) kedalam 60 ml aquades, kemudian diaduk hingga larut.

11 6. Tiga jenis larutan detergen kemudian dimasukkan kedalam masing-masing tabung reaksi yang berisi jus buah sebanyak 4 ml. 7. Tambahkan 1 spatula garam dapur kedalam masing-masing tabung reaksi, kemudian diaduk hingga larut. 8. Campuran kemudian disaring sebanyak 2 kali dengan kertas saring. 9. Lalu ditambahkan ethanol 96 % sebanyak 5 ml kedalam masing-masing campuran. 10. Larutan kemudian dihomogenkan dengan menggunakan mesin vortex. 11. Amati dan catat hasil yang tampak dari keseluruhan proses, meliputi warna, serta sedikit banyaknya DNA yang terbentuk.

12 DAFTAR PUSTAKA Albert, B., Biologi Molekuler Sel Edisi Kedua. PT. Gramedia Pustaka Utama. JJJJJJJakarta. Asris., Definisi Isolasi DNA dan Manfaat Isolasi DNA. Diakses pada tanggal 17 Maret 2014, pada pukul WITA. Elrod, S., Genetika Edisi Keempat. Erlangga. Jakarta. Kirsman, 2010.Isolasi DNA Buah. Diakses pada tttttttttanggal 17 Maret 2014, pada pukul WITA. Rachmat, Isolasi DNA. Diakses pada ssssssstanggal 17 Maret 2014, pada pukul WITA.

13 Suryo, Genetika Strata 1. Universitas Gadjah Mada. Yogyakarta. Tohib, Macam Metode Isolasi DNA. Diakses pada tttttttangga17 Maret 2014, pada pukul WITA. Yuwono, T., Biologi Molekuler. Erlangga. Jakarta. BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN IV.1 Hasil Percobaan IV.1.1 Gambar Hasil Percobaan JENIS BUAH SEBELUM SESUDAH

14 1.PEPAYA Carica papaya (bubuk, cair, krim) (bubuk, cair, krim) 2.TomatSolanu m lycopercium (krim, bubuk, cair) (bubuk, cair, krim) IV.1.2 Tabel Pengamatan HASIL PERCOBAAN JENIS BUAH PERLAKUAN WARNA WAKTU JUMLAH Detergen Bubuk Putih bening Cepat + + Detergen Cair Kuning bening Lambat + + Pepaya Carica papaya Detergen Krim Kuning pucat Sedang + + Detergen Bubuk Putih bening Cepat + + Tomat Detergen Cair Bening Lambat Solanum lycoperciu m Detergen Krim Kuning Sedang + + +

15 IV.2 Pembahasan Prinsip utama dalam isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran (lisis), ektraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA. Selain itu ada 2 prinsip lagi dalam melakukan isolasi DNA, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas. Teknik sentrifugasi tersebut dilakukan di dalam sebuah mesin yang bernama mesin sentrifugasi dengan kecepatan yang bervariasi. Dalam percobaan ini, kami melakukan isolasi DNA yang berasal dari 2 jenis buah yang memiliki kandungan air yang berbeda. Tujuan dari percobaan ini adalah untuk mengisolasi atau memisahkan DNA yang berasal dari tumbuhan. Metode yang dilakukan dalam percobaan ini adalah penghancuran (lisis) serta ekstraksi. Perlakuan pertama yang diberikan pada buah yaitu mengupas serta memotongnya menajadi ukuran yang lebih kecil, hal ini dilakukan agar pada saat penghancuran buah mudah dihancurkan menjadi partikel partikel yang lebih kecil. Tahap selanjutnya yaitu menambahkan campuran detergen dengan air, hal ini bertujuan untuk merusak membran sel dari kedua buah tersebut. Perusakan membran sel terjadi akibat adanya ikatan kimia yang

16 terbentuk antara detergen dengan zat-zat yang ada pada buah. Setelah penambahan detergen tahap selanjutnya yaitu penambahana garam dapur sebanyak 1 spatula ke masing-masing tabung yang berisi campuran buah dan detergen, tujuan dari penambahan garam adalah untuk memudahkan pemisahan benangbenang DNA dari campuran sehingga benang-benang tersebut akan mudah diamati. Hal ini terjadi karena Na + dalam garam dapat membentuk ikatan pada kutub negative dari ikatan fosfat DNA.Setelah larutan ditambahkan garam larutan kemudian dihomogenkan pada mesin vortex. Tahap selanjutnya yaitu penambahan ethanol 96 %, penambahan ini bertujuan untuk mempermudah terjadinya presipitasi pada benang-benang DNA.Ethanol tersebut mampu membawa asam nukleat yang terdapat dalam campuran naik ke permukaan, untuk kemudian diendapkan.setelah ditambahkan ethanol larutan kemudian kembali dihomogenkan pada mesin vortex. Dari percobaan isolasi DNA diperoleh hasil yaitu, perbedaan warna pada masing-masing tabung reaksi yang berisi campuran buah, detergen, garam, dan ethanol.perubahan warna yang terjadi diakibatkan oleh perbedaan susunan DNA yang terdapat pada setiap buah. Selain itu perbedaan yang mencolok dari keenam larutan tersebut adalah terdapat banyak atau sedikit endapan asam nukleat pada dasar tabung reaksi. Hal ini terjadi akibat adanya perbedaan kandungan zat serta penggunaan jenis detergen yang berbeda

17 maupun kandungan air dari masing-masing buah tidak sama. Dari percobaan tidak diperoleh DNA murni melainkan hanya DNA kasar atau benang benang halus (supernatant) dalam jumlah yang sedikit serta endapan putih yang terlihat. Dari kedua buah DNA kasar yang paling terlihat ada pada buah pepaya, hal itu terjadi akibat kandungan air pepaya lebih sedikit dari tomat sehingga ekstrak dan DNA kasar yang dihasilkan oleh pepaya lebih banyak daripada buah tomat, selain itu endapan putih pada buah pepaya lebih banyak daripada buah tomat.

