Gambar 1. Skema penggolongan HIV-1 [Sumber: Korber dkk. 2001: ]

Transkripsi

1

2 75 Gambar 1. Skema penggolongan HIV-1 [Sumber: Korber dkk. 2001: ] Gambar 2. Struktur virus HIV-1 [Sumber: Henriksen 2003: 12.]

3 76 Keterangan: 5 LTR : daerah 5 Long Terminal Region gag : gen gag HIV-1 pol : gen pol HIV-1 vif : gen vif HIV-1 vpr : gen vpr HIV-1 vpu : gen vpu HIV-1 tat 1 : gen tat ekson 1 tat 2 : gen tat ekson 2 rev 1 : gen rev ekson 1 rev 2 : gen rev ekson 2 nef : gen nef RRE : Rev Responsive Element 3 LTR : daerah 3 Long Terminal Region Gambar 3. Struktur genom HIV-1[Sumber: Bohne dkk. 2005: 826.] Gambar 4. Siklus hidup HIV-1 [Sumber: Henriksen 2003: 14.]

4 77 Gambar 5. Pola pemotongan mrna primer dan regulasi ekspresi gen HIV-1 [Sumber: Bohne dkk. 2005: 826.] Gambar 6. Skema overlapping extension PCR [Sumber: Roche 2002: 4.]

5 78 Gambar 7. Skema plasmid pqe-80l [Sumber: QIAGEN 2003: 33.]

6 79 XmaI Ex1-TatpNL4 tccccccgggg 5821 gagcaagaaa a tggagccagt agatcctaga ctagagccct ggaagcatcc aggaagtcag 5881 cctaaaactg cttgtaccaa ttgctattgt aaaaagtgtt gctttcattg ccaagtttgt 5941 ttcatgacaa aagccttagg catctcctat ggcaggaaga agcggagaca gcgacgaaga 6001 gctcatcaga acagtcagac tcatcaagct tctctatcaa agcagtaagt agtacatgta ttcgaagagatagtt tc gtc Ex1-TatpNL4C atcaa agcag gggtggaggg Ex2-TatpNL gcagggatat tcaccattat cgtttcaga c ccacctcccaatcccga atcccga ggg gacccgacag 8401 gcccgaagga atagaagaag aaggtggaga gagagacaga gacagatcca ttcgattagt Ex2-TatpNL4C tgtct c tg tc taggtaagctaatccagctgccct SalI Keterangan: cccggg : situs restriksi XmaI gtcgac : situs restriksi SalI atcaaagcag : overlap region primer Ex2-TatpNL4 gggtggaggg :overlap region primer Ex1-TatpNL4C Gambar 8. Sekuen fragmen ekson 1 dan 2 gen tat HIV-1, posisi primer Ex1-TatpNL4, Ex1-TatpNL4C, Ex2-TatpNL4 & Ex2-TatpNL4C, dan posisi situs restriksi XmaI dan SalI pada peta plasmid pnl43 [Accession number M ] 79

7 80 pnl Sintesis fragmen gen tat HIV-1 Isolasi vektor pqe-80l pqe- PCR overlapping untuk mendapatkan fragmen gen tat HIV-1 Isolasi alkali lisis Purifikasi produk PCR Visualisasi pada gel agarosa Elektroforesis gel agarosa 0,8%, 100V, Digesti DNA vektor dan sisipan SalI XmaI SalI Spektrofotometri DNA sisipan XmaI Ligasi dengan T4 DNA ligase Transformasi heat shock Verifikasi plasmid rekombinan Isolasi koloni transforman Gambar 9. Skema cara kerja

8 81 PCR pertama Ex1-TatpNL4 Ex2-TatpNL Ex1-TatpNL4C Ex2-TatpNL4C PCR kedua Ex1-TatpNL4 Arah ekstensi primer Arah ekstensi primer Ex2-TatpNL4C Gambar 10. Skema PCR overlapping fragmen gen tat HIV-1. 81

9 82 M 1 2 K pb 800 pb 350 pb 200 pb 100 pb 236 pb 110 pb Gel agarosa 1,5%; 100 V; EtBr 0,5 μg/ml Keterangan: M : Marka 50 pb 1 : Produk PCR ekson 1 tat HIV-1 2 : Produk PCR ekson 2 tat HIV-1 K- : Kontrol negatif PCR Gambar 11. Hasil elektroforesis produk PCR standar fragmen gen tat HIV-1 ekson 1 dan 2.

