3 BAHAN DAN METODE. Waktu dan Tempat
|
|
- Sucianty Wibowo
- 6 tahun lalu
- Tontonan:
Transkripsi
1 13 3 BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian ini dilakukan pada bulan April 2012 hingga Januari 2013, bertempat di Laboratorium Kultur Jaringan serta Laboratorium BIORIN (Biotechnology Research Indonesia-the Netherland) Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi, Institut Pertanian Bogor. Bahan Rumput Laut dan Bakteri Talus K. alvarezii warna hijau dipotong sekitar 3 cm, disterilisasi menggunakan larutan iodin 1% dan detergen, kemudian dikultur dalam media Prevasoli s Enriched Seawater (PES) (Lampiran 1) cair hingga siap untuk ditransformasi. Bakteri yang digunakan adalah Escherichia coli DH5α yang membawa plasmid pmsh1 (Gambar 3), E. coli DH5α yang membawa plasmid pjfker-lis (Gambar 4), E. coli DH1 (prk2013) dan A. tumefaciens LBA4404. Gambar 3. Peta daerah T-DNA plasmid pmsh1 (NAIST, Japan). NPT II adalah gen marka seleksi neomycin phosphotransferase II, HPT adalah gen marka seleksi hygromycin phosphotransferase, MCS adalah daerah penyisipan gen target yang dikontrol oleh promoter cauliflower mosaic virus 35S (CaMV 35S) dan terminator (T) nopaline synthase (Nos), menyandikan XbaI, XhoI, SacI, SmaI, KpnI, SpeI, NotI, BamHI. Gambar 4. Peta plasmid pjfker-lis (Yazawa et al. 2005). Gen lisozim ayam dikontrol oleh promoter keratin (Keratin) ikan flounder Jepang (Paralichthys olivaceus). SV40 adalah terminator simian virus 40. NPT II = neomycin phosphotransferase, GFP = green flourescent protein.
2 14 Konstruksi Vektor Biner Gen lisozim diamplifikasi dari pjfker-lis (Yazawa et al. 2005) menggunakan PCR dengan primer F: 5 -GCA CTA GTG GCA ACA TGA GGT CTT TGC-3 dan R: 5 - TTG CGG CCG CTC CTC ACA GCC GGC AGC-3. Ujung 5 primer forward ditambahkan situs restriksi (huruf tebal dan garis bawah) SpeI dan pada primer reverse dengan NotI untuk membantu dalam ligasi ke vektor biner pmsh-1 (pemberian Dr. Yokota, NAIST, Japan). Plasmid pmsh-1 dan gen lisozim produk PCR dipotong dengan enzim NotI dan SpeI. Reaksi restriksi diinkubasi pada suhu 37 o C selama 16 jam. Vektor pmsh-1 hasil restriksi diligasi dengan gen lisozim mengikuti metode Sambrook et al. (1989). Sebanyak 4 µl 80 ng/µl pmsh-1 dicampur dengan 3 µl 40 ng/µl gen lisozim, 1 µl larutan bufer ligasi 10x, 0,5 µl enzim T4 DNA ligase dan 1,5 µl ddh 2 O. Inkubasi reaksi ligasi dilakukan pada suhu 4 o C selama 16 jam, kemudian produk ligasi dipakai untuk proses transformasi. Proses transformasi mengikuti metode Suharsono et al. (2002). Sebanyak 50 µl sel kompeten E. coli DH5α ditambahkan dengan 10 µl DNA plasmid hasil ligasi, diinkubasi di dalam es selama 30 menit. Selanjutnya diberi kejutan panas pada suhu 42 o C selama 45 detik dan diinkubasi lagi di dalam es selama 5 menit. Volume akhir dijadikan 160 µl dengan menambahkan 100 µl 2xYT cair dan dikocok menggunakan shaker pada suhu 37 o C selama 60 menit. Sebanyak 160 µl campuran tersebut disebar secara merata di media LA (Lurria Bertani Agar) (Lampiran 2) yang ditambah dengan kanamisin 50 mg/l dan diinkubasi pada suhu 37 o C selama 16 jam. Koloni bakteri yang terbentuk diambil dan selanjutnya digunakan dalam PCR untuk mendapatkan koloni transforman yang membawa pmsh1-lis. Transforman dikultur kembali pada media LB (Lurria Bertani) (Lampiran 2) dengan penambahan antibiotik kanamisin 50 