18 BAB V PENUTUP V.1 Kesimpulan Dari percobaan isolasi DNA yang telah dilakukan dapat diketahui metode atau cara bagaimana mengisolasi DNA dari buah yang dijadikan sebagai sampel. Yaitu melalu cara penghancuran (lisis), ekstraksi, serta pemurnian. Penggunaan detergen yang berbeda dalam percobaan dilakukan untuk mengetahui detergen dalam bentuk apa yang paling aktif dalam menghancurkan membran sel pada setiap sampel buah.setelah dilakukan percobaan ternyata detergen bubuk menghasilkan DNA kasar yang lebih terlihat serta endapan putih yang lebih banyak. V.2 Saran V.2.1 Saran Untuk Laboratorium Sebaiknya laboratorium menyediakan alat yang cukup memadai serta alat yang cukup banyak, agar praktikum dalam berjalan dengan efisien. V.2.2 Saran Untuk Asisten Diharapkan agar terus memperhatikan dan membimbing praktikan selama lab berlangsung, agar praktikum berjalan dengan baik.

19 Ade puji setyawati Biologi inspirasi Jumat, 14 November 2014 ISOLASI DNA TANAMAN ISOLASI DNA TANAMAN Ade Puji Setyawati 1) Drh. Bhintarti S. Hastari, M. Biomed 2) Festy Auliyaur Rahmah, S. Si 2) Nugroho Adi Maulana 3) Indhina Reihannisha 3) 1) Mahasiswa Jurusan Biologi, Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta 2) Dosen Praktikum Biologi Molekuler 3) Asisten Praktikum Biologi Molekuler Jl. Ir. H. Djuanda, Tangerang Selatan 15412, Indonesia Adebio12@gmail.com Jum at, 24 Oktober 2014 ABSTRAK DNA merupakan senyawa yang mengandung informasi genetik makhluk hidup dari satu generasi ke generasi selanjutnya. DNA pada sel tanaman dibagi menjadi dua yaitu DNA intrakromosomal dan DNA ekstrakromosomal. Prisnsip utama dalam isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran (lisis), ektraksi atau pemisahan DNA dari dinding sel, membrane sel dan protein, serta pemurnian DNA. Isolasi DNA sawi hijau ini dilakukan dengan mengambil potongan daun muda kemudian daun tersebut diekstraksi hingga didapatkan DNA murni dari tanaman

20 sawi hijau tersebut. Praktikum ini dilakukan dengan tujuan agar praktikan mampu melakukan isolasi DNA dari tanaman Sawi Hijau (Brassica sp.). Hasil setelah penambahan kloroform dan isoamil alkohol (24:1) 1x volum sampel dan disentrifugasi terbentuk 2 fase yaitu fase aqoueous dan organik. Setelah penambahan isopropanol dingin terlihat benang-benang tipis DNA. Kata kunci : Tanaman, daun Sawi hijau, pemurnian DNA I. Dasar Teori

21 Deoxyribo Nucleic acid (DNA) merupakan senyawa kimia yang paling penting dalam makhluk hidup. DNA merupakan senyawa yang mengandung informasi genetik makhluk hidup dari satu generasi ke generasi selanjutnya. DNA eukariot tidak hanya dijumpai pada nukleus, tetapi dapat ditemukan pada mitokondria dan kloroplas. DNA yang diisolasi dari kloroplas menunjukkan sifat berbentuk sirkular, terdiri dari untai ganda, replikasi semikonservatif, dan bebas dari protein histon. DNA kloroplas penting dalam proses fotosintesis. DNA pada sel tanaman dibagi menjadi dua yaitu DNA intrakromosomal dan DNA ekstrakromosomal (Donata, 2007). DNA intrkromosomal merupakan DNA yang ditemukan di inti sel. Sedangkan DNA ekstrakromosomal merupakan DNA yang ditemukan di sitoplasma sel. Pada sel-sel tanaman DNA ekstrakromosal ini dapat ditemukan di mitokondria dan kloroplas (Farrel, 2004). Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari DNA, salah satu prinsip isolasi DNA yaitu dengan sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung (Muladno, 2002). Isolasi DNA dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan DNA dari bahan lain seperti protein, lemak, dan karbohidrat. Prinsip utama dalam isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran (lisis), ektraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA (Donata, 2007). Terdapat berbagai macam metode isolasi DNA tanaman. Metode-metode tersebut menggunakan CTAB dan SDS dalam ekstraksi DNA (Donata, 2007). Beberapa metode isolasi DNA juga menggunakan nitrogen cair pada tahap awal ekstraksi untuk menghasilkan kualitas DNA terbaik. (Pharmawati, 2009). Sering digunakan untuk ekstraksi DNA tanaman(yuwono, 2008). Metode tersebut pada dasarnya memiliki prinsip yang sama, namun ada beberapa hal tertentu yang biasanya digunakan modifikasi untuk dapat menghancurkan inhibitor yang ada di dalam masing-masing sumber spesimen. Komponen nukleotida DNA adalah gula, fosfat, dan basa nitrogen. Komponen gula pada DNA adalah gula deoksiribosa, yaitu gula ribose yang kehilangan satu atom oksigen. Basa yang ada pada DNA ada dua macam, yaitu purin dan pirimidin. Purin terbagi lagi menjadi dua macam, yaitu adenin dan guanin. Pirimidin terdiri dari dua jenis, yaitu timin dansitosin (Yuwono, 2008). Nukleus terdiri dari 90 % keseluruhan DNA seluler. Sisa DNA adalah organel lain seperti mitokondria dan kloroplas (Heldt, 2005). Karena DNA terdapat pada nukleus, maka perlu adanya metode pelisisan sel sampai pemanenan sel. Sawi hijau (Brassica sp.) merupakan jenis sayur yang digemari oleh masyarakat Indonesia. Kelebihan-kelebihan sawi antara lain baik bagi kesehatan tubuh, mampu tumbuh baik baik di dataran rendah maupun dataran tinggi, tahan terhadap air hujan, dapat dipanen sepanjang tahun tidak tergantung dengan musim, masa panennya cukup pendek, yaitu sekitar 40 hari setelah tanam dan sawi mempunyai nilai ekonomi cukup tinggi setelah kubis krop, kubis bunga, dan brokoli (Ardiana, 2009).

