IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

Transkripsi

1 IV. HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Uji Aktivitas Selulolitik Uji aktivitas selulolitik secara kualitatif Aktivitas selulolitik beberapa isolat A. niger dan Trichoderma diuji pada media agar CMC. Adanya aktivitas selulolitik ditandai dengan terbentuknya zona bening disekeliling koloni cendawan (Gambar 6). Pewarna Congo Red berinteraksi secara kuat dengan polisakarida yang mengandung ikatan β-(1,4) dan β-(1,3) glikosidik membentuk kompleks warna-glukan (Teather & Wood 1982). Zona bening yang terbentuk mengindikasikan tidak adanya kompleks warnaglukan akibat terjadinya hidrolisis ikatan glikosidik CMC. Sedangkan daerah yang masih berwarna merah mengindikasikan masih adanya kompleks warna-glukan yang mengindikasikan tidak terjadi hidrolisis substrat CMC. Rata-rata nisbah selulolitik terbesar ditunjukkan oleh isolat A. niger KB12 sebesar 0.47 dan terkecil ditunjukkan oleh isolat Trichoderma IPB12 sebesar 0.02 (Tabel 3). Besarnya nisbah selulolitik ini seringkali tidak berkorelasi dengan besarnya aktivitas selulase. Hal ini kemungkinan disebabkan adanya variasi kecepatan pertumbuhan cendawan. a b Gambar 6 Aktivitas selulolitik yang ditunjukkan dengan terbentuknya zona bening disekeliling koloni setelah inkubasi 24 jam pada suhu ruang. (a) A. niger, (b) Trichoderma.

2 Tabel 3 Nisbah selulolitik A. niger dan Trichoderma setelah 24 jam inkubasi pada suhu ruang Rata-rata diameter Rata-rata diameter Rata-rata Isolat koloni (cm) zona bening (cm) nisbah selulolitik Aspergillus niger IPB ±0,011 A. niger IPB ±0,078 A. niger IPB ±0,019 A. niger KB ±0,056 A. niger TSR ±0,042 A. niger TSR ±0,076 A. niger TSR ±0,033 Trichoderma reesei ±0,001 Trichoderma IPB ±0,001 Trichoderma IPB ±0,028 Trichoderma IPB ±0,007 Trichoderma IPB ±0, Uji aktivitas enzim endoglukanase secara kuantitatif Rata-rata aktivitas spesifik tertinggi ditunjukkan oleh isolat A. niger IPB1 sebesar 5.74 U/mg dan terkecil ditunjukkan oleh isolat Trichoderma IPB2 sebesar 1.31 U/mg (Tabel 4). Beberapa isolat A. niger dan Trichoderma, seperti A. niger IPB1, A. niger TSR52, A. niger IPB5, A niger KB12, A. niger TSR12, A. niger TSR13 menunjukkan aktivitas yang lebih tinggi dibandingkan isolat T. reesei yang merupakan standar aktivitas enzim selulase. Elshafei et al. (1990) melaporkan bahwa aktivitas enzim endoglukanase A. terreus lebih tinggi dibandingkan Trichoderma viride yang merupakan standar aktivitas enzim selulase, sedangkan Pothiraj et al. (2006) melaporkan aktivitas enzim endoglukanase A. niger lebih tinggi dibandingkan A. terraus. Namun demikian pembandingan secara langsung hasil ini sulit dilakukan karena banyaknya faktor yang mempengaruhi, seperti komposisi media dan pemilihan substrat yang dapat mempengaruhi aktivitas enzim (Sharma et al. 1986). Banyak faktor terlibat dalam kinerja suatu enzim, seperti suhu dan ph. Pada penelitian ini digunakan metode yang umum digunakan untuk sistem enzim selulase T. reesei (Ghose 1987) sehinggga tidak menutup kemungkinan aktivitas beberapa isolat A. niger pada uji ini belum mencapai aktivitas optimalnya. Beberapa laporan menunjukkan aktivitas enzim endoglukanase A. niger mempunyai kisaran suhu dan ph yang luas. Suhu optimum aktivitas endoglukanase A. niger dilaporkan berkisar 40 o C (Coral et al. 2002) dan 70 o C