mg/l dan higromisin 50 mg/l. Isolasi DNA plasmid dari kultur cair bakteri dilakukan dengan metode lisis alkalis (Sambrook et al. 1989). Bakteri E. coli yang membawa plasmid pmsh-1 dikultur dalam media LB (Lurria Bertani) selama 18 jam. Hasil kultur 1,5 ml disentrifugasi 5000 rpm (Jouan Centrifuge BR4i) 4 o C selama 4 menit. Pelet ditambah dengan 150 μl larutan I (Lampiran 3) dan diresuspensi kembali. Resuspen ditambahkan 200 μl larutan II (Lampiran 3), bolak-balik 7-8 kali dan diinkubasi selama 5 menit di suhu ruang, kemudian ditambah dengan 250 μl larutan III (Lampiran 3) dan dibolak-balik 7-8 kali, kemudian disimpan di atas es selama 10 menit dan dilanjutkan dengan sentrifugasi rpm 4 o C selama 15 menit. Supernatan dipindah ke tabung eppendorf baru, kemudian ditambah dengan fenol: kloroform: isoamilalkohol (PCI, 25:24:1) dan dilanjutkan dengan divorteks kuat dan disentrifugasi rpm 4 o C selama 10 menit. Pada tahap ini akan terbentuk 3 lapisan, lapisan atas diambil dan dipindahkan ke eppendorf baru, kemudian ditambah etanol absolut 2x volume lapisan atas dan dilanjutkan dengan inkubasi pada -20 o C selama 3 jam. Tahap selanjutnya adalah sentrifugasi pada rpm 4 o C selama 15 menit. Endapan yang terbentuk dicuci dengan 1 ml etanol 70%, selanjutnya disentrifugasi pada rpm 4 0 C selama 15 menit. Supernatan dibuang, sedangkan plasmid (pelet) dikeringkan dengan cara divacum selama 15 menit. Plasmid dilarutkan dalam 20 μl ddh 2 O dan RNAse 4 μl 1 mg/ml, kemudian diinkubasi pada 37 o C selama 10 menit. RNAse diinaktivasi
3 15 dengan inkubasi pada 70 o C selama 10 menit. Plasmid yang diperoleh kemudian disimpan pada suhu -20 o C untuk digunakan pada tahap selanjutnya. Keberhasilan penyisipan gen lisozim dalam pmsh1 diuji dengan memotong plasmid menggunakan enzim restriksi NotI dan SpeI (Fermentas). Transformasi pmsh1-lis ke A. tumefaciens dan Analisis PCR Transformasi pmsh1-lis ke A. tumefaciens dilakukan dengan cara triparental mating (TPM) (Liberty et al. 2008). Transformasi menggunakan tiga macam bakteri, yaitu E. coli yang membawa plasmid pmsh1-lis, bakteri helper DH1 (prk2013) dan A. tumefaciens LBA4404. Setiap bakteri tersebut sebanyak 20 μl dicampur, kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 36 jam. Bakteri yang tumbuh di media LA ini ditumbuhkan dalam media seleksi LA mengandung kanamisin 50 mg/l, higromisin 50 mg/l dan streptomisin 50 mg/l, diinkubasi pada suhu ruang selama 36 jam. Analisis transforman A. tumefaciens dilakukan dengan teknik PCR menggunakan primer 35S-F: 5 -ATG GCT GGA GTA TTA GCT GGG-3 dan Lis-R: 5 -TTG CGG CCG CTC CTC ACA GCC GGC AGC -3 serta Lis-F: 5 - GCA CTA GTG GCA ACA TGA GGT CTT TGC-3 dan Nos-R: 5 -CTC ATA AAT AAC GTC ATG CAT TAC A-3. Proses PCR dijalankan pada suhu predenaturasi 94 o C selama 3 menit; 35 siklus untuk denaturasi 94 o C selama 30 detik, annealing 64 o C selama 30 detik, ekstensi 72 o C selama 1 menit, dan final ekstensi 72 o C selama 5 menit. Produk PCR diseparasi dengan teknik elektroforesis pada gel agarosa 2% (b/v) menggunakan bufer TAE 1x (Lampiran 4), dengan voltase 50 V selama 50 menit. Pengamatan dilakukan terhadap pola pita DNA hasil amplifikasi DNA dengan menggunakan DNA marker berukuran 100 pb. Transformasi pmsh1-lis pada Talus Kappaphycus alvarezii Kultur A. tumefaciens hasil konjugasi Satu koloni A. tumefaciens yang membawa plasmid