22 Dengan mengetahui DNA tanaman sawi maka dapat menghasilkan potensi yang cukup besar untuk menghasilkan varietas-varietas sawi yang unggul yang lebih bernilai ekonomis dan kompetitif. Keragaman varietas yang terus berkembang sejalan dengan sistim perkembangbiakan tanaman. Namun informasi tentang genetik sawi masih sangat kurang. Oleh karena itu pada praktikum kali ini mencoba untuk mengisolasi DNA tanaman sawi hijau. Isolasi DNA sawi hijau ini dilakukan dengan mengambil potongan daun muda kemudian daun tersebut diekstraksi hingga didapatkan DNA murni dari tanaman sawi hijau tersebut. Praktikum ini dilakukan dengan tujuan agar praktikan mampu melakukan isolasi DNA dari tanaman Sawi Hijau (Brassica rapa). II. Materi Alat yang digunakan dalam praktikum isolasi DNA tanaman adalah alat tulis, mikropipet, sentrifuga, vortex, waterbath, inkubator, yellow tips, blue tips, freezer,tip steril, tabung mikro 1,5 steril, gunting, timbangan analitik dan kamera. Bahan yang digunakan adalah daun sawi hijau (Brassica sp.). yang masih muda 0,3 g, 500 µl buffer ekstraksi (25 mm EDTA, 250 mm NaCl, SDS 0,5%, 200 mm Tris-HCl ph 7,5), kloroform dan isoamil alkohol (24:1) sebanyak 1x volum sampel, isopropanol sebanyak 1x volume sampel, dan 100 µl buffer TE. III. Metode Cara kerja untuk isolasi DNA tanaman yaitu pertama dengan menimbang daun sawi hijau yang masih segar sebanyak 0,3 gram, tanpa pertulangan daun dan batangnya. Kemudian dimasukan kedalam tabung mikro steril. Setelah itu lunakan daun selama 10 menit pada suhu ruang, gunakan tip steril untuk menumbuk daun, tanpa penambahan buffer dan tambahkan 500 μl bufer ekstraksi (200 mm Tris-HCl (ph 7.5), 250 mm NaCl, 25 mm EDTA, 0.5% SDS) ke dalam tabung. Kemudian kocok selama 5 detik kemudian Inkubasi tabung dalam waterbath pada suhu 60 0 C selama 30 menit dengan tamabahan kloroform:isoamilalkohol (24:1)sebanyak 1x volume sampel lalu kocok kemudian sentrifuga pada x g selama 5 menit dan di ambil supernatan, kemudian pindahkan ke tabung mikro yang baru, lalu tambahkan isopropanol sebanyak 1x volume sampel, Kocok kemudian inkubasi pada suhu C selama 15 menit. Sentrifugasi pada x g selama 5 menit, setelah itu supernatan, kemudian ditambahkan 100 μl bufer TE dan simpan pada suhu C. IV. Hasil dan Pembahasan Hasil yang didapatkan dari praktikum isolasi DNA tanaman sawi hijau(brassica sp.) dapat dilihat pada tabel berikut ini :

23 No Gambar Keterangan 1 Daun hasil penumbukan dan ditambahkan buffer ekstraksi dan divortex a. Daun + buffer ekstraksi 2 Terbentuk 2 fase setelah penambahan kloroform dan isoamil alkohol (24:1) 1x volum sampel dan disentrifugasi. a. Fase aqueous (supernatan yang mengandung DNA) a. Fase organik (debris dan protein yang terdenaturasi) 3 Supernatan yang telah dipindahkan ke tabung mikro baru a. supernatant

24 Supernatan yang telah ditambahkan isopropanol dingin 1 x volum sampel a. Terlihat benangbenang tipis DNA Pelet yang telah ditambahkan dengan 100 μlbuffer TE a. buffer TE b. Pelet (mengandung DNA) Berdasarkan hasil praktikum isolasi DNA tanaman Sawi hijau (Brassica sp.), langkah pertama yang dilakukan adalah penghancuran membran dan dinding sel pada daun muda yang digunakan. Isolasi DNA tanaman ini digunakan daun yang masih muda hal ini dikarenakan dipucuk daun dapat menekan senyawa polifenol dan polisakarida sehingga dapat memperbesar kemungkinan keberhasilan untuk melakukan isolasi DNA yang kita inginkan. Hal ini diperkuat dengan pernyataan Zubaidah (2004), pada bagian tanaman banyak memiliki senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA, senyawa polifenol dan polisakarida juga dapat mempengaruhi enzim-enzim seperti polimerase, ligase, endonuklease restriksi, atau enzim yang mengakibatkan DNA tidak digunakan dalam praktikum Biologi Molekuler. Penghancuran bertujuan untuk merusak jaringan yang ada pada sel sehingga mempermudah bahan-bahan kimia lain yang akan digunakan untuk masuk ke dalam organel-organel sel, dalam hal untuk mengambil DNA. DNA yang diisolasi dari tanaman seringkali terkontaminasi oleh polisakarida dan metabolit sekunder seperti tanin, pigmen, alkaloid dan flavonoid. Sedangkan DNA dari hewan lebih banyak mengandung protein. Salah satu kesulitan isolasi DNA dari tanaman tinggi adalah proses destruksi dinding sel untuk melepaskan isi sel. Hal ini disebabkan karena tanaman memiliki dinding sel yang kuat dan seringkali pada beberapa jenis tanaman, kontaminasi

