ISOLASI DNA PLASMID. Disusun dalam rangaka memenuhi tugas terstruktur dalam mata kuliah Bioteknologi. Oleh : Amrullah M, S.

Transkripsi

1 ISOLASI DNA PLASMID Disusun dalam rangaka memenuhi tugas terstruktur dalam mata kuliah Bioteknologi Dosen Pengampu : Dr. FAUZIYAH HARAHAP, M.Si Oleh : Amrullah M, S.Pd Kelas A Semester II TA. 2014

2 Isolasi DNA Plasmid Pada dasarnya plasmid merupakan identitas genetik yang ditemukan secara alami di dalam sel beberapa kelompok prokariot dan eukariot. Dengan teknik rekayasa genetik, sekarang telah dikembangkan plasmid artifisial dengan cara menggabungkan gen-gen dari plasmid alami maupun genom tertentu (Yuwono, 2009).

3 Plasmid merupakan DNA ekstrakromosom yang dikenal pada bakteri, berutas ganda, dan berbentuk sirkuler (Jusuf, 2001). Plasmid merupakan salah satu vektor pembawa molekul DNA di dalam proses rekayasa DNA melalui teknologi DNA rekombinan. Plasmid banyak sekali digunakan dalam pengklonan DNA, karena relatif mudah dalam penanganannya.

4 Ada berbagai macam kegunaan dari plasmid, dalam rekayasa genetika, plasmid digunakan sebagai vektor untuk kloning DNA. Selain itu plasmid juga banyak digunakan untuk perbanyakan jumlah DNA tertentu sehingga bisa mengekspresikan gen tertentu. Alasan utama pengunaan plasmid ini adalah karena plasmid memiliki peta restriksi, adanya marker sehingga dapat diketahui apakah gen insert masuk atau tidak, memiliki copy number yang besar, dan mudah dimodifikasi sesuai dengan tujuan tertentu.

5 Plasmid memiliki fungsi yang bisa dimanfaatkan keuntungannya, maka ada banyak cara yang digunakan untuk mengisolasi plasmid tersebut. Plasmid yang diisolasi berasal dari bakteri. Proses ini dikenal sebagai proses mini preparation karena jumlahnya hanya sekitar 1-20µg. Sedangkan untuk jumlah yang lebih besar ( µg) digunakan midi preparation dan maxi preparation untuk jumlah yang lebih besar dari 200 µg.

6 Inti dari isolasi plasmid bakteri adalah menghancurkan membran sel sehingga semua organel sel dapat keluar. Sehingga didapatkan DNA kromosomal serta DNA ekstra kromosmal (plasmid). Untuk memperoleh plasmid saja harus dilakukan pemurnian dari debris membran sel, organel sel, dan pengotor lainnya. Metode yang dapat digunakan untuk isolasi plasmid antara lain yaitu boiling lysis, lysis withdetergent, mechanical lysis, alkaline lysis, dan enzimatic digestion.

7 Beberapa hal penting yang dapat menyebabkan plasmid dapat digunakan sebagai wahana (vektor) kloning, antara lain adalah : a. Plasmid mempunyai ukuran molekul yang kecil sehingga DNA nya lebih mudah diisolasi dan dimanipulasi; b. DNA-nya berbentuk sirkuler sehingga DNA akan lebih stabil selama diisolasi secara kimia; c. Mempunyai titik ori (origin of replication) sehingga dapat memperbanyak diri (bereplikasi) di dalam sel inang secara otonomi; d. Mempunyai jumlah kopi yang banyak (multiple copy) sehingga terdapat di dalam sel dalam jumlah banyak dan membuat DNA lebih mudah diamplifikasi; e. Mempunyai penanda seleksi, yakni gen ketahanan terhadap antibiotik tertentu sehingga lebih memudahkan dalam mendeteksi plasmid yang membawa gen tertentu.

8 Tahapan Isolasi DNA Plasmid (Brock, et al., 1994). Secara garis besar isolasi plasmid terdiri dari tiga tahapan kegiatan, yaitu : 1. tahap kultivasi dan harvesting, 2. tahap lisis dan 3. tahap pemurnian DNA plasmid. Kultivasi yaitu memberikan kesempatan bagi bakteri untuk memperbanyak diri sehingga pada saat pemanenan didapatkan plasmid dalam jumlah yang banyak. Lisis (pemecahan dinding sel), membran sel bakteri tersusun atas membran luar dan membran dalam, membran luar terdiri atas lipopolisakarida, protein, fosfolipid, lipoprotein, dan peptidoglikan sedangkan membran dalam tersusun atas membran fosfolipid bilayer yang juga terintegrasi protein di dalamnya. Tahap pemurnian DNA plasmid meliputi proses neutralizer, presipitasi, dan pembilasan DNA plasmid.

9 1. Kultivasi DNA Plasmid dimulai dengan tahapan sebagai berikut: Bakteri ditumbuhkan pada medium LB, digojog pada suhu 370C,selama 1 malam. 15 ml kultur disentrifugasi 3000 rpm,15 menit, pada suhu 40C. Supernatan dibuang, pada pellet ditambahkan 750 μl buffer lisis (100mM Tris HCl ph 8,100mM NaCl,50 mm EDTA,2% SDS ), lalu divortek. 10 μl ( 10 mg/ml) Proteinase-K ditambahkan. Diinkubasi pada suhu 550C selama 30 menit. Disentrifugasi dengan kecepatan rpm, selama 15 menit, pada suhu 40C. Dipindahkan supernatannya pada tabung eppendorf 1,5 ml. Kemudian ditambahkan 700 μl phenol, digojog pelan. Disentrifugasi rpm selama 10 menit, lapisan atas dipindahkan dalam tabung eppendorf 1,5 ml. Ditambahkan etanol dingin, perbandingan 1:1 (v/v), dicampur pelanpelansehingga timbul benang-benang halus DNA. Benang-benang halus DNA diambil dan dicuci dengan etanol 70%. Disentrifugasi rpm, 10 menit, supernatan dibuang, pelet dikeringkan. Ditambahkan TE, hingga volume 200 ml. Kemudian dilanjutkan dengan harvesting (pemanenan plasmid) sebanyak yang diperlukan.

10 2. Tahap resuspensi dan lisis DNA plasmid Berikut ini adalah prosedur resuspensi dan lisis DNA plasmid: Diambil sebanyak 1-2 koloni bakteri dari lempeng agar, dipindahkan ke dalam tabung yang telah berisi 5 ml LB-medium dan antibiotik. Digojok kuat-kuat dalam shaker incubator 37oC, semalam. Disentrifugasi rpm selama 10 menit. Supernatan dibuang, pelet diresuspensi dengan 100 ml Lysing solution 1, didiamkan dalam es selama 5 menit. Ditambahkan 200 ml Lysing solution 2, diinkubasi pada es selama 5 menit. Ditambahkan 150 ml Lysing solution 3, dicampur dengan cara membolakbalikkan, diinkubasi dalam es selama 5 menit. Disentrifus dengan kecepatan rpm selama 10 menit. Supernatan diambil dalam filter, pellet dibuang. Ditambah phenol CIAA sebanyak volume supernatan, dicampur dengan Vortek. Disentrifugasi dengan kecepatan rpm selama 5 menit.

11 Senyawa-senyawa kimia Secara kimia lisis dinding sel dapat dilakukan dengan menambahkan senyawa kimia seperti lisozim, EDTA (ethilendiamin tetraasetat), dan SDS (sodium dodesil sulfat). Dalam hal ini fungsi EDTA adalah sebagai perusak sel dengan cara mengikat magnesium. Ion ini berfungsi untuk mempertahankan integritas sel maupun mempertahankan aktivitas enzim nuklease yang merusak asam nukleat. Adapun SDS yang merupakan sejenis deterjen dapat digunakan untuk merusak membran sel. Ini semua menyebabkan sel menjadi lisis. Kotoran sel yang ditimbulkan akibat perusakan oleh EDTA dan SDS dibersihkan dengan cara sentrifugasi, sehingga yang tertinggal hanya molekul nukleotida (DNA dan RNA). Untuk menghilangkan protein dari larutan, digunakan phenol (mengikat protein dan sebagian kecil RNA) dan chloroform (membersihkan protein dan polisakarida dari larutan). Etanol berfungsi untuk memekatkan, memisahkan DNA dari larutan dan mengendapkan DNA.

12 3. Tahap pemurnian DNA plasmid Tahap ini meliputi proses berikut: Lapisan atas hasil dari tahap sebelumnya diambil, ditambahkan CIAA dengan perbandingan 1:1 (v/v).dicampur dengan vortek. Disentrifugasi rpm selama 5 menit, kemudian lapisan atas diambil. Supernatan ditransfer ke tabung yang baru kemudian dilakukan ekstraksi dengan PCI (fenol-kloroform-isoamil alkohol) untuk memisahkan kandungan lipid-protein dengan DNA. Fase air (supernatan) yang mengandung DNA di tambah RNase dan diinkubasi pada 37 C semalam. Ditambah 1/10 volume 3M Na asetat, dan 2 kali volume ethanol absolut dingin. Dicampur dengan dibolak-balik, didiamkan dalam -20oC selama 10 menit. Disentrifugasi rpm selama 10 menit, lalu pellet dicuci dengan ethanol 70%. Disentrifugasi rpm selama 10 menit. Pellet dikeringkan, ditambah TE 50 μl, masukkan ke dalam tabung. Tempatkan tabung berisi DNA plasmid pada es untuk digunakan lebih lanjut pada suhu C. jika perlu DNA dapat dielektroforesis untuk menganalisis kemurnian DNA.

13 Fungsi Penambahan Senyawa a. Penambahan C-I dilakukan dua kali karena protein mungkin masih tersisa pada tube dari pembersihan dengan C-I pertama. b. Penambahan Na Asetat membuat konsentrasi garam tinggi dan single stranded RNA tidak bisa larut pada keadaan tersebut. etanol absolut dingin akan mengendapkan DNA plasmid dan juga untuk membilas dan mencuci plasmid. c. Penambahan garam berfungsi sebagai neutralize charge pada gula fosfat DNA. Ion-ion seperti kation (Na+ Mg2+) akan menyelimuti rantai DNA yang bermuatan negatif. Jika di dalam air, gaya elektrostatik antara ion + (Na+) dan - (DNA) masih lemah karena sebagian rantai DNA masih berikatan dengan air (ingat air memiliki 2 muatan + pada H dan - pada O). Atau dapat dikatakan air punya konstanta dielektrik yang tinggi. d. Fungsi penambahan pelarut organik seperti etanol adalah untuk menurunkan konstanta dielektrik tersebut atau memperbanyak ikatan DNA dengan Na+ sehingga membuat DNA lebih mudah terpresipitasi.