10 83 M M pb 600 pb 326 pb 326 pb 300 pb (a) (a) Agarosa 1,5%; 100 V; EtBr 0,5 μg/ml Keterangan: (a) : Hasil optimasi suhu annealing M : Marka 100 pb 1 : Suhu annealing 64 C; 30 detik 2 : Suhu annealing 66 C; 30 detik 3 : Suhu annealing 68 C; 30 detik Gambar 12. Hasil elektroforesis optimasi kondisi annealing PCR overlapping fragmen ekson 1 dan 2 gen tat HIV-1 (b) (b) : Hasil optimasi kondisi annealing 4 : Annealing 64 C; 15 detik 5 : Annealing 64 C; 30 detik 6 : Annealing 64 C; 45 detik 7 : Annealing 64 C; 1 menit

11 84 M 1 K- M pb 1500 pb 2072 pb 1500 pb 600 pb 326 pb 300 pb 600 pb 326 pb 300 pb 100 pb 100 pb (a) (b) Agarosa 1,5%; 100 V; EtBr 0,5 μg/ml Keterangan: (a) : Hasil PCR overlapping fragmen gen tat HIV-1 (b) : Hasil purifikasi produk PCR overlapping M : Marka 100 pb 1 : produk PCR overlapping K : kontrol negatif PCR Gambar 13. Hasil elektroforesis PCR fragmen gen tat HIV-1

12 85 1 M 1 2 b 4700 pb 3000 pb a 1000 pb 316 pb 250 pb Gel agarosa 0,8%; 100 V; EtBr 0,5 μg/ml Keterangan: 1 : plasmid pqe-80l a : bentuk closed circular b : bentuk nicked circle Gambar 14. Pola migrasi vektor pqe-80l Hasil isolasi Gel agarosa 1,2%; 100 V; EtBr 0,5 μg/ml Keterangan: M : Marka 1 kb 1 : pqe-80l hasil digesti 2 : fragmen gen tat HIV-1 hasil digesti Gambar 15. Purifikasi hasil digesti DNA vektor dan sisipan

13 86 Keterangan: = E.coli TOP 10 pembawa plasmid rekombinan Gambar 16. Koloni Escherichia coli TOP10 setelah ditransformasi dengan vektor pembawa fragmen tat HIV-1

14 87 WT c b WT c b a Pola migrasi plasmid lebih tinggi Gel agarosa 0,8%; 100 V; EtBr 0,5 μg/ml Keterangan: a : bentuk closed circular atau supercoiled b : bentuk linear c : bentuk nicked circle WT : plasmid pqe-80l tanpa DNA sisipan Lajur : plasmid rekombinan no Gambar 17. Analisis perbandingan pola migrasi plasmid rekombinan dengan pqe-80l (wild type)

15 pb Fragmen gen tat HIV-1 BamHI XmaI SalI HindIII pqe80-l rekombinan Keterangan: Menunjukkan pita fragmen gen tat HIV-1 berukuran 316 pb pada hasil elektroforesis analisis digesti dan orientasi plasmid rekombinan Gambar 18. Skema pqe-80l rekombinan yang tepat [Sumber: QIAGEN 2003: 33.]