25 tersebut sulit dipisahkan dari ekstrak asam nukleat. Pembukaan sel untuk mengeluarkan asam nukleatnya pada praktikum ini dengan cara mekanik yaitu digerus dengan tip steril pada tabung mikro atau dapat juga menggunakan bahan kimia yaitu nitrogen cair untuk mendegradasi dan melarutkan komponen dinding sel. Pada saat proses destruksi jaringan tanaman dapat menyebabkan degradasi pada DNA dengan adanya aktivitas enzim endonuklease, karena itu digunakan buffer ekstraksi yang mengandung senyawa 200 mm Tris-HCl (ph 7.5), 250 mm NaCl, 25 mm EDTA, dan 0,5 % SDS. DNA akan terpisah menjadi suatu larutan dan dapat dimurnikan (dipurifikasi) melalui dua cara yang umum dilakukan yaitu sentrifugasi dan ekstraksi kimia. Sampel disentrifugasi dengan kecepatan yang tinggi sehingga komponen yang berukuran lebih besar atau lebih berat akan mengendap membentuk sedimen pada bagian bawah tabung. SDS berfungsi untuk melisis dinding sel tumbuhan yang terdapat dalam larutan sampel. Ini disebabkan karena sifat dari SDS sama dengan sifat dinding sel yang hidrofobik, sehingga terjadi ikatan diantara keduanya dan menyebabkan dinding sel rusak. Setelah ditunggu beberapa menit, sampel selanjutnya diinkubasi. Muladno (2002), buffer lysis ini mengandung EDTA yang berfungsi merusak dinding sel secara kimiawi dengan cara mengikat ion magnesium berfungsi mempertahankan integritas sel maupun aktifitas enzim nuclease yang merusak asam nukleat. Kotoran (debris) yang dihasilkan dari aktivitas lysis ini dibersihkan dengan cara sentrifugasi agar kotoran mengumpul didasar tabung mikro. Untuk membersihkan protein dan polisakarida dari larutan digunakan kloroform sedangkan kondisi yang lebih ekstrem, dapat digunakan proteinase.dna yang telah diekstraksi dari dalam sel selanjutnya perlu dipisahkan dari kontaminan komponen penyusun sel lainnya seperti polisakarida dan protein agar DNA yang didapatkan memiliki kemurnian yang tinggi. Tahap selanjutnya yaitu sampel yang telah vortex selama 5 detik dankemudian diinkubasikan isolasi pada suhu 60 C selama 30 menit, hal ini bertujuan agar enzim bekerja secara optimal setelah ditambahkan buffer ekstraksi. Kemudian dilakukan ditambahkan kloroform dan isoamil alkohol (24:1) 1x volum sampel dan disentrifugasi untuk mendapatkan supernatan. Terbentuk 2 fase setelah penambahan CIA dan disentrifugasi yaitu fase cair ( supernatan ) dan fase organik. Hal tersebut sesuai dengan pernyataan Pharmawati, (2009) menyebutkan bahwa setelah sentrifugasi akan terbentuk 2 fase yang terpisah yakni fase organik pada lapisan bawah dan fase aquoeus (air) pada lapisan atas sedangkan DNA dan RNA akan berada pada fase aquoeus setelah sentrifugasi sedangkan protein yang terdenaturasi akan berada pada interfase dan lipid akan berada pada fase organik.

26 Asam nukleat adalah molekul hidrofilik dan bersifat larut dalam air. Disamping itu, protein juga mengandung residu hidrofobik yang mengakibatkan protein larut dalam pelarut organik. Berdasarkan sifat ini, terdapat beberapa metode deproteinisasi berdasarkan pemilihan pelarut organik. Biasanya pelarut organik yang digunakan adalah fenol atau kloroform yang mengandung 4% isoamil alkohol. Penggunaan kloroform isoamil alkohol (CIA) berdasarkan perbedaan sifat pelarut organik. Kloroform tidak dapat bercampur dengan air dan kemampuannya untuk mendeproteinisasi berdasarkan kemampuan rantai polipeptida yang terdenaturasi untuk masuk atau termobilisasi ke dalam fase antara kloroform air. Konsentrasi protein yang tinggi pada fase antara tersebut dapat menyebabkan protein mengalami presipitasi. Sedangkan lipid dan senyawa organik lain akan terpisah pada lapisan kloroform (Doyle, 1990). Proses deproteinisasi yang efektif bergantung pada besarnya fase antara kloroform-air. Proses ini dapat dilakukan dengan membentuk emulsi dari air dan kloroform. Hal ini hanya dapat dilakukan dengan penggojogan atau sentrifugasi yang kuat karena kloroform tidak dapat bercampur dengan air. Isoamil alkohol berfungsi sebagai emulsifier dapat ditambahkan ke kloroform untuk membantu pembentukan emulsi dan meningkatkan luas permukaan kloroform-air yang mana protein akan mengalami presipitasi. Penggunaan kloroform isoamil alkohol ini memungkinkan untuk didapatkan DNA yang sangat murni, namun dengan ukuran yang terbatas ( bp). DNA kemudian diikat dari fase aquoeus dengan presipitasi isopropanol (Muladno, 2002). Setelah proses ekstraksi, DNA yang didapat dapat dipekatkan melalui presipitasi. Pada umumnya digunakan isopropanol dingin untuk mengendapkan, melekatkan dan memisahkan DNA dari larutan. Pada saat penambahan isopropanol dingin terlihat benang-benang tipis DNA tanaman berwarna putih yang melayang di larutan tersebut. Kedua senyawa tersebut akan mempresipitasi DNA pada fase aquoeus sehingga DNA menggumpal membentuk struktur fiber dan terbentuk pellet setelah dilakukan sentrifugasi. Menurut Heldt (2005) bahwa presipitasi berfungsi untuk menghilangkan residuresidu kloroform yang berasal dari tahapan ekstraksi. Menurut Yuwono, (2008) prinsip-prinsip presipitasi antara lain pertama, menurunkan kelarutan asam nukleat dalam air. Hal ini dikarenakan molekul air yang polar mengelilingi molekul DNA di larutan aquoeus. Muatan dipole positif dari air berinteraksi dengan muatan negatif pada gugus fosfodiester DNA. Interaksi ini meningkatkan kelarutan DNA dalam air. Isopropanol dapat bercampur dengan air, namun kurang polar dibandingkan air. Molekul isopropanol tidak dapat berinteraksi dengan gugus polar dari asam nukleat sehingga isopropanol adalah pelarut yang lemah bagi asam nukleat; kedua,