14 Program Pascasarjana UNIMED Program Studi Pendidikan Biologi Mata Kuliah: Bioteknologi Dosen Pengampu: Dr. Fauziyah Harahap, M.Si By: Al Khudri Sembiring Kelas: A Semester II

15 Tahapan Isolasi DNA Plasmid metode alkaline lysis (Birnboim dan Dolly tahun 1979) (Nucleic Acids Res. 7, ). 1. Menyiapkan kultur bakteri Escherichia coli yang diinkubasi dalam suhu 37 0 C dan dalam waktu 1 malam. 2. Mengambil 8 ml bakteri dalam kultur cair dengan menggunakan mikropipet. 3. Memasukkan kultur bakteri ke dalam tabung eppendorf 15 ml. 4. Mengendapkan bakteri dengan microsentrifuge dengan kecepatan 3500 rpm selam 10 menit sehingga terbentuk pelet dan supernatan. 5. Membuang supernatan kemudian menambahkan 2 ml larutan A (EDTA dan Tris-HCl) ke dalam pelet.

16 Fungsi-fungsi Senyawa EDTA : Thrometamine ethylenediamine tetraacetic acid: sebagai kofaktor yang esensial bagi aktivitas Dnase dalam mencacah molekul DNA Tris HCL: Thrometamine HCL: Buffer menjaga ph, melindungi isi sel agar tidak lisis. SDS : Sodium dodesil sulfat : Mendenaturasi protein yang ada dalam lisat, dengan jalan memutuskan ikatan-katan non kovalen (terutama ikatan hidrogen) pada protein, sehingga kembali ke struktur primernya, sebagai rantai linier polipeptida. NaOH (sodium hidroksida) : Pemisahan DNA plasmid dari DNA kromosomal.

17 Tahapan Isolasi DNA Plasmid (Lanjutan) 6. Memvortex campuran dengan kecepatan 3500 rpm. 7. Menambahkan 2 ml larutan B (NaOH dan SDS) ke dalam campuran pelet dan larutan A. Kemudian dibolakbalik 4-6 kali. 8. Menambahkan larutan C (Ka-Asetat) pada campuran pelet, larutan A, dan larutan B. Setelah itu memvortexnya dengan menggunakan microsentrifuge dengan kecepatan 3500 rpm selama 10 menit hingga terbentuk supernatan dan pelet. 9. Mengambil supernatan sebanyak 4 ml dan memasukkan ke dalam tabung yang baru kemudian didiamkan selama 1 malam

18 Tahap presipitasi 1. Menambahkan ± 0,1 vol NaOAc dan ± 2,5 vol larutan ethanol absolut dingin ke dalam 4 ml supernatan yang telah didiamkan selama 1 malam. 2. Menyimpannya ke dalam freezer dengan suhu C sampai -4 0 C selama 1 jam. 3. Mengendapkan DNA plasmid dengan disentrifuge dengan kecepatan 3500 rpm selama 15 menit. 4. Membuang supernatan dan membalik botol konikel di atas tissue dan mendiamkannya selama ± 5 menit.

19 Tahap pembilasan 1. Membilas DNA plasmid yang diperoleh dengan menambahkan 2 ml ethanol 70 % pada pellet dan mendiamkankannya selama ± 5 menit. 2. Membuang etanol 70 % dan membalik botol konikel di atas tissue sampai kering selama ± 5 menit. 3. Menambahkan 50 mikrolit dh 2 O pada DNA plasmid dengan menyedot dan menyemprotkan kembali sebanyak ± 6 kali dengan mikropipet tip warna kuning sampai bercampur. 4. Memipet larutan dengan mikropipet tip warna kuning dan memasukannya ke dalam botol eppendorf kemudian dimasukkan ke dalam freezer. HASIL akhir 1. Sentrifuge setelah inkubasi : Terbentuk dua lapisan yaitu supernatan yang berwarna keruh dan pellet yang berwarna kuning 2. Setelah Penambahab larutan C : Terbentuk endapan putih 3. Sentrifuge setelah penambahan larutan C : Terbentuk 3 lapisan. Lapisan bawah adalah pellet yang mengandung plasmid lapisan tengah adalah supernatant, dan lapisan atas adalah debris molekul

20 Fungsi zat-zat Glukosa: berfungsi menjaga tekanan osmotik sel agar tidak pecah. FKI (Phenol : Chloroform : Isoamilalkohol) : Memisahkan kandungan lipid, protein dari DNA, menghilangkan kontaminan yg masih melekat NaOAc: menyesuaikan kondisi yang tepat bagi enzim agar bekerja secara maksimal dan menjaga keseimbanagan sel agar tidak lisis Asam asetat : Menetralkan suasana basa yang diciptakan oleh ion hidroksida dari NaOH yang diberikan pada tahap lisis sebelumnya ethanol absolut 70 % : memurnikan DNA mikrolit dh 2 O :

21 DAFTAR PUSTAKA Calladine, C. R., Horace R D., Ben F L., Andrew A T Understanding DNA. Amsterdam : Academic Press. Campbell, N.A., J.B. Reece, & L.G. Mitchell Biologi 5th ed. Jakarta :Erlangga. Lodish, H., Arnold B., S. Lawrence Z., Paul M., David B. James D Molecular Cell Biology. Wh Freeman Company Suryani, Yoni dkk Petunjuk Praktikum Biologi Sel Dan Molekuler. Yogyakarta: Universitas Negeri Yogyakarta.

22 Isolasi DNA Plasmid ERLIA UTAMI PANJAITAN Kelas A 2013 Pendidikan Biologi

23 Isolasi DNA plasmid Plasmid adalah molekul DNA sirkular berukuran kecil yang terpisah dari kromsom. Palsmid ini ditemukan di dlam bakteri dn ragi yang merupakan eukariota uniseluler. Plasmid dapat bereplikasi tanpa tergantung dengan genom sel yang lain dan kadang-kadang ditransfer diantara sel-sel. DNA plasmid merupakan wadah yang digunakan untuk kloning gen, sehingga DNA plasmid harus di pisahkan dari DNA kromosom. DNA plasmid mempunyai ukuran yang jauh lebih kecil daripada DNA kromosom

24 Tahapan isolasi DNA plasmid 1. Sampel berupa biakan Escherichia coli yang mengandung plasmid. 2. Biakan E. Colli kemudian diisolasi dari cawan dan tumbuhan di dalam 2 ml media LB (Luria Bertani) yang mengandung 100 ml/gr ampisilin di dalam shaker (250 rpm) pada suhu 37 0 C selama satu malam. 3. Diendapkan dengan sentrifugasi pada rpm pada suhu 4 0 C selama 10 menit 4. Endapan bakteri disuspensikan dalam 300 µl buffer suspensi sel (50mM Tris-HCl, ph 7,5, 10 mm EDTA). 5. Dilakukan vortex.

25 Fungsi- fungsi Senyawa Luria Bertani medium yang mengandung Amphisilin ; berguna untuk merangsang E.coli resisten antibotik dan menghambat kontaminan yang peka. Larutan buffer ; untuk menjaga struktur DNA selama proses penghancuran dan purifikasi sehingga memudahkan dalam menghilangkan protein dan RNA serta mencegah aktivitas enzim pendegradasi DNA dan mencegah perubahan pada molekul DNA. Tris HCl ; Thrometamine HCl; buffer menjaga ph, melindungi isi sel agar tidak lisis EDTA ; ethylenediamine tetraacetic acid: menginaktivasi enzim DNAse yang dapat mendenaturasi DNA yang di isolasi

26 Tahapan isolasi DNA plasmid (Lanjutan) 6. Bila sudah tidak ada endapan, dilisis dengan menggunakan 300 µl buffer lisis 7. Tabung reaksi di balik-balikkan 8x, dan di biarkan 1-2 menit. 8. Setelah lisis campuran ditambakan 300 µl buffer netralisasi dan dibalik-balikan kembali agar tercampur rata. 9. Disentrifugasi pada kecepatan rpm pada suhu 4 0 C selama 20 menit. 10. Cairan jernih di bagian atas di ambil dan dipindahkan ke tabung ependorf yang bersih 11. Cairan yang mengandung DNA plasmid diekstraksi dengan fenol. 12. Divortex

27 Tahapan isolasi DNA plasmid (Lanjutan) 13. Disentrifugasi lagi pada kecepatan rpm dengan suhu ruang selama 1-2 menit. 14. Terbentuk dua fase yang dibatasi oleh dua lapisan putih yang sangat tipis 15. cairan bagian atas dipindahkan ke tabung ependorf yang bersih atau yang baru 16. Di tambah Rnase dan diinkubasi selama 30 menit pada suhu 37 0 C, untuk menghilangkan RNA. 17. DNA plasmid diendapkan dengan sentrifugasi pada kecepatan rpm selama 20 menit. 18. Endapan dibilas dengan etanol 70% dan disentrifugasi 19. Endapan dikeringkan kemudian ditambah ddh 2 O dan Rnase. 20. Endapan diinkubasi selama satu malam pada suhu 37 0 C

28 Fungsi- fungsi Senyawa Fenol ; memisahkan kandungan lipid, protein dari DNA, menghilangkan kontaminan yang masih melekat RNAse ; enzim yang memisahkan DNA dengan RNA, melisis RNA Etanol ; dilakukan pencucian dengan etanol, perlakuan tersebut bertujuan untuk menghilangkan residu etanol dari pelet DNA. Larutan ddh 2 O dan RNAse : berfungsi menghilangkan sisa-sisa RNA untuk memperoleh yang murni

29 Metode elektroforesis 1. mensuspensikan gel agarose didalam larutan penyangga yang sesuai (TAE 1x) dengan konsentrasi tertentu sesuai dengan kebutuhan di dalam erlenmeyer. 2. Kemudian dipanaskan dengan microwave atau hot-plate hingga tidak terlihat lagi butiran agarose, dan dilarutkan menjadi jernih (transparan, tidak putih). 3. Agarose dibiarkan dingin terlebih dahulu sambil menyiapkan tempat untuk menuang gel (tray). 4. Kemudian dipasang sisir pada tempat tersebut 5. Setelah suhu turun, agarose dituangkan ke dalam tempat tersebut.

30 Metode elektroforesis (Lanjutan) 6. Setelah beku, gel ditempatkan pada alat untuk elektroforesis sedemikian rupa sehingga sisir terletak pada kutub negative 7. dituangkan larutan penyangga TAE 1x sampai gel terendam 8. Sisir diambil secara hati-hati, selanjutnya ditambahkan ethidium bromida (EtBr) pada larutan penyangga sebagia pewarna DNA. 9. DNA yang akan dimigrasi dicampur dengan larutan pewarna (loading dye) untuk menandai laju migrasi. 10. Larutan DNA yang telah di campur loading dye dimasukkan ke dalam sumur pada gel agarose menggunakan pipet mikro

31 Fungsi- fungsi Senyawa TAE : Tris Asetat EDTA; memisahkan molekul DNA dan RNA etidhium bromida ; untuk membantu visualisasi, karena etidhium bromida akan memendarkan sinar UV

32 Metode elektroforesis (Lanjutan) 11. Alat elektroforesis dihubungkan dengan alat catu listrik sedemikian sehingga kutub positif dihubungkan dengan kutub positif dan kutub negatif dengan kutub negatif. 12. DNA bermigrasi dari kutub negatif ke kutub positif. 13. Selanjutnya alat catu listrik dihidupkan pada volt (tergantung dari besarnya DNA dan larutan penyangga yang digunakan) 14. Setelah cukup jauh bromfenol biru bermigrasi, catu listrik dimatikan. 15. Kemudian gel diambil, dibilas dan diperiksa DNA yang bermigrasi dengan menggunakan sinar ultraviolet.

