MATERI DAN METODE Lokasi dan Waktu Materi Sampel Pengambilan Sampel Ekstraksi DNA Primer

Transkripsi

1 MATERI DAN METODE Lokasi dan Waktu Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Juni hingga Nopember Penelitian dilakukan di Laboratorium Pemuliaan dan Genetik Molekuler, Bagian Pemuliaan dan Genetik Ternak, Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Materi Sampel Sampel yang digunakan berupa darah sapi Friesian Holstein (FH) sebanyak 89 sampel yang terdiri atas sapi jantan yang berasal dari BBIB Singosari sebanyak 32 ekor dan BIB Lembang 17 ekor; sapi betina dari BET Cipelang sebanyak 40 ekor. Darah dikoleksi juga dari sapi pedaging sebagai pembanding sebanyak 37 ekor sapi betina yang meliputi sapi Limosin sebanyak 14 ekor, Angus lima ekor, Simental 13 ekor dan Brahman lima ekor yang berasal dari BET Cipelang. Pengambilan Sampel Bahan yang digunakan adalah alkohol 70%, es, dan kapas. Alat yang digunakan antara lain jarum venoject, tabung vacutainer 10 ml dan termos. Sampelsampel darah yang digunakan merupakan data sekunder hasil koleksi laboratorium Pemuliaan dan Genetika Molekuler, Bagian Pemuliaan dan Genetik Ternak, Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan, Fakultas Peternakan. Ekstraksi DNA Bahan yang digunakan adalah Destilation Water (DW), NaCl, Proteinase-K, 1x STE (5M NaCl, 2M tris HCl, 0,2M EDTA), SDS 10% (sodium dodesil sulfat), CIAA (klorofom iso amil alkohol), fenol, etanol absolut, etanol 70% dan buffer TE 80% (tris EDTA). Alat yang digunakan adalah autoclave, satu set pipet mikro, vortexmixer, alat pemutar, alat sentrifugasi, refrigerator dan freezer. Primer Primer yang digunakan untuk mengamplifikasi gen laktoferin adalah berdasarkan primer yang digunakan Wojdak et al. (2006) dengan panjang produk PCR 301 pb, yaitu:

2 forward: 5 -GCC TCA TGA CAA CTC CCA CAC-3 ; reverse: 3 -CAG GTT GAC ACA TCG GTT GAC-5. Amplifikasi DNA dengan Polymerase Chain Reaction (PCR) Bahan yang digunakan adalah DW, sampel DNA, buffer, MgCl2, pasangan primer, enzim taq dan dntp, enzim retriksi EcoRI dan buffer EcoRI. Alat yang digunakan adalah satu set pipet mikro, alat sentrifugasi, tabung PCR, mesin PCR, vortex, lemari es. Elektroforesis Bahan yang digunakan adalah air destilasi, agarose, 0,5xTBE, Etidium Bromide, loading dye (0,01% Xylene Cyanol, 0,01% Bromtimol blue, 50% gliserol), dan marker 100 pb. Alat yang digunakan antara lain microwave, stearer, magnet stearer, gelas ukur, tabung erlenmeyer, gel tray, pencetak untuk sumur (comb), power supply 100 volt, gelas ukur, pipet makro dan mikro. Genotyping Bahan-bahan yang digunakan yaitu loading dye (bromthymol blue 0,01%, Xylene cyanol 0,01% dan gliserol 50%) dan untuk membuat 1 lembar gel agarose 2% adalah sebagai berikut: agarose 0,6 g; 0,5 TBE 30 ml, dan 2,5 µl Etidium Bromide. Alat-alat yang digunakan antara lain adalah microwave, stearer, magnet stearer, gelas ukur, tabung erlenmeyer, gel tray, pencetak untuk sumur (comb), power supply 100 volt, gelas ukur, dan pipet mikro. Prosedur Pengambilan Sampel Pengambilan sampel dilakukan pada tiga Balai Bibit Nasional, yaitu BBIB Singosari, BIB Lembang dan BET Cipelang. Sampel darah merupakan koleksi laboratorim. Sampel darah diambil melalui vena jugularis dengan menggunakan jarum venoject pada tabung vacutainer yang ditambahakan alkohol 70%. Sampel disimpan dalam termos es atau lemari es sampai akan digunakan lebih lanjut.