27 penambahan isopropanol akan menghilangkan molekul air dalam larutan DNA sehingga DNA akan terpresipitasi; ketiga, penggunaan isopropanol dingin akan menurunkan aktivitas molekul air sehingga memudahkan presipitasi DNA. Pada tahapan presipitasi ini, DNA yang terpresipitasi akan terpisah dari residu-residu RNA dan protein yang masih tersisa. Residu tersebut juga mengalami koagulasinamun tidak membentuk struktur fiber dan berada dalam bentuk presipitat granular.pada saat etanol atau isopropanol dibuang dan pellet dikeringanginkan dalam tabung, maka pellet yang tersisa dalam tabung adalah DNA pekat. Proses presipitasi kembali dengan isopropanol sebelum pellet dikeringanginkan dapat meningkatkan derajat kemurnian DNA yang diisolasi (Farrel, 2004). Tahap selanjutnya yaitu tabung dikocok dan diinkubasi pada suhu C selama 15 menit. Hal ini dilakukan untuk optimalisasi kerja isopropanol. Kemudian disentrifugasi dengan kecepatan rpm x g selama 15 menit. Proses sentrifugasi ulangan dilakukan untuk mendapatkan pellet DNA. Tahap selanjutnya yaitu tabung di sentrifugasi kembali pada kecepatan rpm selama 15 menit. Hasil yang didapat yaitu berupa supernatan yang bening dan pelet (endapan DNA murni) yang berwarna putih terdapat pada dasar tabung. Kemudian supernatan tersebut dibuang karena DNA berada pada bagian natan. Menurut Donata (2007) DNA murni yang dihasilkan adalah DNA yang terbebas dari campuran material dan komponen intraceluler yang mengandung larutan kompleks berupa RNA, protein, lemak dan karbohidrat. Setelah ituditambahkan 100 μl buffer TE ke dalam tabung yang berisi pelet dan kemudian disimpan di dalam freezer dengan suhu sekitar -20ºC. Ardiana, (2009) menyatakan bahwa buffer TE dan penyimpanan suhu pada -20ºC bertujuan agar sampel DNA yang telah diekstraksi dapat disimpan hingga waktu berminggu-minggu. Pharmawati, (2009) juga menjelaskan bahwa pelarutan kembali dengan buffer TE juga dapat memisahkan antara RNA yang mempunyai berat molekul lebih rendah dibandingkan DNA sehingga DNA yang didapatkan tidak terkontaminasi oleh RNA dan DNA sangat stabil ketika disimpan dalam keadaan terpresipitasi pada suhu -20ºC. V. Kesimpulan Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan dapat diambil kesimpulan bahwa, praktikan mampu melakukan isolasi DNA tanaman Sawi hijau (Brassica sp.)dengan cara penghancuran (lisis), ektraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti dinding sel, membran sel dan protein, serta dapat melakukan pemurnian DNA. Pada isolasi DNA ini digunakan daun muda atau pucuk, hal ini dikarenakan dipucuk daun dapat menekan senyawa polifenol dan polisakarida sehingga dapat memperbesar kemungkinan keberhasilan untuk melakukan isolasi DNA yang kita inginkan.

28 DAFTAR PUSTAKA Ardiana, D.W Teknik isolasi DNA genom tanaman papaya dan jeruk dengan menggunakan modifikasi buffer CTAB. Buletin Teknik Pertanian 14(1): Donata Komunikasi pribadi. Ciri-ciri DNA murni dan penyebab keberhasilan serta kegagalan dalam PCR dan elektroforesis.erlangga. Jakarta. Doyle J.J and Doyle J.L Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus. Moscow. 12(1): Farrel, R.E RNA Methodologies: A Laboratory Guide for Isolation and Characterization. Third Edition. Elsevier Academis Press. London. Hal Heldt, H. W Plant Biochemistry. Third Edition. Elsevier Academic Press. California. Hal. 491Doyle JJ, Doyle JL Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus. 12: Muladno. (2002). Seputar Teknologi Rekayasa Genetika. Pusataka Wirausaha Muda. Bogor Pharmawati, M Optimalisasi ekstraksi DNA dan PCR-RAPD pada grevillea spp. (Proteaceae). Jurnal Biologi 13(1): Ribeiro RA, Lovato MB Comparative analysis of different DNA extraction protocols in fresh and herbarium specimens of the genus Dalbergia.Genet. Mol. Res. 6: Yuwono, Triwibowo Biologi Molekuler. Jakarta : Penerbit Erlangga