33

34 ISOLASI DNA PLASMID DEWI SARTIKA SARI PROGRAM PASCASARJANA PENDIDIKAN BIOLOGI ISOLASI DNA PLASMID

35 DNA PLASMID Plasmid merupakan DNA ekstrakromosomal yang berbeda karakternya dengan DNA kromosomal, berupa DNA sirkuler yang terdapat di sitoplasma, beruntai ganda serta mampu secara independen bereplikasi. Plasmid memiliki ukuran yang relatif kecil dan terletak di luar kromosom dalam sel prokariot khususnya bakteri dan sel eukariot tingkat rendah seperti khamir.

36 TAHAP ISOLASI DNA PLASMID Pengamatan DNA plasmid dilakukan melalui proses : 1. isolasi plasmid 2. elektroforesis 3. visualisasi menggunakan sinar ultraviolet (UV) (Yuwono, 2009)

37 ISOLASI DNA Prinsip Isolasi DNA Prinsip dasar isolasi total DNA/RNA dari jaringan adalah dengan memecah dan mengekstraksi jaringan tersebut sehingga akan terbentuk ekstrak sel yang terdiri DNA, RNA dan substansi dasar lainnya Isolasi DNA dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan DNA dari bahan lain seperti protein,lemak, dan karbohidrat. Ekstraksi Pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein Menghilangkan beberapa kontaminan seperti senyawa sekunder (fenol), polisakarida, RNA dan juga protein. Isolasi Pemurnian

38 Larutan I (glucose) Jika ada larutan berkonsentrasi tinggi masuk ke dalam sel, dengan sendirinya membran sel akan rusak Kultur Bakteri (E.Coli) Larutan II (NaOH & SDS) NaOH : merusak membran sel SDS : sabun untuk menghancurkan membran sel Indikator untuk melihat lendir-lendir dimulut tabung yang menandakan bahwa bahwa membran sel telah terpecah - Kultur selama 1 malam - Sentrifuge (mengambil kultur dan menghilangkan medium) Larutan III (netralisasi) METODA ISOLASI DNA BAKTERI - sentrifuge Menggumpal & menyatu Supernatan (berisi DNA) - Treatment PCI (Phenol : Chloroform : Isoamyl alcohol) DNA bebas dari komponen lain + etanol 100% dan NaAc (membantu pengendapan) Pengendapan - Inkubasi - Cuci dengan EtOH 70% - Keringkan DNA murni

39 TAHAPAN ISOLASI DNA PLASMID 1. Sampel bakteri Escherichia coli yang diinkubasi dalam suhu 37 0 C dan dalam waktu 1 malam. 2. Mengambil 8 ml bakteri dalam kultur cair dengan menggunakan mikropipet. 3. Memasukkan kultur bakteri ke dalam tabung eppendorf 15 ml 4. endapkan bakteri dengan microsentrifuge dengan kecepatan 3500 rpm selam 10 menit sehingga terbentuk pelet dan supernatan. 5. supernatan dibuang, kemudian menambahkan 2 ml larutan A (EDTA dan Tris-HCl) ke dalam pelet.

40 TAHAPAN ISOLASI DNA PLASMID 6. Memvortex campuran dengan kecepatan 3500 rpm. 7. Ditambahkan 2 ml larutan B (NaOH dan SDS) ke dalam campuran pelet dan larutan A. Kemudian dibolak-balik 4-6 kali 8. Menambahkan larutan C (Ka-Asetat) pada campuran pelet, larutan A, dan larutan B. Setelah itu memvortexnya dengan menggunakan microsentrifuge dengan kecepatan 3500 rpm selama 10 menit hingga terbentuk supernatan dan pelet. 9. Mengambil supernatan sebanyak 4 ml dan memasukkan ke dalam tabung yang baru kemudian didiamkan selama 1 malam

41 FUNGSI- FUNGSI SENYAWA EDTA : ethylenediami tetraacetic acid : Menginaktivasi enzime DNAse yang dapat mendenaturasi DNA yang diisolasi Tris-HCl ( Thrometamine HCL) : merupakan buffer yang menjaga ph, melindungi isi sel agar tidak lisis NaOH (Natrium Hidroksida) merupakan alkali yang berfungsi merusak membran sel SDS (sodium dodecyl sulfate): merupakan detergen, yang dapat melisis dinding sel dan mendenaturasi protein. Ka-Asetat (Kalium asetat) sebagai penetralisir

42 TAHAP PRESIPITASI (PENGENDAPAN) 1. tambahkan ± 0,1 vol NaOAc dan ± 2,5 larutan ethanol absolut dingin ke dalam 4 ml supernatan yang telah didiamkan selama 1 malam. 2.Simpan ke dalam freezer dengan suhu 2 0 C sampai -4 0 C selama 1 jam. 3.Endapkan DNA plasmid dengan disentrifuge dengan kecepatan 3500 rpm selama 15 menit. 4. Membuang supernatan dan membalik botol konikel di atas tissue dan mendiamkannya selama ± 5 menit.

43 FUNGSI ZAT NaOAc (Sodium Asetat ): sebagai senyawa berbentuk larutan untuk presipitasi yakni mengendapkan DNA. Ethanol untuk presipitasi DNA (pengendapan)

44 TAHAP PEMURNIAN. 1. Membilas DNA plasmid yang diperoleh dengan menambahkan 2 ml ethanol 70 % pada pellet dan mendiamkankannya selama ± 5 menit. 2. Membuang etanol 70 % dan membalik botol konikel di atas tissue sampai kering selama ± 5 menit. 3. Menambahkan 50 mikrolit dh 2 O pada DNA plasmid dengan menyedot dan menyemprotkan kembali sebanyak ± 6 kali dengan mikropipet tip sampai bercampur. 4. Menghisap larutan dengan mikropipet tip dan memasukannya ke dalam botol eppendorf kemudian dimasukkan ke dalam freezer.

45 FUNGSI ZAT-ZAT 1. ethanol 70 % untuk membersihkan sisa-sisa larutan yang digunakan untuk mengendapkan plasmid sebelumnya sehingga dapat diperoleh plasmid yang murni. 2. mikrolit dh 2 O berfungsi melarutkan DNA agar DNA yang diendapkan tercampur (Brown 2010).

46 METODE POLYMERASE CHAIN REACTIONS (PCR) Sebanyak 33,6 ml ddh 2 O (Water Nucleus Free) dimasukkan ke dalam tabung Eppendorf. Kemudian ditambahkan kromosom (template DNA)1 ml; primer forward 16s rrna dan primer reserve 16s rrna 2 ml;dntp (10mM) 1 ml; 5 ml buffer (dapar) PCR dan Mg 2+ (MgCl 2 )sebanyak 5 ml. PCR (tahap denaturasi awal 94 0 C selama dua menit; penempelan (annealing) 48 0 C selama satu menit, extention 72 0 C selama satu menit, reaksi dilakukan sebanyak 30 siklus).

47 ELEKTROFORESIS Produk PCR dielektroforesis dan hasil elektroforesis dilihat dibawah sinar UV 312 nm menggunakan alat transilluminatoruv (Cole- Palmer) Sebagai penampak bercak digunakan ethidium bromida.

48 ISOLASI DNA PLASMID Disusun oleh : Dian RamadhaniTanjung NPM : Pendidikan Biologi A

49 PLASMID Plasmid adalah molekul DNA utas ganda sirkuler (tidak berujung) yang berukuran kecil yang terdapat di dalam sitoplasma dan dapat melakukan replikasi secara autonom Plasmid merupakan salah satu vektor pembawa molekul DNA di dalam proses rekayasa DNA melalui teknologi DNA rekombinan.

50 Beberapa hal yang dapat menyebabkan plasmid dapat digunakan sebagai wahana (vektor) kloning : Plasmid mempunyai ukuran molekul yang kecil sehingga DNA nya lebih mudah diisolasi dan dimanipulasi; DNA-nya berbentuk sirkuler sehingga DNA akan lebih stabil selama diisolasi secara kimia; Mempunyai titik ori (origin of replication) sehingga dapat memperbanyak diri (bereplikasi) di dalam sel inang secara otonomi Mempunyai jumlah kopi yang banyak (multiple copy) sehingga terdapat di dalam sel dalam jumlah banyak dan membuat DNA lebih mudah diamplifikasi; Mempunyai penanda seleksi, yakni gen ketahanan terhadap antibiotik tertentu sehingga lebih memudahkan dalam mendeteksi plasmid yang membawa gen tertentu.

51 TAHAPAN ISOLASI DNA PLASMID 1. Tahap kultivasi dan harvesting 2. Tahap resuspensi dan lisis DNA plasmid 3. Tahap pemurnian DNA plasmid

52 Tahap kultivasi dan Harvesting Kultivasi yaitu memberikan kesempatan bagi bakteri untuk memperbanyak diri sehingga pada saat pemanenan didapatkan plasmid dalam jumlah yang banyak. Bakteri yang digunakan dalam praktikum ini adalah E. coli yang telah tersisipi plasmid.

53 Kultivasi dimulai dengan tahapan sebagai berikut: 1. Bakteri ditumbuhkan pada medium LB, digojog pada suhu 370C,selama 1 malam ml kultur disentrifugasi 3000 rpm,15 menit, pada suhu 40C. 3. Supernatan dibuang, pada pellet ditambahkan 750 μl buffer lisis (100mM Tris HCl ph 8,100mM NaCl,50 mm EDTA,2% SDS ), lalu divortek μl ( 10 mg/ml) Proteinase-K ditambahkan. 5. Diinkubasi pada suhu 550C selama 30 menit. 6. Disentrifugasi dengan kecepatan rpm, selama 15 menit, pada suhu 40C. 7. Dipindahkan supernatannya pada tabung eppendorf 1,5 ml. 8. Kemudian ditambahkan 700 μl phenol, digojog pelan. 9. Disentrifugasi rpm selama 10 menit, lapisan atas dipindahkan dalam tabung eppendorf 1,5 ml. 10. Ditambahkan etanol dingin, perbandingan 1:1 (v/v), dicampur pelanpelansehingga timbul benang-benang halus DNA 11. Benang-benang halus DNA diambil dan dicuci dengan etanol 70%. 12. Disentrifugasi rpm, 10 menit, supernatan dibuang, pelet dikeringkan. 13. Ditambahkan TE, hingga volume 200 ml.