3 (Hong et al. 2001). ph optimum aktivitas enzim endoglukanase A. niger dilaporkan berkisar 4.5 dan 7.5 (Coral et al. 2002), antara 6.0 dan 7.0 (Akiba et al. 1995), dan 6.0 (Hong et al. 2001). Tabel 4 Aktivitas enzim endoglukanase A. niger dan Trichoderma pada suhu 50 o C yang diukur setelah 7 hari inkubasi Nama isolat Rata- rata biomassa (mg) Rata-rata aktivitas spesifik (U/mg) A. niger IPB ±0.58 A. niger TSR ±0.67 A. niger IPB ±0.24 A. niger KB ±1.01 A. niger TSR ±0.46 Trichoderma IPB ±0.54 A. niger TSR ±0.42 Trichoderma reseei ±0.26 A. niger IPB ±0.38 Trichoderma IPB ±0.59 Trichoderma IPB ±0.94 Trichoderma IPB ± Isolasi Gen egla A. niger IPB Isolasi RNA total Isolasi RNA total dilakukan pada isolat yang mempunyai aktivitas spesifik tertinggi, yaitu isolat A. niger IPB1. RNA total berhasil diisolasi dari miselium A. niger IPB1 yang ditumbuhkan dalam medium induksi CMC. Kuantitas RNA total yang dihasilkan berdasarkan pengukuran dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 260 nm adalah µg tiap gram miselium. Selanjutnya berdasarkan nilai rasio OD 260 /OD 280, yaitu sebesar 1.72, maka RNA total yang dihasilkan mempunyai kemurnian yang cukup tinggi (Tabel 5). Manchester (1996) menyatakan bahwa kemurnian RNA yang tinggi ditunjukkan dengan nilai rasio OD 260 /OD 280 antara 1.8 dan 2.0. Hasil elektroforesis menunjukkan RNA total hasil isolasi mempunyai integritas yang cukup tinggi. Hal ini ditunjukkan dengan adanya dua pita yang dominan, yaitu RNA ribosomal (rrna) 28S dan 18S (Gambar 7).

4 Tabel 5 Hasil isolasi RNA total Absorban Bahan λ 260 / λ 280 Total RNA λ 260 λ 280 (µg/ g miselium) Miselium A. niger IPB rrna 28S rrna 18S Gambar 7 Hasil isolasi RNA total A. niger IPB1 yang diisolasi dari miselium setelah inkubasi 3 hari yang dideteksi dengan elektroforesis menggunakan gel agarosa 1% (b/v) Sintesis cdna total Sintesis cdna dilakukan menggunakan RNA total yang telah diisolasi sebagai cetakan melalui proses transkripsi balik. Proses ini menggunakan primer oligo(dt) sehingga hanya mrna yang akan disintesis menjadi cdna karena adanya ekor poli(a) pada ujung 3. Sebagai kontrol keberhasilan sintesis cdna, dilakukan amplifikasi terhadap gen aktin menggunakan primer spesifik (ActF dan ActR2). Hasil amplifikasi gen aktin dengan cdna sebagai cetakan menghasilkan satu pita DNA yang berukuran 123 bp (Gambar 8). Hasil ini menunjukkan bahwa sintesis cdna total telah berlangsung dengan baik. Selain itu, hasil ini juga menunjukkan RNA yang dihasilkan tidak terkontaminasi oleh DNA genom. Adanya kontaminasi oleh DNA akan ditunjukkan dengan adanya dua pita DNA yang dihasilkan, yaitu pita berukuran 123 bp yang menunjukkan hasil amplifikasi cdna dan pita berukuran 223 bp yang menunjukkan hasil amplifikasi DNA