29 Lukisan Karya Kamis, 20 Maret 2014 Laporan Genetika Isolasi DNA LAPORAN PRAKTIKUM GENETIKA PERCOBAAN II ISOLASI DNA NAMA NIM KELOMPOK : NUR AFIYAH SULAIMAN : H : V (LIMA) B HARI/TGL. PERCOBAAN : KAMIS/ 13 MARET 2014 ASISTEN : RISKY NURHIKMAYANI

30 LABORATORIUM GENETIKA JURUSAN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS HASANUDDIN MAKASSAR 2014 BAB I PENDAHULUAN I.1 Latar Belakang DNA (Deoxyribose Nucleic Acid) adalah molekul utama yang mengode semua informasi yang dibutuhkan untuk proses metabolisme dalam setiap organisme. DNA tersusun atas 3 komponen utama yaitu gula deoksiribusa, basa nitrogen dan fosfat yang tergabung membentuk nukleotida. Molekul DNA ini terikat membentuk kromosom, dan ditemukan di nukleus, mitokondria dan kloroplas (Agus dan Sjafaraenan, 2014). DNA yang menyusun kromosom ini merupakan nukleotida rangkap yang terususn helix Ganda (double helix), yang basa nitrogen dan kedua benang polinukleotida saling berpasangan dalam pasangan yang tetap melali ikatan hidrogen dan antara nukleotida yang satu dengan yang lain dihubungkan dengan ikatan fosfat. DNA terdapat di dalam setiap sek makhluk hidup dan disebut sebagai cetak biru kehidupan karena molekul ini berperan penting sebagai pembawa informasi hereditas yang menentukan struktur protein dan proses metabolisme lain (Agus dan Sjafaraenan, 2014). DNA dapat mengalami denaturasi dan renaturasi. Selain itu, DNA juga bisa diisolasi. Isolasi DNA adalah suatu teknik dimana hasil akhirnya strand-strand DNA

31 dapat terpisah dalam bentuk kumpulan strand berwujud benang-benang putih. Tujuan isolasi DNA adalah mendapatkan ekstrak DNA pada jaringan atau sel yang diinginkan (Agus dan Sjafaraenan, 2014). Isolasi DNA ini sangat penting dalam bidang bioteknologi maupun bidang biologi molekuler. Pengenalan isolasi DNA sangat penting mengingat bioteknologi pada akhir-akhir ini sangat maju. Terlebih untuk bidang biologi molekuler. Beberapa bakteri telah berhasil diintroduksi ke dalam tanaman seperti padi kapas dan kedelai. Pentingnya bioteknologi untuk perkembangan keanekaragaman hayati di masa mendatang memerlukan keterampilan dan pemikiran. Salah satunya adalah dengan mengetahui cara pengumpulan DNA dan prinsip dasarnya sebagai pijakan untuk mempelajari biologi molekuler pada khususnya (Agus, dan Sjafaraenan, 2014). 1.2 Tujuan Percobaan Adapun tujuan dari praktikum ini adalah: 1. Untuk mengetahui cara atau metode yang benar untuk memisahkan (mengisolasi) DNA dari buah-buahan. 2. Mengetahui keefektifan detergen dan buah yang dipakai untuk melakukan percobaan isolasi. I.3 Waktu dan Tempat Percobaan Isolasi DNA ini dilaksanakan pada hari Kamis, 13 Maret 2014 pukul WITA bertempat di Laboratorium Biologi Dasar, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Hasanuddin, Makassar..

32 BAB II TINJAUAN PUSTAKA Studi mengenai eksistensi asam nukleat pertama kali dilakukan oleh Friedrich Miescher dari Jerman yang mengisolasi inti dari sel darah putih pada tahun Miescher menemukan bahwa di dalam inti sel tersebut terdapat senyawa yang mengandung fosfat yang kemudian dinamakan nuklein. Selanjutnya pada akhir abad ke-19 telah berhasil dilakukan pemisahan antara DNA (deoxyribonucleic acid) dan RNA (ribonucleic acid) dari protein-protein yang melekatkan molekul asam nukleat tersebut pada sel. Pada awal tahun 1930-an, P. Levene, W. Jacobs, dan kawan-kawan menunjukkan bahwa RNA tersusun atas satu gugus gula ribosa dan empat basa yang mengandung nitrogen, sementara DNA tersusun atas gula yang berbeda yaitu deoksiribosa (Yuwono, 2005). Struktur molekul DNA pertama kali diungkapkan oleh James Watson dan Francis Crick pada tahun 1953 berdasarkan atas foto difraksi sinar X yang dibuat oleh Rosalind Franklin dan Maurice Wilkins. Berdasarkan atas data kimia dan fisik, Watson dan Crick membuat model struktur DNA yang disebut untai ganda (double helix) (Yuwono, 2005). Untai ganda DNA tersusun oleh dua rantai polinukleotida yang berpilin. Kedua rantai mempunyai orientasi yang berlawanan (antiparalel): rantai yang satu mempunyai orientasi 5 3, sedangkan rantai yang lain berorientasi 3 5. Kedua rantai tersebut berikatan dengan adanya ikatan hidrogen antara basa adenin (A) dengan thymine (T) dan antara guanine (G) dengan cytosine (C). Ikatan antara A T berupa dua ikatan hidrogen, sedangkan antara G C berupa tiga ikatan hidrogen sehingga ikatan G C lebih kuat. Spesfikasi pasangan basa seperti ini disebut dengan komplementaritas (complementarity) (Yuwono, 2005). Kerangka gula deoksiribosa dan fosfat yang menyusun DNA terletak di bagian luar molekul, sedangkan basa purin dan pirimidin terletak di sebelah dalam untaian (helix). Basa-basa purin dan pirimidin yang berpasangan terletak pada bidang datar