54 Fungsi Zat Zat 1. LB ( Lactose broth ) yang terdiri dari Pepton dan ekstrak beef menyediakan nutrien esensial untuk memetabolisme bakteri. Laktosa menyediakan sumber karbohidrat yang dapat difermentasi untuk organisme koliform. Pertumbuhan dengan pembentukan gas adalah presumptive test untuk koliform. Lactose broth dibuat dengan komposisi 0,3% ekstrak beef; 0,5% pepton; dan 0,5% laktosa. 2. Sentrifugasi adalah proses yang memanfaatkan gaya sentrifugal untuk sedimentasi campuran dengan menggunakan mesin sentrifuga atau pemusing 3. Tris HCl ph, NaCl, EDTA, SDS berfungsi untuk menghilangkan polisakarida sementara

55 4. TE Buffer adalah campuran antara larutan Tris-HCl dengan EDTA pada konsentrasi tertentu berfungsi sebagai larutan penyangga, memiliki kapasitas buffering terendah tetapi memberikan resolusi terbaik untuk DNA yang lebih besar Kemudian dilanjutkan dengan harvesting (pemanenan plasmid) sebanyak yang diperlukan.

56 2. Tahap Resuspensi dan Lisis DNA Plasmid Lisis (pemecahan dinding sel), membran sel bakteri tersusun atas membran luar dan membran dalam, membran luar terdiri atas lipopolisakarida, protein, fosfolipid, lipoprotein, dan peptidoglikan sedangkan membran dalam tersusun atas membran fosfolipid bilayer yang juga terintegrasi protein di dalamnya (Saunders and Parkers, 1999). Lisis dinding sel dapat dilakukan dengan menambahkan senyawa kimia seperti lisozim, EDTA (ethilendiamin tetraasetat), dan SDS (sodium dodesil sulfat).

57 Berikut ini adalah prosedur resuspensi dan lisis DNA plasmid: 1. Diambil sebanyak 1-2 koloni bakteri dari lempeng agar, dipindahkan ke dalam tabung yang telah berisi 5 ml LB-medium dan antibiotik. 2. Digojok kuat-kuat dalam shaker incubator 37oC, semalam. 3. Disentrifugasi rpm selama 10 menit. 4. Supernatan dibuang, pelet diresuspensi dengan 100 ml Lysing solution 1, didiamkan dalam es selama 5 menit. 5. Ditambahkan 200 ml Lysing solution 2, diinkubasi pada es selama 5 menit. 6. Ditambahkan 150 ml Lysing solution 3, dicampur dengan cara membolakbalikkan, diinkubasi dalam es selama 5 menit. 7. Disentrifus dengan kecepatan rpm selama 10 menit. 8. Supernatan diambil dalam filter, pellet dibuang. 9. Ditambah phenol CIAA sebanyak volume supernatan, dicampur denga Vortek. 10. Disentrifugasi dengan kecepatan rpm selama 5 menit.

58 Fungsi Zat zat Dalam hal ini fungsi EDTA adalah sebagai perusak sel dengan cara mengikat magnesium yang berfungsi untuk mempertahankan integritas sel maupun mempertahankan aktivitas enzim nuklease yang merusak asam nukleat. Adapun SDS yang merupakan sejenis deterjen dapat digunakan untuk merusak membran sel yang menyebabkan sel menjadi lisis. Kotoran sel yang ditimbulkan akibat perusakan oleh EDTA dan SDS dibersihkan dengan cara sentrifugasi, sehingga yang tertinggal hanya molekul nukleotida (DNA dan RNA). Untuk menghilangkan protein dari larutan, digunakan phenol (mengikat protein dan sebagian kecil RNA) dan chloroform (membersihkan protein dan polisakarida dari larutan). Etanol berfungsi untuk memekatkan, memisahkan DNA dari larutan dan mengendapkan DNA.

59 3. Tahap pemurnian DNA plasmid 1. Lapisan atas hasil dari tahap sebelumnya diambil, ditambahkan CIAA dengan perbandingan 1:1 (v/v). 2. Dicampur dengan vortek. 3. Disentrifugasi rpm selama 5 menit, kemudian lapisan atas diambil. 4. Supernatan ditransfer ke tabung yang baru kemudian dilakukan ekstraksi dengan PCI (fenol-kloroform-isoamil alkohol) untuk memisahkan kandungan lipid-protein dengan DNA. 5. Fase air (supernatan) yang mengandung DNA di tambah RNase dan diinkubasi pada 37 C semalam. 6. Ditambah 1/10 volume 3M Na asetat, dan 2 kali volume ethanol absolut dingin.

60 7. Dicampur dengan dibolak-balik, didiamkan dalam -20oC selama 10 menit. 8. Disentrifugasi rpm selama 10 menit, lalu pellet dicuci dengan ethanol 70%. 9. Disentrifugasi rpm selama 10 menit. 10. Pellet dikeringkan, ditambahte 50 μl, masukkan ke dalam tabung. 11. Tempatkan tabung berisi DNA plasmid pada es untuk digunakan lebih lanjut pada suhu C. jika perlu DNA dapat dielektroforesis untuk menganalisis kemurnian DNA.

61 Fungsi Zat zat Tahap pemurnian DNA plasmid meliputi proses neutralizer, presipitasi, dan pembilasan DNA plasmid. Penambahan C-I dilakukan dua kali karena protein mungkin masih tersisa pada tube dari pembersihan dengan C-I pertama. Penambahan Na Asetat membuat konsentrasi garam tinggi dan single stranded RNA tidak bisa larut pada keadaan tersebut. etanol absolut dingin akan mengendapkan DNA plasmid dan juga untuk membilas dan mencuci plasmid.

62 Penambahan garam berfungsi sebagai neutralize charge pada gula fosfat DNA. Ion-ion seperti kation (Na+ Mg2+) akan menyelimuti rantai DNA yang bermuatan negatif. Fungsi penambahan pelarut organik seperti etanol adalah untuk menurunkan konstanta dielektrik tersebut atau memperbanyak ikatan DNA dengan Na+ sehingga membuat DNA lebih mudah terpresipitasi.

63 Uji Kuantitas Uji Kuantitas DNA dilakukan dengan spektrofotometer UV dengan panjang gelombang 256 nm (260 nm). Kualitas DNA yang berhubungan dengan kemurnian terhadap kontaminan protein dapat dilihat dari perbandingan absorbansi suspensi DNA pada panjang gelombang 260 nm terhadap 280 nm. Rasio OD260/OD280 antara 1,8-2,0 mencerminkan DNA yang relatif murni dan terbebas dari kontaminan protein. Nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 nm dapat dikonversikan menjadi konsentrasi, yaitu nilai 1 pada OD260 = 50 ug DNA utas ganda tiap ml (Suharsono danwidyastuti, 2006)

64 Uji Kulitas Uji Kualitas DNA dilakukan dengan elektroforesis. DNA yang terdapat di gel diwarnai dengan ethidium bromida (EtBr), kemudian dilihat di atas sinar ultra violet Sebelum dilakukan elektroforesis, suspensi DNA terlebih dahulu harus ditambahkan loading buffer (dye) Pembacaan pita DNA di dalam gel yang telah diwarnai dengan ethidium bromida di atas lampu UV yang dibandingkan dengan DNA standar

65 PCR Sebanyak 5µl komposisi PCR koloni yang telah dimix dengan 0,3 µl primer L1 dan 0,3µl primer L2, selama dalam mesin PCR dilakukan pradenaturasi pada suhu 95ºC selama 5 menit, berlanjut terjadinya denaturasi selama 5 menit, proses annealing pada suhu 52ºC selama 30 menit, kemudian extension 72ºC selama 2 menit dan proses akhir selama 10 menit.

66 Restriksi Enzim restriksi endonuklease (enzim restriksi) mengenali urutan nukleotida spesifik dan memotong DNA pada posisi di antara atau di luar sekuen yang dikenalinya tersebut. Enzim yang digunakan dalam isolasi DNA plasmid adalah Enzyme tipe II yang menghasilkan fragmen-fragmen tertentu dengan pola pita-pita yang spesifik pada gel agarosa. Satu unit enzim restriksi akan memotong 1 ug DNA secara sempurna dalam 50 ul reaksi selama 1 jam.

67 Digesti dengan Enzim Restriksi pada Pemetaan DNA Plasmid Sebanyak 5-10 ug DNA plasmid yang akan dipotong menjadi fragmenfragmen, 2 ul larutan penyangga reaksi 10x (10%), 1 ul enzim restriksi (10 unit/ul) dan dh2o hingga volume larutan menjadi 20 ul dimasukkan ke dalam tabung eppendorf 500 ul (dengan urutan: dh2o, larutan penyangga, DNA plasmid, enzim). Kemudian larutan diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37 C Bila DNA belum terpotong sempurna, waktu inkubasi dan/enzim restriksi ditambahkan lagi. Bila telah terpotong, aktivitas enzim dihentikan dengan memanaskan larutan DNA pada suhu C. Enzim-enzim restriksi yang digunakan antara lain: 1. NotI, 2. EcoRI, 3. HindIII, 4. SacI, 5. EcoRI dan HindIII, 6. HindIII dan SacI, 7. NotI dan HindIII, 8. NotI dan EcoRI.

68 ISOLASI DNA PLASMID M. K : BIOTEKNOLOGI JHONAS DONGORAN ( ) PROGRAM STUDI PENDIDIKAN BIOLOGI ( Kelas- A ) PROGRAM PASCASARJANA UNIVERSITAS NEGERI MEDAN 2014

69 ISOLASI DNA DNA merupakan suatu materi genetik yang terbentuk dari dua kelompok basa yang berbeda yang mengandung nitrogen, yaitu purin dan pirimdin. DNA terdapat di dalam setiap sel makhluk hidup yang sangat berperan penting sebagai pembawa informasi hereditas yang menentukan stuktur protein dan proses metabolisme lain. Isolasi DNA adalah memisahkan DNA kromosom atau DNA genom dari komponen-komponen sel lain. Sumber DNA bisa dari tanaman, kultur mikroorganise, atau sel manusia.

70 PLASMID PLASMID : Molekul DNA utas ganda sirkular, berukuran kecil yang terdapat di dalam sitoplasma dan dapat melakukan replikasi secara autonom

71 KARAKTER PLASMID 1. Dapat melakukan replikasi 2. Terdapat di luar kromosom 3. Secara genetik dapat ditransfer dengan stabil 1 sel 1 plasmid

72 KELOMPOK PLASMID 1. Plasmid F (fertilitas) ---- gen tra (konjugasi) 2. Plasmid R (resisten) ---- antibiotik, L.B. 3. Plasmid dengan penyandi toksin dan bakteriosin 4. Plasmid degradatif ---- metabolisme mol. organik (Pseudomonas putida) 5. Plasmid virulensi ---- patogenitas sel inang (Agrobacterium tumifaciens)

73 Isolasi DNA Plasmid Isolasi DNA plasmid adalah menghancurkan membran sel sehingga semua organel sel dapat keluar, sehingga didapatkan DNA kromosomal serta DNA ekstrakromosmal (plasmid). Metode yang digunakan untuk isolasi plasmid, yaitu boiling lysis, lysis with detergent, mechanical lysis, alkaline lysis, dan enzimatic digestion. Metode yang paling banyak digunakan dalam isolasi ini adalah metode alkaline lysis.