5 genom. Pada DNA genom terdapat intron antara ekson1 dan ekson2 sehingga fragmen yang dihasilkan lebih besar bp 194 bp 118 bp 123 bp Gambar 8 Hasil amplifikasi gen aktin dengan PCR yang dideteksi dengan elektroforesis menggunakan gel agarosa 3% (b/v). Lajur 1. Penanda ΦX174RF DNA/HaeIII Fragments; 2. Gen aktin Isolasi gen egla Hasil sintesis cdna selanjutnya digunakan sebagai cetakan untuk mengisolasi gen egla. Isolasi gen egla dilakukan dengan amplifikasi menggunakan PCR dengan primer spesifik EAF dan EAR. Amplifikasi gen egla A. niger IPB1 menghasilkan pita sekitar 750 bp sesuai dengan hasil prediksi dari database (Gambar 9) bp 750bp 750 bp Gambar 9 Hasil amplifikasi egla dengan PCR yang dideteksi dengan elektroforesis menggunakan gel agarosa 1% (b/v). Lajur 1. Penanda 1 kb; 2. egla hasil PCR Pengklonan gen egla Gen egla hasil isolasi disisipkan dalam plasmid pgem-t Easy, ditengah gen lacz dengan bantuan enzim ligase. Hasil ligasi kemudian diintroduksikan ke dalam E. coli galur DH5α yang selanjutnya ditumbuhkan dalam media seleksi yang mengandung ampisilin, X-gal dan IPTG. Keberhasilan pengklonan gen egla dapat diketahui dengan terbentuknya koloni putih (Gambar 10).

6 Koloni E. coli galur DH5α yang dapat tumbuh pada media yang mengandung ampisilin adalah koloni yang mengandung plasmid pgem-t Easy. Plasmid ini mempunyai gen resistensi ampisilin yang mengekspresikan β- lactamase yang merusak cincin β-lactame sehingga bakteri yang mengandung plasmid ini dapat hidup dalam media yang mengandung ampisilin. Adanya gen egla yang menyisip ke dalam gen lacz dibuktikan dengan warna koloni yang putih. Gen lacz merupakan gen yang menyandi β-galaktosidase yang mengubah substrat X-gal yang tidak berwarna menjadi berwarna biru. Adanya penyisipan gen egla pada gen lacz mengakibatkan ekspresi gen lacz terganggu dan β- galaktosidase tidak diekspresikan, sehingga tidak ada perubahan warna pada substrat X-gal dan koloni yang dihasilkan berwarna putih. Koloni biru Koloni putih Gambar 10 Koloni E. coli hasil transformasi yang ditumbuhkan dalam media selektif yang mengandung ampisilin, X-gal dan IPTG. 1 ml bp 750 bp 750 bp Gambar 11 Hasil amplifikasi egla dengan PCR yang dideteksi dengan elektroforesis menggunakan gel agarosa 1% (b/v). Lajur 1. Penanda 1 kb; 2. egla hasil PCR Verifikasi pengklonan gen egla Untuk memastikan bahwa sisipan pada gen lacz adalah gen egla maka dilakukan verifikasi dengan menggunakan PCR-koloni menggunakan primer

7 spesifik egla maupun pemotongan DNA plasmid dengan enzim EcoRI. PCRkoloni pada koloni putih menghasilkan pita yang berukuran sekitar 750 bp yang sesuai dengan ukuran egla (Gambar 11). DNA plasmid dari koloni putih diisolasi dan selanjutnya di potong dengan menggunakan EcoRI. Enzim ini dipilih karena situs pemotongannya mengapit sisipan sehingga diharapkan pemotongan akan menghasilkan dua pita, yaitu DNA sisipan dan vektor pembawanya. Hasil pemotongan DNA plasmid menunjukkan adanya dua pita yang berukuran sekitar 3000 bp dan 750 bp (Gambar 12). Ukuran sekitar 3000 bp sesuai dengan ukuran pgem-t Easy, yaitu sebesar 3015 bp, sedangkan ukuran sekitar 750 bp sesuai dengan ukuran produk amplifikasi egla. Dari dua hasil verifikasi ini dapat dipastikan bahwa DNA yang menyisip dalam gen lacz plasmid pgem-t Easy adalah gen egla A. niger IPB bp vektor 1000 bp 750 bp sisipan Gambar 12 Hasil pemotongan DNA plasmid rekombinan dengan EcoRI yang dideteksi dengan elektroforesis menggunakan gel agarosa 1% (b/v). Lajur 1. Penanda 1 kb; 2. Plasmid rekombinan yang dipotong; 3. Plasmid rekombinan yang tidak dipotong 4.3 Pengurutan dan Karakterisasi Gen egla A. niger IPB Pengurutan gen egla dan deduksi asam aminonya Pengurutan gen egla A. niger IPB1 pada pgem-t Easy dilakukan menggunakan ABI Prism 3100 versi 3.7 dengan primer sp6 dan T7 (Lampiran 4). Dari hasil pengurutan diperoleh gen egla A. niger IPB1 sebesar 720 bp yang menyandi 239 asam amino (Gambar 13).