33 yang sama dan tegak lurus terhadap aksis untaian DNA. Untaian DNA mempunyai dua lekukan (groove) eksternal yaitu lekukan besar (major groove) dan lekukan kecil (minor groove). Kedua lekukan tersebut mempunyai peranan sebagai tempat melekatnya molekul protein tertentu (Yuwono, 2005). Ukuran molekul DNA bervariasi antara jasad yang satu dengan lainnya. Pada jasad prokariot variasinya tidak sebesar pada virus dan bakteriofag. Bahan genetik pada prokariot dan virus pada umumnya berupa satu molekul tunggal DNA (kecuali virus tertentu yang bahan genetiknya RNA). Sebaliknya, bahan genetik pada eukariot berupa beberapa molekul kromosom yang masing-masing berupa molekul DNA berukuran besar. Ukuran DNA pada eukariot, terutama eukariot tingkat tinggi belum diketahui secara pasti karena kompleksitasnya (Yuwono, 2005). Struktur DNA prokariot berbeda dengan struktur DNA eukariot. DNA prokariot tidak memiliki protein histon dan berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk linear dan memiliki protein. Prinsip-prinsip dalam melakukan isolasi DNA ada 2, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akanberada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas. Teknik sentrifugasi tersebut dilakukan di dalam sebuah mesin yang bernama mesin sentrifugasi dengan kecepatan yang bervariasi (Kimball, 1992). Isolasi DNA dapat dilakukan melalui tahapan-tahapan antara lain: preparasi sektrak sel, pemurnian DNA dari ektrak sel dan presipitasi DNA. Meskipun isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis atau bagian tanaman dapat memberikan hasil yang berbeda, hal ini karena adanya senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi yang dapat menghambat pemurnian DNA (Agus dan Sjafaraenan, 2014). Jika isolasi DNA dilakukan dengan sampel buah, maka kadar air yang pada masing-masing buah berbeda, dapat memberi hasil yang berbeda pula. Buah dengan kadar air tinggi akan menghasilkan isolat yang berbeda jika dibandingkan

34 dengan buah berkadar air renda. Semakin tinggi kadar air maka sel yang terlarut di dalam ekstrak akan semakin sedikit, sehingga DNA yang terpresipitasi juga akan sedikit (Agus dan Sjafaraenan, 2014). Proses isolasi DNA diawali dengan proses ekstraksi DNA. Hal ini bertujuan untuk memisahkan DNA dengan partikel lain yang tidak diinginkan. Proses ini harus dilakukan dengan hati-hati, sehingga tidak menyebabkan kerusakan pada dinding sel, membran sel membran plasma dan membran inti baik dengan cara mekanik maupun secara kimiawi. Cara mekanik bisa dilakukan dengan pemblenderan atau penggerus menggunakan mortar dan pistil. Sedangkan secara kimiawi dapat dengan pemberian yang dapat merusak membran sel dan membran inti, salah satunya adalah detergen (Agus dan Sjafaraenan, 2014). Selain itu, secara kimia lisis dinding sel dapat dilakukan dengan menambahkan senyawa kimia seperti lisozim, EDTA (ethilendiamin tetraasetat), dan SDS (sodium dodesil sulfat). Dalam hal ini fungsi EDTA adalah sebagai perusak sel dengan caramengikat magnesium. Ion ini berfungsi untuk mempertahankan integrit as sel maupunmempertahankan aktivitas enzim nuklease yang merusak asam nukleat. Ad apun SDSyang merupakan sejenis deterjen dapat digunakan untuk merusak membran sel. Ini semua menyebabkan sel menjadi lisis. Kotoran sel yang ditimbulkan akibatperus akan oleh EDTA dan SDS dibersihkan dengan cara sentrifugasi, sehinggayang tertinggal hanya molekul nukleotida (DNA dan RNA). Untuk menghilangkan protein dari larutan, digunakan phenol (mengikat protein dan sebagian kecil RNA) danchloroform (membersihkan protein dan polisakarida dari larutan). Etanol berfungsi untuk memekatkan, memisahkan DNA dari larutan dan mengendapkan DNA(Muladno, 200 2). Penambahan detergen dalam isolasi DNA dapat dilakukan karena detergen dapat menyebabkan ruaknya membran sel, melalui ikatan yang dibentuk melalui

35 sisi hidrofobik detergen dengan protein dan lemak pada membran membentuk senyawa lipid protein-detergen kompleks. Senyawa tersebut dapat terbentuk karena protein dan lipid memiliki ujung hidrofilik dan hidrofobik, demikian juga dengan detergen sehingga dapat membentuk suatu ikatan kimia. Kemudian penambahan garam (NaCl) berfungsi untuk melarutkan DNA dan setelah itu diberikan ethanol dingin 96% untuk mengumpulkan/menggumpalkan DNA (Agus dan Sjafaraenan, 2014). Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Gel yang biasa digunakan antara lain agarosa. Elektroforesis gel agarosa dapat dilakukan untuk memisahkan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga pasang basa (bp) (Dwidjoseputro, 1998). Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif (anode). Makin besar ukuran molekulnya, makin rendah laju migrasinya. Berat molekul suatu fragmen DNA dapat diperkirakan dengan membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi fragmenfragmen molekul DNA standar (DNA marker) yang telah diketahui ukurannya. Visulisasi DNA selanjutnya dilakukan di bawah paparan sinar ultraviolet setelah terlebih dahulu gel dalam pembuatannya ditambahkan larutan etidium bromid. Cara lain untuk melihat visualisasi DNA adalah gel direndam di dalam larutan etidium bromid sebelum dipaparkan di atas sinar ultraviolet (Dwidjoseputro, 1998). Jumlah DNA dicerminkan berat molekul bukan oleh volume. Untuk mengetahui jumlah DNA, maka DNA hasil isolasi harus dianalisis dengan spektrofotometer UVde ngan panjang gelombang 256 nm (260 nm). Kualitas DNA yang berhubungan dengan kemurnian terhadap kontaminan protein dapat dilihat dari perbandingan absorbansi suspensi DNA pada panjang gelombang 260 nm terhadap 280 nm (Suharsono dan Widyastuti, 2006). BAB III