74 Tahapan Isolasi DNA Plasmid 1) Tahap kultivasi dan harvesting Kultivasi yaitu memberikam kesempatan bagi bakteri untuk memperbanyak diri sehingga pada saat pemanenan didapatkan plasmid dalam jumlah yang banyak.

75 Kultivasi dimulai dengan tahapan sebagai berikut: - Bakteri ditumbuhkan pada medium LB, digojog pada suhu 370C,selama 1 malam ml kultur disentrifugasi 3000 rpm,15 menit, pada suhu 40C. - Supernatan dibuang, pada pellet ditambahkan 750 μl buffer lisis (100mM Tris HCl ph 8,100mM NaCl,50 mm EDTA,2% SDS ), lalu divortek μl ( 10 mg/ml) Proteinase-K ditambahkan. - Diinkubasi pada suhu 550C selama 30 menit. - Disentrifugasi dengan kecepatan rpm, selama 15 menit, pada suhu 40C. - Dipindahkan supernatannya pada tabung eppendorf 1,5 ml. - Kemudian ditambahkan 700 μl phenol, digojog pelan. - Disentrifugasi rpm selama 10 menit, lapisan atas dipindahkan dalam tabung eppendorf 1,5 ml. - Ditambahkan etanol dingin, perbandingan 1:1 (v/v), dicampur pelan-pelansehingga timbul benang-benang halus DNA. - Benang-benang halus DNA diambil dan dicuci dengan etanol 70%. - Disentrifugasi rpm, 10 menit, supernatan dibuang, pelet dikeringkan. - Ditambahkan TE, hingga volume 200 ml. Kemudian dilanjutkan dengan harvesting (pemanenan plasmid) sebanyak yang diperlukan.

76 2) Tahap resuspensi dan lisis DNA plasmid Lisis (pemecahan dinding sel), membran sel bakteri tersusun atas membran luar dan membran dalam, membran luar terdiri atas lipopolisakarida, protein, fosfolipid, lipoprotein, dan peptidoglikan sedangkan membran dalam tersusun atas membran fosfolipid bilayer yang juga terintegrasi protein di dalamnya (Saunders and Parkers, 1999). Secara kimia lisis dinding sel dapat dilakukan dengan menambahkan senyawa kimia seperti lisozim, EDTA (ethilendiamin tetraasetat), dan SDS (sodium dodesil sulfat). Dalam hal ini fungsi EDTA adalah sebagai perusak sel dengan cara mengikat magnesium. Ion ini berfungsi untuk mempertahankan integritas sel maupun mempertahankan aktivitas enzim nuklease yang merusak asam nukleat. Adapun SDS yang merupakan sejenis deterjen dapat digunakan untuk merusak membran sel. Untuk menghilangkan protein dari larutan, digunakan phenol (mengikat protein dan sebagian kecil RNA) dan chloroform (membersihkan protein dan polisakarida dari larutan). Etanol berfungsi untuk memekatkan, memisahkan DNA dari larutan dan mengendapkan DNA.

77 Berikut ini adalah prosedur resuspensi dan lisis DNA plasmid: Diambil sebanyak 1-2 koloni bakteri dari lempeng agar, dipindahkan ke dalam tabung yang telah berisi 5 ml LB-medium dan antibiotik. Digojok kuat-kuat dalam shaker incubator 37oC, semalam. Disentrifugasi rpm selama 10 menit. Supernatan dibuang, pelet diresuspensi dengan 100 ml Lysing solution 1, didiamkan dalam es selama 5 menit. Ditambahkan 200 ml Lysing solution 2, diinkubasi pada es selama 5 menit. Ditambahkan 150 ml Lysing solution 3, dicampur dengan cara membolakbalikkan, diinkubasi dalam es selama 5 menit. Disentrifus dengan kecepatan rpm selama 10 menit. Supernatan diambil dalam filter, pellet dibuang. Ditambah phenol CIAA sebanyak volume supernatan, dicampur dengan Vortek. Disentrifugasi dengan kecepatan rpm selama 5 menit.

78 3) Tahap pemurnian DNA plasmid Tahap pemurnian DNA plasmid meliputi proses neutralizer, presipitasi, dan pembilasan DNA plasmid. penambahan C-I dilakukan dua kali karena protein mungkin masih tersisa pada tube dari pembersihan dengan C-I pertama. Penambahan Na Asetat membuat konsentrasi garam tinggi dan single stranded RNA tidak bisa larut pada keadaan tersebut. etanol absolut dingin akan mengendapkan DNA plasmid dan juga untuk membilas dan mencuci plasmid. Penambahan garam berfungsi sebagai neutralize charge pada gula fosfat DNA. Ion-ion seperti kation (Na+ Mg2+) akan menyelimuti rantai DNA yang bermuatan negatif. Jika di dalam air, gaya elektrostatik antara ion + (Na+) dan - (DNA) masih lemah karena sebagian rantai DNA masih berikatan dengan air (ingat air memiliki 2 muatan + pada H dan - pada O). Atau dapat dikatakan air punya konstanta dielektrik yang tinggi. Fungsi penambahan pelarut organik seperti etanol adalah untuk menurunkan konstanta dielektrik tersebut atau memperbanyak ikatan DNA dengan Na+ sehingga membuat DNA lebih mudah terpresipitasi.

79 Tahap pemurnian meliputi sebagai berikut : Lapisan atas hasil dari tahap sebelumnya diambil, ditambahkan CIAA dengan perbandingan 1:1 (v/v). Dicampur dengan vortek. Disentrifugasi rpm selama 5 menit, kemudian lapisan atas diambil. Supernatan ditransfer ke tabung yang baru kemudian dilakukan ekstraksi dengan PCI (fenol-kloroform-isoamil alkohol) untuk memisahkan kandungan lipid-protein dengan DNA. Fase air (supernatan) yang mengandung DNA di tambah RNase dan diinkubasi pada 37 C semalam. Ditambah 1/10 volume 3M Na asetat, dan 2 kali volume ethanol absolut dingin. Dicampur dengan dibolak-balik, didiamkan dalam -20oC selama 10 menit. Disentrifugasi rpm selama 10 menit, lalu pellet dicuci dengan ethanol 70%. Disentrifugasi rpm selama 10 menit. Pellet dikeringkan, ditambah TE 50 μl, masukkan ke dalam tabung. Tempatkan tabung berisi DNA plasmid pada es untuk digunakan lebih lanjut pada suhu C. jika perlu DNA dapat dielektroforesis untuk menganalisis kemurnian DNA.

80 Fungsi-fungsi Zat / Senyawa EDTA (ethilendiamin tetraasetat), dan SDS (sodium dodesil sulfat). fungsi EDTA adalah sebagai perusak sel dengan cara mengikat magnesium. Ion ini berfungsi untuk mempertahankan integritas sel maupun mempertahankan aktivitas enzim nuklease yang merusak asam nukleat. Adapun SDS yang merupakan sejenis deterjen dapat digunakan untuk merusak membran sel. Ini semua menyebabkan sel menjadi lisis. Untuk menghilangkan protein dari larutan, digunakan phenol (mengikat protein dan sebagian kecil RNA) dan chloroform (membersihkan protein dan polisakarida dari larutan). Etanol berfungsi untuk memekatkan, memisahkan DNA dari larutan dan mengendapkan DNA.

81 Lanjutan,,,!!! Na Asetat Fungsinya membuat konsentrasi garam tinggi dan single stranded RNA tidak bisa larut pada keadaan tersebut. etanol absolut dingin akan mengendapkan DNA plasmid dan juga untuk membilas dan mencuci plasmid. Penambahan garam berfungsi sebagai neutralize charge pada gula fosfat DNA. Ion-ion seperti kation (Na+ Mg2+) akan menyelimuti rantai DNA yang bermuatan negatif. Jika di dalam air, gaya elektrostatik antara ion + (Na+) dan - (DNA) masih lemah karena sebagian rantai DNA masih berikatan dengan air (ingat air memiliki 2 muatan + pada H dan - pada O).

82 Lanjutan,,,!!! Fungsi penambahan pelarut organik seperti etanol adalah untuk menurunkan konstanta dielektrik tersebut atau memperbanyak ikatan DNA dengan Na+ sehingga membuat DNA lebih mudah terpresipitasi.

83 SELESAI TERIMAKASIH

84 Dosen Pengampu: Dr. Fauziyah Harahap, M.Si Tahapan Isolasi DNA Plasmid dari Bakteri Escherchia Coli Oleh: Maiderawati ( ) Program Studi Pendidikan Biologi Program Pascasarjana Universitas Negeri Medan 2014

85 Isolasi DNA adalah proses pemisahan molekul DNA dari molekul-molekul lain di inti sel. Plasmid merupakan DNA ekstrakromosom yang dikenal pada bakteri, berutas ganda, dan berbentuk sirkuler (Jusuf, 2001). Plasmid memiliki ukuran yang relatif kecil dan terletak di luar kromosom dalam sel prokariot khususnya bakteri dan sel eukariot tingkat rendah seperti khamir. Plasmid mengalami duplikasi sebelum pembelahan sel inang. Plasmid biasanya digunakan dalam teknologi DNA rekombinan menggunakan Escherichia coli sebagai inang sehingga dalam rekayasa genetika, plasmid sering digunakan sebagai vektor untuk membawa gen-gen tertentu yang diinginkan ke dalam suatu sel inang.

86 Tahap isolasi Tahapan Isolasi DNA plasmid dari bakteri Escherchia coli 1. Menyiapkan kultur bakteri Escherichia coli yang diinkubasi dalam suhu 37 0 C dan dalam waktu 1 malam. 2. Mengambil 8 ml bakteri dalam kultur cair dengan menggunakan mikropipet. 3. Memasukkan kultur bakteri ke dalam tabung eppendorf 15 ml. 4. Mengendapkan bakteri dengan microsentrifuge dengan kecepatan 3500 rpm selam 10 menit sehingga terbentuk pelet dan supernatan. 5. Membuang supernatan kemudian menambahkan 2 ml larutan A (EDTA dan Tris- HCl) ke dalam pelet. 6. Memvortex campuran dengan kecepatan 3500 rpm. 7. Menambahkan 2 ml larutan B (NaOH dan SDS) ke dalam campuran pelet dan larutan A. Kemudian dibolak-balik 4-6 kali. 8. Menambahkan larutan C (Ka-Asetat) pada campuran pelet, larutan A, dan larutan B. Setelah itu memvortexnya dengan menggunakan microsentrifuge dengan kecepatan 3500 rpm selama 10 menit hingga terbentuk supernatan dan pelet. 9. Mengambil supernatan sebanyak 4 ml dan memasukkan ke dalam tabung yang baru kemudian didiamkan selama 1 malam.