8 Sequence ID : EglA_niger Nuk AA atgaagctccccgtgacacttgctatgcttgcggccaccgccatgggccagacgatgtgc 60 M K L P V T L A M L A A T A M G Q T M C 20 tctcaatatgacagtgcctcgagccccccatattcagtgaaccagaacctctggggcgag 120 S Q Y D S A S S P P Y S V N Q N L W G E 40 taccaaggcaccggcagccagtgtgtatatgtcaacaaactctccagcagtggtgcatcc 180 Y Q G T G S Q C V Y V N K L S S S G A S 60 tggcacaccgaatggacctggagcggtggtgagggaacagtgaaaagctactctaactct 240 W H T E W T W S G G E G T V K S Y S N S 80 ggcgttacatttaacaagaagctcgtgagtgatgtatcaagcatccccacctcggtggaa 300 G V T F N K K L V S D V S S I P T S V E 100 tggaagcaggacaacaccaacgtcaacgccgatgtcgcgtatgatcttttcaccgcagcg 360 W K Q D N T N V N A D V A Y D L F T A A 120 aatgtggaccatgctacttctagcggtgactatgaactgatgatttggcttgcccgctac 420 N V D H A T S S G D Y E L M I W L A R Y 140 ggcaacatccagcccattggcaagcaaattgccacggccacagtgggaggcaagtcctgg 480 G N I Q P I G K Q I A T A T V G G K S W 160 gaggtgtggtatggcagcaccacccaggccggtgcggagcagaggacatacagcttcgtg 540 E V W Y G S T T Q A G A E Q R T Y S F V 180 tcggaaagccctatcaactcatacagtggggccatcaatgcatttttcagctatctcact 600 S E S P I N S Y S G A I N A F F S Y L T 200 cagaaccaaggctttcccgccagctctcagtacttgatcaatctgcagtttggaactgag 660 Q N Q G F P A S S Q Y L I N L Q F G T E 220 gcgttcaccgggggcccggcaaccttcacggttgacaactggaccgccagtgtcaactag 720 A F T G G P A T F T V D N W T A S V N Gambar 13 Urutan nukleotida egla A. niger IPB1 dan deduksi asam aminonya Analisis kesejajaran urutan nukleotida dan asam amino egla A. niger IPB1 dengan database di GenBank Analisis kesejajaran urutan nukleotida dan asam amino egla A. niger IPB1 dengan database di GenBank dilakukan menggunakan program BLAST (Basic Local Alignment Search Tool). Hasil penyejajaran nukleotida menunjukkan sekuen egla A. niger IPB1 mempunyai kemiripan 99% dengan sekuen 14 dari paten WO (E-value 3.7e-152 ), 98% dengan sekuen 1 dari paten WO (E-value 1.7e-151 ), WO (E-value 1.7e-151 ), US (Evalue 1.7e-151 ), US (E-value 1.7e-151 ), dan 97% dengan sekuen 13 dari paten WO (E-value 4.5e-149) dan egla Aspergillus niger CBS (E-value 1.1e-148) yang semuanya merupakan gen endoglukanase dari Aspergillus niger. Sementara itu hasil penyejajaran urutan asam amino menunjukkan urutan egla mempunyai kemiripan 99% dengan endoglukanase A atau egla dari Aspergillus niger A. niger (E-value 7.1e-127), 87% dengan endoglukanase A atau ceka dari Aspergillus kawachi (E-value 1.9e-126 ), 81% dengan endoglukanase A