36 METODE PERCOBAAN III.1 Alat Alat yang digunakan dalam percobaan ini adalah pisau, mesin blender, timbangan, gelas aqua, pengaduk, penyaring (tissu / kapas / kertas saring), spatula, tabung reaksi, pipet tetes, dan mesin vortex. III.2 Bahan Bahan yang digunakan adalah buah tomat Solanum lypersium, buah pepayacarica papaya, detergen Surf bubuk, detergen Rinso cair, sabun Bucream, aquades, garam dapur, dan etanol 96% dingin. III.3 Prosedur Kerja Adapun langkah-langkah kerja yang dilakukan dalam percobaan ini sebagai berikut: 1. Melarutkan detergen (Surf, Rinso dan Bucream) ke dalam 60 ml aquades diaduk pelan selama 15 menit. 2. Mengambil 100 grm daging buah ditambah 100 ml aquades dimasukkan ke dalam mesin blender, kemudian diblender selama 40 detik. 3. Mencampurkan 4 ml masing-masing larutan sabun dengan masing-masing 4 ml jus buah. 4. Menambahkan 1 spatula garam dapur kemudian diaduk selama 10 menit sampai diperoleh campuran yang homogen serta divortex. 5. Menyaring campuran yang dihasilkan sebelumnya sebanyak dua kali penyaringan ml hasil penyaringan tersebut kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan menambahkan 5 ml etanol 96 % dingin.

37 7. Mengamati proses timbulnya DNA, meliputi waktu yang diperlukan, warna, serta banyak sedikitnya DNA yang terbentuk. BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

38 IV.1 Hasil Percobaan IV.1.1 Gambar hasil Percobaan Jenis buah Sebelum Sesudah Tomat Detergen Bubuk Detergen cair Detergen krim Pepaya Detergen Bubuk Detergen cair

39 Detergen krim IV.1.2 Tabel Pengamatan No. Jenis Buah Perlakuan Hasil Pengamatan Jumlah Warna Waktu 1 Tomat Solanumlycopersiu m Detergen Bubuk Detergen Cair Bening, ada Lambat ++ endapan Bening Sedang + Detergen Putih Bening Lebih +++ Krim Cepat 2 Pepaya Detergen Putih Lebih ++++ Carica papaya Bubuk Kekuningkuningan Cepat Detergen Cair Detergen Krim Putih keruh Lambat +++ Putih susu Sedang ++ IV.2 Pembahasan Praktikum isolasi DNA ini dilakukan bertujuan untuk mengetahui pengaruh macam buah dan jenis deterjen terhadap kualitas DNA yang dihasilkan dalam proses isolasi. Sehingga dalam praktikum ini dibuat variabel kontrol pada jenis

40 detergen dan jenis buah agar dapat mengetahui buah dan jenis detergen mana yang menghasilkan DNA paling bagus dan baik. Jenis buah yang digunakan adalah tomat Solanum lycopersicum sebagai contoh buah yang mengandung banyak air dan pepaya Carica papaya sebagai buah yang memiliki kandungan air tidak terlalu banyak. Sedangkan untuk detergen yang dipakai adalah detergen bubuk merk Surf, detergen cair merk Rinso, dan detergen krim merk BuCream. Pada dasarnya prinsip isolasi DNA ada tiga yaitu pelisisan sel, ekstraksi dan pemurnian. Pada praktikum kali ini yang pertama-tama dilakukan ialah menghancurkan sampel buah dengan cara mekanik atau pemblenderan buah untuk melisis/ merusak dinding sel. Sementara itu dibuat pula larutan detergen dengan cara mencampurkan ketiga jenis detergen (Surf, Rinso dan Bucream) ke dalam aquades. Pengadukan dilakukan dengan hati-hati agar tidak terjadi banyak busa yang dapat menghalangi pengamatan. Kemudian jus buah ditambahkan dengan larutan detergen. Penambahan larutan detergen berfungsi untuk melisis dinding sel tumbuhan yang terdapat dalam larutan sampel. Ini disebabkan karena sifat dari detergen sama dengan sifat dinding sel yang hidrofobik, sehingga terjadi ikatan diantara keduanya dan menyebabkan dinding sel rusak. Lalu ditambahkan garam dapur dan diaduk. Pengisolasian DNA menggunakan garam dapur dengan tujuan untuk memekatkan DNA. Hal ini dapat terjadi karena ion Na + yang dikandung oleh garam mampu membentuk ikatan dengan kutub negative pada ikatan fosfat DNA. Saat ion Na + garam berikatan dengan fosfat, pada saat itulah DNA akan berkumpul. Selanjutnya larutan disaring dengan kertas saring sebanyak dua kali penyaringanuntuk memisahkan serat-serat yang kasar dengan yang halus, sehingga didapatkan sampel berupa cairan yang tidak terlalu kental. Hasil penyaringan tersebut dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambah etanol 96 % dingin yang berfungsi membantu proses pengendapan terhadap organel-organel yang sudah keluar dari sel atau memisahkan bagian-bagian yang