16 89 M WT M pb 3000 pb 316 pb 300 pb 1000 pb 250 pb Gel agarosa 1,5%; 100 V; EtBr 0,5 μg/ml M2 WT M pb 1000 pb 250 pb 316 pb 300 pb 100 pb Keterangan: M1 : Marka DNA 100 pb M2 : Marka DNA 1 kb WT : pqe-80l tanpa DNA sisipan 10 : plasmid rekombinan no : plasmid rekombinan no. 11 Gel poliakrilamid 8%; 100 V; EtBr 0,5 μg/ml 12 : plasmid rekombinan no : plasmid rekombinan no : plasmid rekombinan no. 15 Gambar 19. Visualisasi hasil analisis plasmid rekombinan melalui digesti SalI dan XmaI

17 90 M K1 K pb 1500 pb 600 pb 581 pb 300 pb 100 pb Gel agarosa 1,5%; 100 V; EtBr 0,5 μg/ml Keterangan: M : Marka DNA 100 pb 10 : plasmid rekombinan no. 10 K1 : Kontrol negatif PCR 12 : plasmid rekombinan no. 12 K2 : Kontrol negatif verifikasi 14 : plasmid rekombinan no : plasmid rekombinan no. 15 Gambar 20. Hasil verifikasi PCR terhadap plasmid rekombinan

18 91 Start codon pqe-80l 1 atg aga gga tcg cat cac cat cac cat cac gga tcc gca tgc gag 45 1 M R G S H H H H H H G S A C E 15 6x Histidin tag 46 ctc ggt acc ccg gga tgg agc cag tag atc cta gac tag agc cct L G T P G W S Q * I L D * S P 30 tat HIV-1 ccc ggg atg gag cca gta gat cct aga cta gag ccc P G M E P V D P R L E P 91 gga agc atc cag gaa gtc agc cta aaa ctg ctt gta cca att gct G S I Q E V S L K L L V P I A 45 tgg aag cat cca gga agt cag cct aaa act gct tgt acc aat tgc tat tgt aaa W K H P G S Q P K T A C T N C Y C K 136 att gta aaa agt gtt gct ttc att gcc aag ttt gtt tca tga caa I V K S V A F I A K F V S * Q 60 aag tgt tgc ttt cat tgc caa gtt tgt ttc atg aca aaa gcc tta K C C F H C Q V C F M T K A L 181 aag cct tag gca tct cct atg gca gga aga agc gga gac agc gac K P * A S P M A G R S G D S D 75 ggc atc tcc tat ggc agg aag aag cgg aga cag cga cga aga gct G I S Y G R K K R R Q R R R A 226 gaa gag ctc atc aga aca gtc aga ctc atc aag ctt ctc tat caa E E L I R T V R L I K L L Y Q 90 cat cag aac agt cag act cat caa gct tct cta tca aag cag ccc H Q N S Q T H Q A S L S K Q P 271 agc agc cca cct ccc aat ccc gag ggg acc cga cag gcc cga agg S S P P P N P E G T R Q A R R 105 acc tcc caa tcc cga ggg gac ccg aca ggc ccg aag gaa tag aag T S Q S R G D P T G P K E * K 316 aat aga aga aga agg tgg aga gag aga cag aga cag atc cat tcg N R R R R W R E R Q R Q I H S 120 aag aag gtg gag aga gag aca gag aca gat cca ttc gat tag gtc gac K K V E R E T E T D P F D * V D 361 att agg tcg acc tgc agc caa gct taa tta gct gag I R S T C S Q A * L A E Keterangan: A: Alanin F : Fenilalanin L : Leusin Q : Glutamin W : Triptofan C: Sistein G : Glisin M : Metionin R : Arginin Y : Tirosin D: As. aspartat H : Histidin N : ASparagin S : Serin * : Stop E: As. glutamat I : Isoleusin P : Prolin T : Treonin Gambar 21. Prediksi translasi asam amino fragmen gen tat HIV-1 yang diklona ke dalam plasmid pqe-80l.