9 dari Aspergillus terreus (E-value 6.9e-113) dan 75% dengan endoglukanase atau cela dari Aspergillus oryzae (E-value 4.8e-105) (Lampiran 5 dan 6). BLAST merupakan program pencari similaritas suatu urutan nukleotida atau asam amino dengan database yang berbasis local alignment, yaitu penyejajaran pada suatu segmen sekuen yang lebih pendek dengan derajat similaritas yang sangat tinggi. Similaritas mengindikasikan homologi suatu gen atau protein. Jika kedua urutan gen atau protein homolog maka dapat dikatakan bahwa keduanya mempunyai leluhur, fungsi dan struktur yang sama. Dua gen atau fragmen DNA dikatakan homolog jika 70% urutan nukleotidanya atau 25% urutan asam aminonya identik (panjang urutan minimal 100) (Claviere & Notredame 2003). Berdasarkan hal diatas maka dapat dipastikan bahwa egla merupakan gen egla dari Aspergillus niger. Gambar 14 Peta situs pemotongan egla dengan menggunakan program NEBcutter Analisis situs pemotongan gen egla Analisis situs pemotongan enzim restriksi endoglukanase digunakan untuk membuat peta situs pemotongan enzim restriksi (peta restriksi) pada suatu gen atau fragmen DNA. Peta restriksi ini bermanfaat dalam menentukan enzim-enzim restriksi apa saja yang dapat digunakan dalam kegiatan manipulasi suatu gen atau

10 fragmen DNA. Pada analisis peta pemotongan gen egla terlihat tidak terdapat situs pemotongan EcoRI yang digunakan untuk mengeluarkan DNA sisipan dari plasmid pgem-t Easy sebagai vektornya (Gambar 14). Hasil ini sekaligus dapat digunakan untuk verifikasi keberhasilan pengklonan gen egla pada plasmid pgem-t Easy. Selain itu terdapat beberapa situs pemotongan yang terdapat pada gen egla dan situs pengklonan (MCS) pgem-t Easy, seperti ApaI, NcoI, PstI dan NsiI, sehingga enzim-enzim ini tidak dapat digunakan untuk mengeluarkan DNA sisipan dari plasmid, karena akan memotong DNA sisipan juga (Gambar 14). A. niger (Glyco hydro 12: ) T. reesei (Glyco hydro 12: ) S. lividans (Glyco hydro 12: ; CBM 2 : ) B. licheniformis (Glyco hydro 12: ) Gambar 15 Perbandingan domain EglA dari berbagai organisme berdasarkan database pfam Analisis domain EglA Analisis domain EglA dilakukan menggunakan program Pfscan berdasarkan database Pfam. EglA memiliki katalitik domain yang termasuk dalam

11 kelompok Glikosida hidrolase famili 12 (GH12) pada posisi asam amino ke-82 sampai asam amino ke-239 (Gambar 15). Arsitektur EglA A. niger ini sama dengan arsitektur beberapa anggota famili GH12 lainnya, seperti Cel12A T. reesei dan Cel12A B. Licheniformis. Arsitektur jenis ini hanya mengandung katalitik domain dan tidak mengandung carbohydrate binding moduls (CBM). Secara umum, kelompok glikosida hidrolase terdiri dari dua domain utama, yaitu katalitik domain dan carbohydrate binding moduls (CBM) yang dihubungkan oleh suatu linker yang kaya akan prolin (Gambar 16). Posisi domain katalitik maupun domain CBM dapat terdapat pada C-terminal maupun N- terminal. Posisi ini tidak menentukan spesifisitas suatu enzim (Gilkes et al. 1991). Peran domain CBM pada enzim sampai saat ini masih belum jelas. Namun demikian Hashimoto (2006) menyatakan peran utama CBM meningkatkan efisiensi fungsi katalisis enzim-enzim karbohidrase walaupun dengan mekanisme yang belum jelas. CBM linker Catalytic domain Gambar 16 Domain umum selulase yang terdiri dari domain katalitik dan CBM yang dihubungkan oleh daerah penghubung (linker) GH12 merupakan salah satu famili glikosida hidrolase yang mempunyai aktivitas endoglukanase dan xyloglukan hidrolase. Mekanisme katalisisnya adalah retaining dengan Glutamat (Glu) sebagai basa nukleofil maupun donor protonnya. Sampai saat ini GH12 mempunyai sekitar 151 anggota dengan 7 arsitektur yang berbeda. Sebagian besar anggota mempunyai arsitektur tanpa domain CBM. Sementara itu arsitektur dengan kombinasi antara katalitik domain dan domain CBM, seperti pada Cel2B S. lividans hanya sedikit. Berdasarkan perbandingan struktur homolog dengan struktur endoglukanase lain yang sudah diketahui, residu-residu yang berperan dalam fungsi katalitik EglA A.niger IPB1 maupun pengikatan substratnya dapat dideduksikan (Gambar 17). Glu116 diprediksi berperan sebagai nukleofil dan Glu204 diprediksi berperan sebagai donor proton. Pada famili GH12, posisi