87 Fungsi Zat-zat o EDTA dapat berfungsi sebagai penghambat DNAse yang dapat mendenaturasi DNA dan sebagai pengkhelat magnesium yang berperan dalam merusak stabilitas membran plasma sehingga membran plasma menjadi tidak stabil. o Tris-HCl menjaga ph larutan sehingga DNA tetap terjaga pada ph nya. o NaOH untuk mendenaturasi DNA genomik (kromosomal) dan mulai menghidrolisis RNA. o SDS berfungsi untuk menghancurkan membran sel dan mendenaturasi protein o kalium asetat (Ka-Asetat) menyebabkan renaturasi plasmid

88 Tahapan DNA plasmid (Lanjutan) Tahap presipitasi 1. Menambahkan ± 0,1 vol NaOAc dan ± 2,5 vol larutan ethanol absolut dingin ke dalam 4 ml supernatan yang telah didiamkan selama 1 malam. 2. Menyimpannya ke dalam freezer dengan suhu -2 0 C sampai C selama 1 jam. 3. Mengendapkan DNA plasmid dengan disentrifuge dengan kecepatan 3500 rpm selama 15 menit. 4. Membuang supernatan dan membalik botol konikel di atas tissue dan mendiamkannya selama ± 5 menit.

89 Fungsi Zat-zat o NaOAc adalah garam buffer yang membantu proses pengendapan. o Ethanol absolut berguna untuk mengendapkan plasmid karena perbedaan polaritas.

90 Tahapan Isolasi DNA Plasmid (Lnjutan) Tahap pembilasan 1. Membilas DNA plasmid yang diperoleh dengan menambahkan 2 ml ethanol 70 % pada pellet dan mendiamkankannya selama ± 5 menit. 2. Membuang etanol 70 % dan membalik botol konikel di atas tissue sampai kering selama ± 5 menit. 3. Menambahkan 50 mikrolit dh 2 O pada DNA plasmid dengan menyedot dan menyemprotkan kembali sebanyak ± 6 kali dengan mikropipet tip warna kuning sampai bercampur. 4. Memipet larutan dengan mikropipet tip warna kuning dan memasukannya ke dalam botol eppendorf kemudian dimasukkan ke dalam freezer.

91 Fungsi Zat-zat o Ethanol 70 % berfungsi untuk membersihkan sisasisa larutan yang digunakan untuk mengendapkan plasmid sebelumnya sehingga dapat diperoleh plasmid yang murni. o dh 2 O steril yang berfungsi untuk melarutkan DNA plasmid.

92 Daftar Pustaka Akmalia, L Tahapan DNA plasmid dari bakteri Escherchia coli, (Online), ( diakses 14 Januari 2014). Febrina, G, Dkk Isolasi DNA Plasmid, (Online), ( diakses 14 Januari 2014). Lab Biomol Isolasi DNA, (Online), ( diakses 14 Januari 2014). Mubin, A.M Isolasi Plasmid Dna Bakteri (E. coli), (Online), ( diakses 14 Januari 2014). Prima Isolasi Plasmid Dan Elektroforesis, (Online), ( diakses 14 Januari 2014). Waliyuddin, M Isolasi Dan Pemurnian Dna Plasmid, (online), ( diakses 14 Januari 2014)

93 DOSEN PENGAMPU : Dr. FAUZIYAH HARAHAP, M.Si ISOLASI DNA PLASMID OLEH : SISKA OBERLINA PURBA NIM : PROGRAM PASCA SARJANA PENDIDIKAN BIOLOGI UNIVERSITAS NERGERI MEDAN 2014

94 Plasmid merupakan salah satu vektor pembawa molekul DNA di dalam proses rekayasa DNA melalui teknologi DNA rekombinan. Plasmid banyak sekali digunakan dalam pengklonan DNA, karena relatif mudah dalam penanganannya. Plasmid adalah molekul DNA utas ganda sirkuler (tidak berujung) yang berukuran kecil yang terdapat di dalam sitoplasma dan dapat melakukan replikasi secara autonom (Suharsono dan Widyastuti, 2006).

95 Beberapa hal penting yang dapat menyebabkan plasmid dapat digunakan sebagai wahana (vektor) kloning, antara lain adalah : a). plasmid mempunyai ukuran molekul yang kecil sehingga DNA nya lebih mudah diisolasi dan dimanipulasi; b). DNA nya berbentuk sirkuler sehingga DNA akan lebih stabil selama diisolasi secara kimia; c). mempunyai titik ori (origin of replication) sehingga dapat memperbanyak diri (bereplikasi) di dalam sel inang secara otonomi; d). mempunyai jumlah kopi yang banyak (multiple copy) sehingga terdapat di dalam sel dalam jumlah banyak dan membuat DNA lebih mudah diamplifikasi; e). mempunyai penanda seleksi, yakni gen ketahanan terhadap antibiotik tertentu sehingga lebih memudahkan dalam mendeteksi plasmid yang membawa gen tertentu (Brock, et al., 1994).

96 Tahapan Isolasi Plasmid pada Bakteri E.Coli Secara garis besar isolasi plasmid terdiri dari tiga tahapan kegiatan, yaitu tahap kultivasi dan harvesting, yakni memberikam kesempatan bagi bakteri untuk memperbanyak diri sehingga pada saat pemanenan didapatkan plasmid dalam jumlah yang banyak. tahap lisis (pemecahan dinding sel), membran sel bakteri tersusun atas membran luar dan membran dalam, membran luar terdiri atas lipopolisakarida, protein, fosfolipid, lipoprotein, dan peptidoglikan sedangkan membran dalam tersusun atas membran fosfolipid bilayer yang juga terintegrasi protein di dalamnya (Saunders and Parkers, 1999). Secara kimia lisis dinding sel dapat dilakukan dengan menambahkan senyawa kimia seperti lisozim, EDTA (ethilendiamin tetraasetat), dan SDS (sodium dodesil sulfat). tahap pemurnian DNA plasmid menghilangkan protein dari larutan, digunakan phenol (mengikat protein dan sebagian kecil RNA) dan chloroform (membersihkan protein dan polisakarida dari larutan).

97 Sambungan... Satu koloni bakteri E. coli yang mengandung plasmid ditumbuhkan dalam 10 ml media LB (bacto tryptone 10g/l, bacto-yeast extract 5g/l, NaCl 10 g/l) lalu diinkubasi di atas shaker dengan kecepatan 250 rpm pada suhu 37 C selama semalam. Kemudian 1,5 ml kultur dipindahkan ke dalam tabung 1,5 ml lalu diendapkan dengan sentrifugasi rpm (Tomy MRX-150) 4 C selama 10 menit. Lalu endapan bakteri disuspensikan ke dalam 100 ul buffer suspensi sel (Tris HCl ph EDTA) dan di-vortex. Kemudian ditambah 200 ul buffer lisis (0.2M NaOH, 1% SDS). Suspensi dihomogenkan dengan membolak-balik tabung (6-8kali) lalu didiamkan 3 menit. Buffer netralisasi (1,32M Na-asetat ph 4,8) ditambahkan sebanyak 300 ul dan dihomogenkan dengan membolak-balik tabung. Setelah itu, dilakukan sentrifugasi rpm 4 C selama 10 menit.

98 Supernatan ditransfer ke tabung yang baru kemudian dilakukan ekstraksi dengan PCI (fenol-kloroform-isoamil alkohol) untuk memisahkan kandungan lipid-protein dengan DNA. Fase air (supernatan) yang mengandung DNA di tambah RNase dan diinkubasi pada 37 C semalam. Kemudian DNA diendapkan dengan penambahan Naasetat ph 5,2 sehingga larutan menjadi netral dan etanol absolut untuk mengikat air. Setelah diinkubasi pada 30 C selama 2 jam, dilakukan sentrifugasi rpm 4 C selama 10 menit. Pelet dibilas dengan etanol 70% kemudian disentrifugasi kembali rpm selama 10 menit pada 4 C. Supernatan dibuang dan pelet dikeringkan. Selanjutnya pelet dilarutkan ke dalam buffer TE (Tris-HCl ph 8 10 mm, EDTA 1 mm).

99 Fungsi Zat-zat EDTA adalah sebagai perusak sel dengan cara mengikat magnesium. Ion ini berfungsi untuk mempertahankan integritas sel maupun mempertahankan aktivitas enzim nuklease yang merusak asam nukleat. Buffer TE Tris-HCl menjaga ph larutan sehingga DNA tetap terjaga pada ph nya. SDS yang merupakan sejenis deterjen dapat digunakan untuk merusak membran sel atau DNA (DNA double strain menjadi single strain). NaOH untuk mendenaturasi DNA genomik (kromosomal) dan mulai menghidrolisis RNA. Sehingga DNA kromosomal akan kehilangan bentuknya setelah terdenaturasi dan yang dapat diperoleh setelah proses ini kemungkinan besar adalah DNA plasmid.

100 Sambungan... PCI (Phenol-Chloroform-Isoamyl Alcohol) dengan tujuan untuk memisahkan antara DNA dan komponen lainnya dimana Phenol-Chloroform berfungsi sebagai pelarut dari senyawa organik dan komponen lipid. RNase dapat diberikan untuk menghilangkan sisa-sisa fragmen RNA. natrium acetat untuk menciptakan kondisi netral dan alcohol untuk mengikat air yang sebelumnya terikat pada DNA sehingga DNA mengendap dengan sentrifugasi. phenol (mengikat protein dan sebagian kecil RNA) dan chloroform (membersihkan protein dan polisakarida dari larutan). Etanol berfungsi untuk memekatkan, memisahkan DNA dari larutan dan mengendapkan DNA (Muladno, 2002).

101 Analisis Kemurnian DNA dan Kuantifikasi DNA dengan Spektrofotometer Suspensi DNA plasmid diencerkan dengan mengambil 1 ul dalam 99 ul H2O atau TE. Suspensi DNA yang telah diencerkan dibaca absorbansinya pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 nm dikonversikan ke dalam konsentrasi, yaitu 1 OD260 = 50 ug DNA utas ganda tiap ml. Untuk mengetahui kemurnian DNA terhadap kontaminan protein, nilai absorbansi 260 nm dibandingkan dengan nilai absorbansi 280 nm.

102 Analisis Kualitatif dan Kuantifikasi DNA dengan Elektroforesis Gel Agarosa Gel agarose 1% dibuat dengan mensuspensikan agarose ke dalam buffer TAE 1x (Tris-HCl ph 8,3 40 mm, asam asetat pekat 1,98 mm, EDTA 1 mm) atau TBE 1x (Tris-HCl 100 mm, asam borat 83 mm, EDTA 1 mm), dipanaskan hingga jernih dengan microwave. Setelah suhu tidak terlalu panas (60 C), gel dicetak dengan menggunakan gel tray (cetakan gel) dan dipasang sisir untuk membuat sumuran, lalu dibiarkan beku. Sisir dilepas kemudian gel dipindah ke dalam electrophoresis chamber. Sebanyak 1-2 ul DNA dicampur dengan larutan pewarna (loading dye; bromofenol biru 0,25%, xylene cyanol FF 0,25%, sukrosa 40%). Kemudian sampel DNA tersebut serta penanda kuantitas (marker, λ yang dipotong dengan enzim HindIII) diaplikasikan pada gel agarosa. DNA dimigrasikan kemudian setelah selesai migrasi, direndam dengan larutan etidium bromide, dan dilihat di atas UV setelah dicuci dengan H2O. Jumlah DNA dianalisis dengan membandingkan antara pendaran pita DNA plasmid yang dianalisis dengan pendaran pita DNA penanda kuantitas 10, 20 dan 50 ng. Bentuk DNA plasmid ditentukan dengan melihat jumlah pita di dalam gel.