pmsh1-lis ditumbuhkan pada media LB mengandung streptomisin 50 mg/l, kanamisin 50 mg/l dan higromisin 50 mg/l, dikocok menggunakan shaker (kecepatan 200 rpm) selama 36 jam pada suhu ruang. Setelah dilakukan subkultur selama 18 jam, bakteri diendapkan dengan sentrifugasi pada kecepatan 4000 rpm selama 10 menit. Pelet bakteri kemudian dilarutkan dalam 25 ml media PES cair dan penambahan 100 µm asetosiringon hingga mencapai optical density (OD) 0,5-1,0. Transformasi dan regenerasi rumput laut Transformasi dilakukan mengikuti metode Cheney (2000). Transformasi menggunakan talus rumput laut yang telah dipotong sepanjang 1-2 cm dan dikultur selama 3 hari, kemudian dilukai menggunakan jarum steril. Sampel direndam dalam media infeksi yang berisi A. tumefaciens dan 100 µm asetosiringon selama 30 menit dengan penggoyangan. Talus dikeringkan dengan
4 16 tisu steril dan dipindahkan ke media ko-kultivasi (media PES 0,8% dan 100 µm asetosiringon) selama 3 hari di ruang gelap. Eksplan hasil ko-kultivasi dicuci dengan cefotaxim 200 mg/l, dibilas dengan air laut steril sebanyak 3 kali. Eksplan dikeringkan di atas tisu steril, kemudian dipindahkan ke media recovery (PES 0,5% tanpa asetosiringon) selama 7 hari. Selanjutnya eksplan dipindahkan ke media seleksi (PES 0,5% yang mengandung higromisin 20 mg/l) dan diinkubasi selama 2 minggu di ruang terang (intensitas cahaya antara lux) pada suhu 26 o C. Pengamatan dilakukan pada media seleksi yang mengandung higromisin. Variabel yang diukur adalah: 1) jumlah eksplan hidup pada media seleksi higromisin, dan 2) jumlah eksplan bertunas putatif. Identifikasi Talus Transforman dengan Metode Polymerase Chain Reaction DNA diisolasi menurut Doyle & Doyle (1987): 0,1 g sampel dihancurkan, kemudian ditambahkan 600 µl CTAB 2% (b/v) (Lampiran 5) dan 1,2 µl mercapto etanol 0,2% dan diinkubasi pada suhu 65 o C selama 30 menit. Larutan ditambahkan 600 µl CI (chloroform : isopropanol; 24:1) dan disentrifugasi dengan kecepatan rpm (Jouan Centrifuge BR4i) selama 5 menit pada 4 o C, kemudian ditambahkan dengan 600 µl PCI (phenol : chloroform : isopropanol; 25:24:1), dan disentrifugasi kembali pada rpm selama 5 menit pada 4 o C. Supernatan ditambahkan dengan 0,1x volume dengan 2 M NaOAc ph 5,2 dan 2x volume dengan etanol absolut, kemudian diinkubasi pada suhu -20 o C selama 3 jam. Selanjutnya disentrifugasi kembali pada rpm 4 o C selama 5 menit. Pelet ditambahkan dengan 500 µl etanol 70% (v/v), selanjutnya disentrifugasi rpm 4 o C selama 5 menit. Pelet dikeringkan dengan vacum, dilarutkan dalam 20 µl ddh 2 O dan 4 µl 1 mg/ml RNAse, dan kemudian diinkubasi pada suhu 37 o C selama 10 menit. Aktivitas RNase diinaktivasi menggunakan suhu 70 o C selama 10 menit. Amplifikasi DNA hasil ekstraksi dilakukan menggunakan mesin PCR. Primer yang digunakan adalah F Lis R Lis, F 35S - R Lis dan F Lis R Nos. Proses PCR dijalankan pada suhu predenaturasi 94 o C selama 3 menit; 35 siklus untuk denaturasi 94 o C selama 30 detik, annealing 64 o C selama 30 detik, ekstensi 72 o C selama 1 menit, dan final ekstensi 72 o C selama 5 menit. Untuk melihat pita DNA yang terbentuk, hasil PCR dielektroforesis pada gel agarosa 2% dalam larutan penyangga TAE 1x (Lampiran 4) dengan voltase 50 V selama 50 menit. Pengamatan dilakukan terhadap pola pita DNA hasil amplifikasi DNA dengan menggunakan DNA marker berukuran 100 pb.