19 TABEL

20 93 Tabel 1 Pasangan primer untuk sintesis fragmen gen tat HIV-1 full length dari cetakan pnl43 Ekson Forward (5 3 ) Reverse (5 3 ) Ekson 1 Ex1Tat-pNL4 TCCCCCCGGGATGGAGCCA GTAGATCCTAGA TAGAGAAGCTT Ekson 2 Ex2Tat-pNL4 ATCAAAGCAGCCCACCTCC CAATCCCGA Ex1Tat-pNL4C GGGAGGTGGGCTGCTTTGA Ex2Tat-pNL4C TCCCGTCGACCTAATCGAAT GGATCTGTCTCTGT Keterangan: : situs restriksi XmaI; : situs restriksi SalI : sekuen nukleotida yang overlap Tabel 2 Pengukuran konsentrasi DNA plasmid pqe-80l dan fragmen gen tat HIV-1 Sampel DNA Λ260 Λ280 PQE-80L hasil isolasi Fragmen gen tat HIV-1 hasil PCR Konsentrasi (ng/µl) 0,014 0, ,016 0, Tabel 3 Pengukuran konsentrasi DNA plasmid pqe-80l dan fragmen gen tat HIV-1 yang telah didigesti Sampel DNA Konsentrasi Λ260 Λ280 (ng/µl) pqe-80l 0,036 0, Fragmen gen tat HIV-1 0,030 0,

21 LAMPIRAN

22 95 Lampiran 1 Komposisi bahan kimia dan pembuatan larutan, buffer, dan medium yang digunakan dalam penelitian Larutan, buffer, dan medium Medium Luria Bertani (LB) padat 250 ml Medium Luria Bertani (LB) 100 ml Medium Super Optimal Catabolite (SOC) Komposisi bahan kimia dan pembuatan Sebanyak 2,5 g tripton, 1,25 g yeast extract, 1,25 g NaCl, dan 3,75 g agar dilarutkan dengan akuades hingga mencapai volume 250 ml. Medium kemudian disterilisasi dan ditambahkan ampisilin sebanyak 125 µl. Sebanyak 1 g tripton, 0,5 g yeast extract, dan 0,5 g NaCl dicampur dan dilarutkan dengan akuades hingga mencapai volume 250 ml, kemudian disterilisasi dan disimpan di dalam lemari pendingin. Sebanyak 10 g bakto tripton, 5 g yeast extract, 0,5 g NaCl, dan 10 ml KCl 250 mm ditambahkan akuades hingga mencapai volume 1000 ml. ph larutan diukur (ph 7). Medium kemudian disterilisasi, MgCl 2 dan 20 ml glukosa ditambahkan sesaat sebelum digunakan. Buffer TAE 50X Sebanyak 48,4 g Tris base, 7,4 g EDTA dan 11,42 ml asam asetat glasial ditambahkan akuades hingga mencapai volume 200 ml. Buffer TAE 1X Sebanyak 4 ml buffer TAE 50X ditambah dengan 196 ml akuades. Buffer P1 Sebanyak 800 µl Tris-Cl 10 mm (ph 8,0), 80 µl EDTA 1 mm (ph 8,0) dan 400 µl RNaseA 10 mg/ml ditambahkan akuades hingga mencapai volume 40 ml. Buffer P2 Sebanyak 0,32 g NaOH padat dan 4 ml Sodium Dodecyl Suphate (SDS) 1% dilarutkan dengan akuades hingga mencapai volume 40 ml.