3 Ekstraksi DNA Sampel darah yang disimpan dalam alkohol 70% diambil sebanyak 200 l, kemudian ditambahkan 1000µl Destilation Water (DW). Sampel digetarkan lalu didiamkan selama lima menit. Setelah itu disentrifuse pada kecepatan 8000 rpm selama lima menit, lalu supernatan dibuang, dan diulangi seperti proses sebelumnya, kemudian ditambahkan 10 l proteinase-k yang berfungsi untuk menghancurkan protein, 350 l 1xSTE (sodium tris-edta) dan 40 l 10% SDS (sodium dodesil sulfat) yang berfungsi untuk melisiskan membran sel. Campuran tersebut kemudian diinkubasi pada suhu 55 o C selama dua jam sambil dikocok pelan dengan menggunakan alat pemutar (tilting). Molekul DNA kemudian dimurnikan dengan metode fenol-chloroform, yaitu dengan menambahkan 40 l 5M NaCl, 400 l larutan fenol dan CIAA (chloroform iso amil alcohol), lalu dikocok pelan (tilting) pada suhu ruang selama 1 jam. Molekul DNA yang larut dalam fase air dipisahkan dari fase fenol dengan alat sentrifugasi pada kecepatan rpm selama lima menit. Setelah terbentuk fase DNA, diambil sebanyak 40 l pada fase DNA untuk dipindahkan ke tabung baru 1,5 ml. Kemudian ditambahkan 5M NaCl sebanyak 40 l dan etanol absolut sebanyak 800 l. Molekul DNA kemudian dimalamkan (over night) pada suhu -20 o C. Molekul DNA kemudian dipisahkan dari etanol absolut dengan cara sentrifugasi pada kecepatan rpm selama lima menit, kemudian supernatan yang diperoleh dibuang. Endapan yang terbentuk kemudian dicuci dengan menambahkan 70% etanol sebanyak 800 l dan disentrifugasi pada kecepatan rpm selama lima menit. Supernatan yang diperoleh kemudian dibuang sehingga didapatkan endapan molekul DNA. Endapan tersebut didiamkan sampai kering. Lalu endapan DNA disuspensikan dalam 100 l 80% buffer TE (tris EDTA). Amplifikasi DNA Pereaksi untuk amplifikasi gen DNA secara umum dilakukan menggunakan campuran yang terdiri atas 1 l sampel DNA yang sudah diekstraksi, 9,7 l DW, 0,1 l primer, 0,05 l taq polymerase, 1,25 l buffer, 0,15 l dntp dan 0,25 l MgCl2. Campuran tersebut kemudian dimasukkan ke dalam mesin PCR pada kondisi suhu pradenaturasi 94 o C selama lima menit, 35 siklus (denaturasi 94 o C selama 45