12 nukleofil ini berdekatan dengan dua residu yang sangat terkonservasi, yaitu Asp99 dan Met118 (Zechel et al. 1998; Sandgreen et al. 2003). Situs pengikatan glikosil diprediksikan tersusun atas beberapa residu dengan rantai samping aromatik, seperti Trp, Tyr dan Phe (Sandgreen et al. 2003). Mengacu pada beberapa residu yang terlibat dalam pengikatan substrat pada famili GH 12 (Goegedebuur et al 2002), residu Trp (posisi 22, 49, 51, 85, 120, 144), Tyr (61, 98, 115) dan Phe (163, 179) pada A. niger IPB1 diprediksi berperan dalam pengikatan substrat glikosil. A.niger B.licheniformis T.reesei S.lividans GQ-TMCSQYDSAS-SPPYSVNQNLWGEYQGTGS-QCVYVNKLSSSGASWHTEWTWSGGEG SS-SNPSDKLYFK-NKKYYIFNNVWGADQVSGWWQTIYHN--SDSDMGW--VWNWPSNTS AQ-TSCDQWATFT-GNGYTVSNNLWGASAGSGF-GCVTAVSL-SGGASWHADWQWSGGQN ADTTICEPFGTTTIQGRYVVQNNRWG---STAP-QCVTATDTGFRVTQADGSAPTNGAPK A.niger B.licheniformis T.reesei S.lividans TVKSYSN SGVTF-NKKLVSDVSSIPTSVEWKQDNTNVNADVAYDLFTA TVKAYPSIVSGWHWTEGYTAGSGF-PTRL-SDQKNINTKVSYSI-SANGTYNAAYDIWLH NVKSYQN SQIAIPQKRTVNSISSMPTTASWSYSGSNIRANVAYDLFTA SYPS---VFNGCHYTN---CSPGTDLPVRLDTVSAAPSSISYGFVDGAV-YNASYDIWLD A.niger B.licheniformis T.reesei S.lividans ANVDHAT--SSGDYELMIWLARYGNIQPIGKQIATATVGGKSWEVWYGSTTQAGAE-QRT -NTNKASWDSAPTDEIMIWLNNT-NAGPAGSYVETVSIGGHSWKVYKGYIDAGGGKGWNV ANPNHVT--YSGDYELMIWLGKYGDIGPIGSSQGTVNVGGQSWTLYYGYN----GA-MQV PTA-RT--DGVNQTEIMIWFNRVGPIQPIGSPVGTASVGGRTWEVWSGGN----GS-NDV A.niger B.licheniformis T.reesei S.lividans YSFVSESPINSYSGAINAFFSYLTQNQGFPASSQYLINLQFGTEAFTGGPATFTVDNWTA FSFIRTANTQSANLNIRDFTNYLADSKQWLSKTKYVSSVEFGTEVF-GGTGQINISNWDV YSFVAQTNTTNYSGDVKNFFNYLRDNKGYNAAGQYVLSYQFGTEPFTGS-GTLNVASWTA LSFVAPSAISGWSFDVMDFVRA-TVARGLAENDWYLTSVQAGFEPWQNG-AGLAVNSFSS Gambar 17 Kesejajaran urutan asam amino empat enzim GH 12. Posisi residu nukleofil dan donor proton ditunjukkan dengan tanda anak panah hitam dan putih secara berturut-turut Analisis hidrofobisitas EglA Analisis hidrofobisitas dilakukan untuk mengetahui profil hidrofobisitas dari suatu urutan asam amino. Analisis ini digunakan untuk untuk menentukan apakah suatu protein termasuk protein yang larut dalam air atau protein membran (Zhao & London 2006). Profil hidrofobisitas berdasarkan skala Kyte & Doolittle menunjukkan secara keseluruhan EglA mempunyai nilai hidrofobisitas yang