23 96 Lampiran 1 (lanjutan) Buffer P3 Larutan fenol: kloroform: isoamilalkohol Larutan agarosa 0,8% (b/v) 100 ml Larutan agarosa 1,5% (b/v) 100 ml Larutan MgCl 2 0,1M Larutan CaCl 2 0,1M Marka 100 pb Marka 1 kb Loading buffer 6X Buffer TE 10X dan 1X Sebanyak 11,7 g KCl dan 4,6 ml asam asetat glasial dilarutkan dengan akuades hingga mencapai volume 40 ml. Sebanyak 25 ml fenol dicampur dengan 24 ml kloroform dan 1 ml isoamilalkohol Sebanyak 0,8 g agarosa dilarutkan dengan 100 ml buffer TAE 1x Sebanyak 1,5 g agarosa dilarutkan dengan 100 ml TAE 1x Sebanyak 2,033 g MgCl2 ditambah dengan akuades hingga mencapai volume 100 ml. Larutan kemudian disterilisasi dan disimpan di dalam ruang pendingin. Sebanyak 1,665 g CaCl2 ditambah dengan akuades hingga mencapai volume 150 ml. Larutan kemudian disterilisasi dan disimpan di dalam ruang pendingin. Sebanyak 10 µl stok marka 100 pb, 17 µl loading buffer 6X dan 73 µl buffer TE 1X dicampur dan dihomogenasi, kemudian disentrifus beberapa detik. Sebanyak 10 µl stok marka 1 kb, 17 µl loading buffer 6X dan 73 µl buffer TE 1X dicampur dan dihomogenasi, kemudian disentrifus beberapa detik. Sebanyak 1,5 g bromfenol biru dan 3 ml gliserol ditambah akuades hingga mencapai volume 10 ml. Sebanyak 10 µl stok marka 1 kb, 17 µl loading buffer 6X dan 73 µl buffer TE 1X dicampur dan dihomogenasi, kemudian disentrifus beberapa detik.

24 97 Lampiran 1 (lanjutan) Larutan Sodium Dodecyl Suphate (SDS) 10% (b/v) Larutam SDS 1% (b/v) EDTA 0,5 M Sebanyak 100 g SDS dilarutkan dengan 1000 ml akuades. Sebanyak 100 ml larutan SDS 10% dicampurkan dengan 1000 ml akuades. Sebanyak 22,334 g bubuk EDTA dilarutkan dengan akuades hingga mencapai volume 60 ml. Larutan TBE 10X Sebanyak 108 g Tris base, 55 g boric acid, dan 40 ml EDTA 0,5 M dilarutkan dengan akuades hingga mencapai volume 1000 ml. Larutan akrilamid Sebanyak 29 g akrilamid dan 1 g bisakrilamid ditambahkan dengan akuades hingga volume 80 ml. Larutan didiamkan pada suhu 37 C selama 10 menit, kemudian ditambahkan akuades hingga mencapai volume 100 ml. Gel poliakrilamid 8% Sebanyak 500 µl TBE 10X dicampur dengan 1350 µl larutan akrilamid, 3150 µl akuades, 60 µl amonium persulfat 10% (b/v) dan 10 µl TEMED. [Sumber: Sambrook & Russell 2001: A1.1--A2.12.]

25 98 Lampiran 2 Perhitungan konsentrasi DNA sisipan untuk reaksi ligasi ng sisipan = ng vektor x ukuran sisipan x 3 ukuran vektor x 1 ng sisipan = 180 x 322 x x1 = 36,77 ng/µl Konsentrasi DNA sisipan = 150 ng/ µl Volume DNA sisipan untuk reaksi ligasi = 0,245 ~ 0,25 µl Volume DNA vektor = 1 µl [Sumber: Promega 1999: 6.]

26 99 Lampiran 3 Perhitungan efisiensi transformasi sel Escherichia coli TOP10 kompeten Transforman cfu = Jumlah koloni transforman x faktor pengenceran x volume kultur total/volume kultur ditransformasi = 642 x 1 x (200/50) = 2,568 x 10 3 Efisiensi transformasi = transforman cfu/konsentrasi plasmid = 2,568 x 10 3 /0,01 = 2,568 x 10 5 cfu/µg [Sumber: Zhiming Tu dkk. 2005: 118.]