103 OLEH : Elena Mayanti Nduru Pendidikan Biologi A 2013 PRORAM STUDI MAGISTER PENDIDIKAN BIOLOGI SEKOLAH PASCASARJANA UNIVERSITAS NEGERI MEDAN T.P. 2013/2014

104 Plasmid adalah molekul DNA utas ganda sirkuler (tidak berujung) yang berukuran kecil yang terdapat di dalam sitoplasma dan dapat melakukan replikasi secara autonom (Suharsono dan Widyastuti, 2006) Plasmid banyak sekali digunakan dalam kloning gen karena relatif mudah dalam penanganannya. Untuk itu, DNA plasmid harus diisolasi.

105 1. Satu koloni bakteri E. coli yang mengandung plasmid ditumbuhkan dalam 10 ml media LB semalaman pada suhu 37 C 2. sebanyak 1,5 ml kultur dipindahkan ke dalam tabung 1,5 ml 3. Diendapkan dengan sentrifugasi rpm (Tomy MRX-150) 4 C selama 10 menit. 4. Endapan bakteri disuspensikan ke dalam 100 l buffer suspensi sel (Tris HCl ph EDTA), di-vortex

106 Media LB : Luria-Bertani media : media pertumbuhan bakteri yang terdiri dari ekstrak ragi, tryptone/pepton, dan NaCl Tris HCl : Thrometamine HCl : buffer penjaga ph, melindungi isi sel agar tidak lisis EDTA : Ethylenediamine tetraacetic acid : Menginaktivasi enzim DNAse yang dapat mendenaturasi DNA yang diisolasi

107 5. Ditambah 200 l buffer lisis (0.2M NaOH, 1% SDS) 6. Suspensi dihomogenkan dengan membolakbalikkan tabung sebanyak 6-8 kali 7. Didiamkan selama 3 menit 8. Ditambahkan Buffer netralisasi (1,32M Naasetat ph 4,8) sebanyak 300 l. 9. Tabung dibolak-balik agar suspensi menjadi homogen 10. Disentrifugasi rpm 4 C selama 10 menit

108 NaOH : Natrium Hidroksida : larutan basa berfungsi untuk denaturasi protein atau DNA (DNA double strain menjadi single strain). SDS : Sodium Dodesil Sulphate) : merupakan deterjen yang berperan untuk melisis dinding atau membran sel yang terdiri dari lipid (fosfolipid). Na-Asetat : Sodium asetat : Untuk menetralkan / menjaga ph

109 11. Supernatan ditransfer ke tabung yang baru 12. Diekstraksi dengan PCI (fenol-kloroformisoamil alkohol) 13. Fase air (supernatan) yang mengandung DNA di tambah RNase dan diinkubasi pada 37 C semalaman 14. DNA diendapkan dan ditambahkan Na-asetat ph 5,2 dan etanol absolut 15. Diinkubasi pada 30 C selama 2 jam 16. Disentrifugasi rpm 4 C selama 10 m

110 PCI : fenol-kloroform-isoamil alkohol : pelarut organik untuk memisahkan antara DNA dan komponen lainnya Rnase : enzim yang memisahkan antara DNA dan RNA, melisis RNA Na-Asetat : Sodium Asetat : Untuk menetralkan ph Etanol : mengikat air yang sebelumnya terikat pada DNA sehingga DNA mengendap dengan sentrifugasi.

111 17. Pelet dibilas dengan etanol 70% 18. Disentrifugasi kembali rpm selama 10 menit pada 4 C 19. Supernatan dibuang dan pelet dikeringkan. 20. Pelet dilarutkan ke dalam TE (Tris-HCl ph 8 10mM, EDTA 1 mm).

112 Etanol 70% : Untuk mendapatkan pelet yang murni TE : Tris HCl-EDTA : Menjaga Struktur DNA tetap seimbang, menetralisir DNA agar tidak rusak

113 1. Suspensi DNA plasmid diencerkan dengan mengambil 1 l dalam 99 l H2O atau TE 2. Dibaca absorbansinya pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm 3. Nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 nm dikonversikan ke dalam konsentrasi, yaitu 1 OD260 = 50 g DNA utas ganda tiap ml. 4. Untuk mengetahui kemurnian DNA terhadap kontaminan protein, nilai absorbansi 260 nm dibandingkan dengan nilai absorbansi 280 nm.

114 H2O : Air : Untuk mengencerkan suspensi DNA plasmid TE : Tris HCl-EDTA : Untuk mengencerkan suspensi Dna plasmid

115 Gel agarose 1% dipanaskan hingga jernih dengan microwave. Pada suhu 60 C, gel dicetak dengan menggunakan gel tray (cetakan gel) dan dipasang sisir untuk membuat sumuran, lalu dibiarkan beku. Sisir dilepas kemudian gel dipindah ke dalam electrophoresis chamber. Sebanyak 1-2 l DNA dicampur dengan larutan pewarna (loading dye; bromofenol biru 0,25%, xylene cyanol FF 0,25%, sukrosa 40%).

116 sampel DNA beserta penanda kuantitas (marker, λ yang dipotong dengan enzim HindIII) diaplikasikan pada gel agarosa. DNA dimigrasikan, lalu direndam dengan larutan etidium bromide Dilihat di atas UV setelah dicuci dengan H2O. Jumlah DNA dianalisis dengan membandingkan antara pendaran pita DNA plasmid yang dianalisis dengan pendaran pita DNA penanda kuantitas 10, 20 dan 50 mg. Bentuk DNA plasmid ditentukan dengan melihat jumlah pita di dalam gel.

117 20 l larutan dh2o+larutan penyangga+dna plasmid,+enzim restriksi dimasukkan ke dalam tabung eppendorf 500 l Larutan diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37 C Dielektroforesis untuk mengecek apakah enzim telah memotong DNA Bila telah terpotong, DNA dipanaskan pada suhu C. Dielektroforesis kembali untuk menentukan ukuran plasmid dan fragmen-fragmennya.

118 Anam, K Isolasi dan Pemetaan DNA Plasmid. Laporan Praktikum Rekayasa Genetika, IPB Brown, T.A Pengantar Kloning Gen (terjemahan). Yayasan Essentia Medica Suharsono dan Widyastuti Penuntun Praktikum Pelatihan Teknik Pengklonan Gen. Pusat Penelitian Sumber Daya Hayati dan Bioteknologi IPB

119 PLASMID DNA ISOLATION Compiled by : SUKMAWATI SUNDARI SIREGAR Pendidikan Biologi-A Program Pascasarjana Universitas Negeri Medan

120 AIMS: OUTLINE To isolate DNA PLASMID from Bacteria METHOD: This is the classical method of isolating plasmid dna, using small resin filters that nest within a microcentrifuge tube, are also as kits from suppliers of materials for molecular biology. TIMING: It takes about 60 minutes, including a period of 30 minutes when the materials are being chilled.

121 PLASMID A plasmid is a small DNA molecule that is physically separate from, and can replicate independently of, chromosal DNA within a cell. Most commonly found as small circular, double-stranded DNA molecules in bacteria, plasmids are sometimes present in archae and eukaryotic organisms. They are genetically modified and are used in the recombinant DNA technology..they are able of carrying 20 genes at a time Source:

122 APPARATUS AND MATERIAL A. APPARATUS 1) Beaker Glass 2) Vortex Mixer 3) Microcentrifuge tube pellet

123 APPARATUS FUNCTIONS Beaker Glass are normally used in holding liquids and work with them during chemical analysis. Generally, beakers are calibrated to allow the user to measure the liquid that is to be used. The type of glass that is normally used in making beakers can also be heated and cooled without breaking. Vortex Mixers are used in bioscience laboratories to mix two different chemicals for a desired effect or to dilute an acid or alkali by mixing them with water. Centrifuge tubes are conical tubes of various sizes made of plastic or glass material. They are mainly used in micro-centrifuges in molecular biology laboratories and vary in capacity.

124 APPARATUS AND MATERIAL A. APPARATUS 4) 8 tips of Micropipette 5) 1,5 cm 3 Micropipette

125 APPARATUS AND MATERIAL A. APPARATUS 5) 1,5 cm 3 Micropipette 7)Centrifuge

126 APPARATUS FUNCTIONS Micropipette tips are used to measure and transfer small volumes of liquids. Centrifuges are often used to separate suspensions in liquids. Because of their high rotation rates, centrifuges are delicate and can break easily. Hair drier is for drying the eppendorf tube

127 APPARATUS AND MATERIAL A. MATERIALS 1 cm 3 liquid culture of E.coli containing plasmid DNA, grown overnight at 37 0 C. It is best to use a plasmid with a high copy number. Antibiotics is need in the medium to mantain the plasmid crushed ice, in an expanded polystyrene cup, as an incubation container Lysis Solution I (Resuspension solution): 100 µl Glucose/EDTA/Tris (Get) Buffer Glucose maintains the osmotic pressure and prevents lysis of the cells EDTA weakens the cell membrane and bind Mg 2+ ions that are needed by Dnases, protecting the DNA from breakdown Tris buffers the solution at ph 8

128 APPARATUS AND MATERIAL A. MATERIALS Lysis Solution II (lysis solution): 200µl SDS/Sodium Hydroxide (SDS/NaOH) : SDS dissolves the cell membrane lipids and degrades the celluler proteins but not plasmid DNA NaOH splits the double stranded DNA into single strands. Lysis Solution III (Neutralizing solution) 150µl Potassium acetate/ Ethanoic acid (KOAc) Ethanoic acid neutralises the solution, enabling the DNA to renature Potassium acetate precipitates SDS, proteins, lipid, and large DNA molecules

129 TECHIC : HOW TO GET THE PLASMID DNA Isolation Cutting The DNA Combining the DNA Inserting the DNA recombinant into a living cells Process of getting the plasmid as a vector shown on video: DNA cloning.mp4.mp4

130 PROCEDURE 1. Spin down 1 cm 3 of bacterial culture in a 1.5 cm 3 microcentrifuge tube for 1 minute or until a mass of cells some 2-3 mm in diameter is visible

131 PROCEDURE 2. Decant the supernatant (liquid) into disinfectant in a waste container The substantion result of centrigutaion are pellet and supernatant 3. Ensure that all liquid is removed, using a micropipette to draw off any thatremains in a tube

132 PROCEDURE 4. Add 100µl of GET bufffer to the tube, resuspended the cells by closing the tube, then flicking the side repeatedly with a finger.