13 relatif negatif (hidrofilik) sehingga diprediksi kuat merupakan protein yang larut dalam air (Gambar 18). Selain itu terlihat adanya satu segmen transmembran pada N terminal (berdasarkan nilai kepercayaan yang direkomendasikan pada skala Kyte & Doolittle, yaitu 1.6). Adanya satu segmen transmembran pada daerah N- terminal mengindikasikan bahwa protein tersebut disekresikan (Clavarie & Notredame 2003). Hasil ini dikuatkan dengan analisis menggunakan TMHMM (Gambar 19) yang menyimpulkan bahwa EglA A. niger IPB1 merupakan protein di luar sel. Gambar 18 Profil hidrofobisitas menggunakan skala Kyte & Doolittle (Protscale)

14 Gambar 19 Prediksi segmen transmembran (TMHMM) Kekerabatan EglA A.niger IPB1 dengan endoglukanase anggota famili GH12 lainnya berdasarkan struktur asam aminonya. Analisis filogenetik dilakukan untuk menggambarkan hubungan kedekatan gen egla A. niger IPB1 dengan gen-gen endoglukanase famili GH 12 lainnya. Analisis ini dilakukan dengan membandingkan gen egla A. niger IPB1 dengan gen lainnya berdasarkan nilai kesamaan sekuennya. Analisis kesamaan EglA A.niger IPB1 berdasarkan urutan asam aminonya dilakukan terhadap beberapa endoglukanase dari anggota famili GH12. EglA A. niger IPB1 mempunyai kesamaan tertinggi, 99%, dengan endoglukanase A A. niger database. EglA juga menunjukkan kesamaan yang tinggi dengan endoglukanase kelompok Aspergillus lainnya, yaitu 63% dengan A.aculaetus dan 60% dengan A. kawachi. Sementara itu kesamaan egla A. niger IPB1 dengan kelompok bakteri dan archaea adalah kecil. A. niger IPB1 mempunyai kesamaan 18% dengan S.lividans dan 15% dengan P. furiosus. Kesamaan antar anggota famili GH12 ini merupakan hasil penyejajaran keseluruhan urutan gen GH12 yang meliputi daerah dengan similaritas tinggi dan daerah beragam. Hasil penyejajaran menunjukkan daerah yang mempunyai similaritas tinggi terletak pada domain katalitik sedangkan diluar domain katalitik sangat bervariasi (Lampiran 7).

15 Pohon filogenetik yang menggambarkan tingkat kekerabatan endoglukanase beberapa anggota famili GH12 dikonstruksi menggunakan program PHYLIP berdasarkan hasil multiple sequence alignment famili GH12 dengan program T-COFFEE yang mempunyai tingkat akurasi tinggi (Edgar & Badzoglou 2006). Secara garis besar, gen-gen endoglukanase terlihat mengelompok sesuai dengan taksonnya, yaitu bakteri, cendawan dan archaea (Gambar 20). Kelompok cendawan terbagi menjadi tiga subfamili, yaitu subfamili1 yang terdiri dari kelompok Ascomycetes (A. aculeatus, A. kawachi, A. niger, Fusarium equiseti, Bionectrica ochroleuca, T. viride, T. reesei), subfamili2 yang terdiri dari beberapa kelompok Ascomycetes (A. oryzae dan A. nidulans) dan Oomycetes (Phytophthora sojae dan Phytophthora ramomum), dan subfamili3 terdiri dari kelompok Basidiomycetes (Phanerochaete crhysosporium dan Polyporus arcularius). * Ascomycetes Fungi Ascomycetes & Oomycetes Basidiomycetes Bakteri Gambar 20 Pohon filogenetik beberapa endoglukanase anggota famili GH12 Archaea