4 detik, anneling 60 o C selama 45 detik dan elongasi 72 o C selama satu menit) dan elongasi akhir 72 o C selama lima menit. Elektroforesis Elektroforesis produk PCR dilakukan menggunakan 5 μl produk PCR pada gel agarose 1.5% pada tegangan 100 volt selama 30 menit. Gel dibuat dengan cara memanaskan agarose 0,45 g yang dilarutkan dalam larutan 0,5xTBE 30 ml serta menambahkan 2,5 µl EtBr pada saat distearer sampai didapatkan larutan jernih. Larutan yang masih cair dituangkan ke dalam pencetak gel serta menempatkan sisir di dekat tepian gel dan gel dibiarkan mengeras. Apabila gel sudah mengeras, sisir dicabut sehingga akan terbentuk sumur-sumur yang digunakan untuk menempatkan sebanyak 5µl produk PCR dicampur dengan loading dye (bromthymol blue 0,01%, Xylene cyanol 0,01% dan gliserol 50%). Gel ditempatkan ke dalam gel tray elektroforesis yang sudah berisi larutan buffer dan dialiri listrik, molekul DNA yang bermuatan negatif pada ph netral akan bergerak (migrasi) ke arah positif (anode). Setelah elektroforesis selesai gel agarose diambil untuk dilihat panjang pita DNA dengan menggunakan sinar Ultraviolet yaitu dengan menarik garis lurus antara posisi pita dari masing-masing sampel DNA yang ingin diukur dengan posisi pita DNA marker, dapat mengestimasi ukuran sampel DNA karena ukuran DNA pengukur telah diketahui. Genotyping PCR-RFLP dilakukan dengan menggunakan lima μl produk PCR dipindahkan ke dalam tabung 0,5 ml yang ditambahkan 1 µl DW, 0,3 µl enzim restriksi EcoRI dan 0,7 µl buffer EcoRI. Campuran tersebut diinkubasikan dalam inkubator pada suhu 37 C selama 16 jam. Sampel DNA yang telah dipotong dengan enzim restriksi dielektroforesis pada gel agarose 2% pada tegangan 100 volt selama 30 menit. Setelah elektroforesis selesai gel agarose diambil untuk melihat panjang pita DNA dengan menggunakan sinar ultraviolet dan dibandingkan dengan marker untuk mengetahui panjangnya. Setiap pita DNA dari setiap sampel dibandingkan untuk menentukan genotipe pita DNA. Satu posisi migrasi yang sama dianggap sebagai satu tipe atau alel. DNA yang tampak seperti pita difoto untuk diabadikan susunan pita-pitanya. Genotiping menutrut Wojdak et al. (2006)

5 sepanjang 301 pb, 201 pb dan 100 pb. Alel A pada fragmen 301 pb, sedangkan alel B pada fragmen 201 pb dan 100 pb. Genotipe AA ditunjukkan dengan hanya ditemukan satu fragmen 301 pb, genotip BB ditunjukkan dengan ditemukan tiga fragmen yaitu 301 pb, 201 pb, dan 100 pb, sedangkan untuk genotipe AB terdapat dua fragmen yaitu 201 pb, dan 100 pb. Rancangan Frekuensi Alel dan Genotipe Frekuensi genotipe merupakan rasio dari jumlah suatu genotipe terhadap jumlah populasi. Keragaman genotipe pada masing-masing individu ternak dapat ditentukan melalui pita-pita DNA yang ditemukan. Frekuensi genotipe dapat diketahui dengan menghitung perbandingan jumlah genotipe tertentu pada setiap populasi, dengan rumus Nei dan Kumar (2000) sebagai berikut : Frekuensi alel merupakan rasio suatu alel terhadap keseluruhan alel pada suatu lokus dalam populasi. Frekuensi alel ( ) gen laktoferin dapat dihitung berdasarkan rumus Nei dan Kumar (2000), sebagai berikut : Keterangan : = frekuensi genotipe ke-ii n ii n ij N = frekuensi alel ke-i = jumlah individu bergenotipe ii = jumlah individu bergenotipe ij = jumlah individu sampel Keseimbangan Hardy-Weinberg (HW) Keseimbangan Hardy-Weinberg diuji dengan menggunakan perhitungan Chi- Kuadrat (Hartl dan Clark, 1997) :

6 Keterangan: χ 2 = chi-kuadrat O = jumlah pengamatan genotipe ke-i E = jumlah harapan genotipe ke-i Derajat bebas (db) dihitung berdasarkan Allendrof dan Luikart (2007) dengan menggunakan rumus: Db = (Genotipe-1) (Alel -1) Heterozigositas Keragaman genetik dapat diketahui melalui estimasi frekuensi heterozigositas pengamatan yang diperoleh dari masing-masing populasi, dengan menggunakan rumus Weir (1996) sebagai berikut : Keterangan : Ho = heterozigositas pengamatan (populasi) n ij = jumlah individu heterozigot N = jumlah individu yang diamati Heterozigositas harapan (He) berdasarkan frekuensi alel dihitung menggunakan rumus Nei dan Kumar (2000) sebagai berikut : Keterangan : He = nilai heterozigositas harapan = frekuensi alel homozigot q = jumlah alel