133 PROCEDURE SDS is an ionic detergent which dissolves the phospolipids and proteins of the cell membrane. This lyses the cells, releasing the DNA. The sodium hydroxide splitts both the plasmid and chromosomal DNA into singlestrained molecules, but each denaturated plasmid remains stuck as two interwined rings

134 PROCEDURE

135 PROCEDURE 8. Very carefully transfer 400µl of the supernatant (liquid) to a clean microcentrifuge tube. Ensure that none of the cell debris is carried over. The supernatant contains the plasmid DNA. 9. Add 400µl of ice cold ethanol. Mix gently.

136 PROCEDURE

137 PROCEDURE 11. Decant the supernatant into a waste container; taking care not to discard the pellet of plasmid DNA 12. With a micropipette, remove the last drops of liquid. If convenient, leave the uncapped tube to stand at room temperature for 15 minutes or use a hair drier so that all the alcohol evaporates. 13. Dissolve the pellet in 15µl of TE buffer; vigorous mixing is need to ensure that this happens. Store the plasmid solution in a freezer or run it on e gel

138

139 DIFFERENCES Isolation of plasmids can be done manually or using KIT is available from a variety of biotechnology companies (eg Thermo Scientific, Invitrogen, Qiagen, Macherey- Nagel, Integrated DNA Technology). Actually both of them use the same principle, namely it will lysis the chromosomal DNA under alkaline conditions (Alkaline Lysis), but using KIT more efficient of time and is usually more pure on plasmid obtained, but the manual method and is much more economical.

140 VIDEO OF DNA PLASMID ISOLATION PROCESS 1. PLASMID DNA ISOLATION PROCESS BY USING KIT Plasmid DNA Extraction (Miniprep).mp4 2. PLASMID DNA ISOLATION USING VORTEX AND VIAL Plasmid isolation protocol.mp4

141 REFERENCES Bloom mark, et.al. Laboratory DNA Science: An introduction to recombinant DNA techniques and methods of genome analysis, (Online), ( accessed on January 2014). Rifa i Muhammad Buku Ajar Genetika MAB4261:Genetika Rekombinasi dan Populasi,(Online), ( accessed on January 2014) 02.pdf, accessed on January 2014

142 THANK YOU

143 ISOLATION OF PLASMID DNA Compiled by : Raja Novi Ariska ( ) BIOLOGY EDUCATION POST GRADUATED PROGRAM STATE UNIVERSITY OF MEDAN 2013

144 Plasmid Plasmid is a double stranded, circular extra chromosomal DNA of bacterium. Used in recombinant DNA experiments to clone genes from other organisms and make large quantities of their DNA. Schematic drawing of a bacterium with its plasmids. (1) Chromosomal DNA. (2) Plasmids

145 Types of Bacterial Plasmids Based on their function, there are five main classes: 1. Fertility-(F)plasmids: they are capable of conjugation or mating. 2. Resistance-(R) plasmids: containing antibiotic or drug resistant gene(s). Also known as R-factors, before the nature of plasmids was understood. 3. Col-plasmids: contain genes that code for colicines, proteins that can kill other bacteria. 4. Degrative plasmids: enable digestion of unusual substances, e.g., toluene or salicylic acid. 5. Virulence plasmids: turn the bacterium into a pathogen.

146 How to Isolate Plasmid DNA?? Alkaline Lysis a method used in molecular biology to isolate plasmid DNA or other cell components such as proteins by breaking the cells open. Bacteria lyse with an alkaline lysis buffer consisting of a detergent sodium dodecyl sulfate (SDS) and a strong base sodium hydroxide. The detergent cleaves the phospholipid bilayer of membrane and the alkali denatures the proteins which are involved in maintaining the structure of the cell membrane. Steps involving agitation, precipitation, centrifugation, and the removal of supernatant, cellular debris is removed and the plasmid is isolated and purified.

147 Requirements for Plasmid Isolation a. Tools Micro centrifuge. Water bath (37 C). Automatic micropipettes with tips % isopropanol Ice. b. Media 2 ml Rich medium LB (Luria-Bertani) containing antibiotic w/ a single colony of transformed bacteria incubate overnight at 37 C. c. Buffers and Solutions: Alkaline lysis solution I. Alkaline lysis solution II. Alkaline lysis solution III. Antibiotic for plasmid selection. Ethanol. Phenol: chloroform (1:1, v/v). STE. TE (ph 8.0) containing 20 μg/ml RNAse A.

148 Alkaline Lysis Solution Alkaline Lysis Solution I : 50 mm glucose. 25 mm Tris-Cl (ph 8.0). 10 mm EDTA (ph 8.0). Prepare Solution I from standard stocks in batches of approx. 100 ml, sterilize by autoclaving and store at 4 C. (For plasmid preparation.) Alkaline Lysis Solution II: 0.2 N NaOH (freshly diluted from a 10 N stock). 1% (w/v) SDS. Prepare Solution II fresh and use at room temperature. (For plasmid preparation.)

149 Alkaline Lysis Solution III: 5 M potassium acetate, 60.0 ml. Glacial acetic acid, 11.5 ml. H2O, 28.5 ml. The resulting solution is 3 M with respect to potassium and 5 M with respect to acetate. Store the solution at 4 C and transfer it to an ice bucket just before use. (For plasmid preparation.) LB Media: Deionized H 2 O, to 950 ml. Tryptone, 10 g. Yeast extract, 5 g. NaCl, 10 g. To prepare LB (Luria- Bertani) medium, shake the ingredients with Distilled water until the solutes have dissolved. Adjust ph to 7.0 with 5 N NaOH and make up the final volume of the solution to 1 liter with deionized H2O. Then sterilize it for 20 minutes by autoclaving at 15 psi.

150 Procedures 1. Inoculate 2 ml of rich medium (LB, YT, or Terrific Broth) containing the appropriate antibiotic with a single colony of transformed bacteria. Incubate the culture overnight at 37 C with vigorous shaking. 2. Pour 1.5 ml of the culture into a microfuge tube (eppendorf). Centrifuge at maximum speed ( rpm) for 30 seconds at 4 C in a microfuge. Store the unused portion of the original culture at 4 C. 3. Remove the medium by aspiration, leaving the bacterial pellet as dry as possible. 1.5 ml culture

151 4. Resuspend the bacterial pellet in 100 μl of ice-cold Alkaline lysis solution I (Glucose, Tris-Cl (buffering,( agent EDTA (metal,( chelator RNAse A) by vigorous vortexing.

152 Function of chemical substances Rich medium LB : as a medium culture for the bacteria Glucose : maintain the osmotic pressure and prevent lysis of the cell. Tris-Cl : buffers the solution at ph 8 EDTA : weakens the cell membrane and chelates Mg2+ ions that are needed by a DNAses, protecting the DNA from breakdown RNAse A : degrades RNA

153 SDS Dissolves membranes Binds to and denatures proteins NaOH Denatures DNA Because plasmids are supercoiled, both DNA strands remain entangled after denaturation 5. Add 200 μl of freshly prepared Alkaline lysis solution II (NaOH, SDS) to each bacterial suspension. Close the tube tightly, and mix the contents well by inverting the tube. Do not vortex. Store the tube in ice.

154 Function of chemical substances NaOH The NaOH splits the double- stranded DNA into single strands SDS The SDS dissolves the cell membrane lipids and degrades the cellular proteins.

155 6. Add 150 μl of ice-cold Alkaline lysis solution III (Potassium acetate, Glacial acetic acid, H2O). Close the tube and disperse Alkaline lysis solution III through the viscous bacterial lysate by inverting the tube several times. Store the tube in ice for 3-5 minutes. 1. Potassium acetate / acetic acid solution Neutralizes NaOH (renatures plasmid ( DNA Converts soluble SDS to insoluble PDS sodium dodecyl sulfate potassium dodecyl sulfate (H 2 O sol. = 10%) ( 0.02% < sol. (H 2 O

156 Function of chemical substances Potassium acetate The potassium acetate precipitates SDS, proteins,lipids and large DNA molecules. Acetic acid Neutralises the solution,enabling the DNA to renature. Ethanol ; organic solvent, precipitates DNA

157 7. Centrifuge the bacterial lysate for 5 minutes at maximum speed at 4 C in a microfuge. Collect the supernatant to a fresh tube. Separate plasmid DNA from contaminants by centrifugation Supernatant contains: - Plasmid DNA - Soluble cellular constituents Pellet contains: - PDS - Lipids - Proteins - Chromosomal DNA

158 8. Precipitate nucleic acids from the supernatant by adding 2 volumes of ethanol at room temperature. Mix the solution by vortexing and then allow the mixture to stand for 2 minutes at room temperature.

159 Collect the precipitated nucleic acids by centrifugation at maximum speed for 5 minutes at 4 C in a microfuge. Discard the supernatant by aspiration. Add 1 ml of 70% ethanol to the pellet and invert the closed tube several times. Recover the DNA by centrifugation at maximum speed for 2 minutes at 4 C in a microfuge.

160 Remove all of the supernatant by aspiration. Remove any beads of ethanol from the tube. Store the open tube at room temperature until the ethanol has evaporated and no fluid is visible in the tube (5-10 minutes). Dissolve the nucleic acids in 50 μl of TE (ph 8.0) containing 20 μg/ml DNasefree RNase A (pancreatic RNase). Vortex the solution gently for a few seconds and store the DNA at -20 C.

161 Quantifying Plasmid DNA Quantify DNA using UV absorbance DNA UV absorbance peaks at 260 nm protein UV absorbance peaks at 230 nm (peptide bond) and 280 nm (aromatic amino acids) The ratio of the absorbance at 260 nm/280 nm is a measure of the purity of a DNA sample; it should be between 1.65 and 1.85.

162 DNA Electrophoresis The process using electro-field to separate macromolecules in a gel matrix is called electrophoresis. DNA, RNA and proteins carry negative charges, and migrate into gel matrix under electro-fields. The rate of migration for small linear fragments is directly proportional to the voltage applied at low voltages. At low voltage, the migration rate of small linear DNA fragments is a function of their length. At higher voltages, larger fragments (over 20kb) migrate at continually increasing yet different rates. Large linear fragments migrate at a certain fixed rate regardless of length. In all cases, molecular weight markers are very useful to monitor the DNA migration during electrophoresis.

163 Conformations of Plasmid DNAs Plasmid DNA may appear in the following five conformations: 1) "Supercoiled" (or "Covalently Closed-Circular") DNA is fully intact with both strands uncut. 2) "Relaxed Circular" DNA is fully intact, but "relaxed" (supercoils removed). 3) "Supercoiled Denatured" DNA. small quantities occur following excessive alkaline lysis; both strands are uncut but are not correctly paired, resulting in a compacted plasmid form. SC Super Coiled Relaxed region 4) "Nicked Open-Circular" DNA has one strand cut. 5) "Linearized" DNA has both strands cut at only one site. Nicked DNAs Linear DNA

164 Conformation of Plasmid DNAs The relative electrophoretic mobility (speed) of these DNA conformations in a gel is as follows: Nicked Open Circular (slowest) Linear Relaxed Circular Supercoiled Denatured Supercoiled (fastest)