5 17 4 HASIL DAN PEMBAHASAN Konstruksi plasmid biner pmsh1-lisozim Konstruksi plasmid biner dilakukan dengan meligasi gen lisozim ayam dan pmsh1. Plasmid hasil ligasi berukuran pb (Gambar 5A kolom 1). Bakteri transforman yang membawa plasmid pmsh1-lis diidentifikasi menggunakan PCR dengan pasangan primer Lis-F dan Lis-R; 35S-F dan Lis-R; serta Lis-F dan Nos-R. Hasil analisis PCR dengan pasangan primer tersebut menghasilkan amplikon masing-masing berukuran 460 pb, 670 pb dan 580 pb (Gambar 5B). Gambar 5. A. Pola pemotongan plasmid pmsh1-lis menggunakan enzim NotI dan SpeI. M = marka DNA 1 kb ladder (Fermentas), kolom 1 = pasmid pmsh1-lis, kolom 2 = plasmid pmsh1-lis yang sudah dipotong dengan NotI dan SpeI, dan kolom 3 = gen lisozim (Lis). B. Identifikasi Escherichia coli DH5α transforman pembawa gen lisozim menggunakan PCR dengan primer Lis-F dan Lis-R (kolom 1, 2 dan 3), 35S-F dan Lis-R (kolom 4 dan 5) dan Lis-F dan Nos-R (kolom 6 dan 7). M = marka DNA 100 pb ladder (Fermentas), kolom 1, 4 dan 6 adalah DH5α hasil transformasi pmsh1-lis, kolom 2 = kontrol plasmid pjfker-lis, kolom 3, 5 dan 7 adalah kontrol negatif (DH5α non-transforman). Verifikasi terhadap E. coli yang mengandung plasmid biner (pmsh1 yang mengandung gen lisozim) juga dilakukan dengan menggunakan enzim restriksi terhadap sampel DNA plasmid yang membawa gen lisozim. Berdasarkan hasil restriksi dengan NotI dan SpeI dihasilkan dua fragmen berukuran pb dan 460 pb (Gambar 5A kolom 2). Fragmen pb merupakan ukuran dari plasmid pmsh1, dan 460 pb merupakan fragmen gen lisozim. Hal tersebut membuktikan bahwa vektor biner pmsh1-lis berhasil dibuat. Transformasi gen lisozim yang terdapat pada plasmid pmsh1 ke dalam bakteri E.coli DH5α telah berhasil dilakukan. Keberhasilan transformasi ini dapat dilihat dari transforman E. coli DH5α yang tumbuh pada media seleksi kanamisin (50 mg/l) dan higromisin (50 mg/l). Kemampuan transforman ini tumbuh pada media seleksi tersebut dikarenakan adanya gen nptii (neomycin phosphotransferase) penyandi ketahanan terhadap antibiotik kanamisin dan hpt (hygromycin phosphotransferase) penyandi ketahanan terhadap antibiotik
6 18 higromisin pada plasmid pmsh1. Keberhasilan transformasi ini dilakukan dengan amplifikasi gen lisozim yang dikendalikan oleh promoter 35S CaMV dan terminator Nos menggunakan PCR, serta pengujian menggunakan enzim restriksi. Keberhasilan transformasi gen lisozim ke dalam E. coli DH5α, dapat digunakan untuk transformasi ke dalam A. tumefaciens. Transformasi pmsh1-lisozim ke Agrobacterium tumefaciens Plasmid pmsh1-lis ditransformasikan ke dalam A. tumefaciens dengan cara triparental mating (TPM). Proses TPM telah berhasil dilakukan untuk mengintroduksikan plasmid pmsh1-lis ke dalam A. tumefaciens (Gambar 6). Plasmid pmsh1-lis yang terdapat pada E. coli DH5α hasil transformasi (sebagai donor) dipindahkan ke dalam A. tumefaciens (sebagai resipien) melalui proses konjugasi dengan bantuan prk2013 dalam E. coli DH1. Donor E. coli DH5α resisten terhadap antibiotik kanamisin dan higromisin, tetapi rentan terhadap antibiotik streptomisin dan resipien A. tumefaciens yang resisten terhadap antibiotik streptomisin, tetapi rentan terhadap antibiotik kanamisin dan higromisin. Bakteri yang mampu tumbuh pada media seleksi ini hanya A. tumefaciens yang telah mengandung plasmid pmsh1-lis hasil TPM (Gambar 6B). Kemampuan A. tumefaciens untuk tumbuh di media seleksi ini disebabkan karena di dalam sel bakteri ini telah membawa gen resistensi terhadap antibiotik kanamisin dan higromisin yang terdapat pada pmsh1-lis. Gambar 6. Triparental Mating (TPM). A. Hasil TPM yang tumbuh pada media LA tanpa antibiotik. B. Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 transforman pada media seleksi higromisin 50 mg/l, kanamisin 50 mg/l dan streptomisin 50 mg/l. C. LBA 4404 non-transforman pada media seleksi higromisin 50 mg/l, kanamisin 50 mg/l dan streptomisin 50 mg/l. Hasil analisis PCR menunjukkan bahwa koloni dari hasil TPM positif membawa gen lisozim. PCR dengan primer Lis-F dan Lis-R menghasilkan amplikon 460 pb, dengan primer 35S-F dan Lis-R menghasilkan amplikon sebesar 670 pb, sedangkan PCR dengan primer Lis-F dan Nos-R menghasilkan amplikon sebesar 580 pb (Gambar 7). Hal ini menunjukkan bahwa A. tumefaciens tersebut sudah mengandung gen lisozim dan dapat digunakan untuk percobaan transformasi gen lisozim ke dalam genom rumput laut K. alvarezii.
7 19 Gambar 7. Identifikasi transforman Agrobacterium tumefaciens hasil tri-parental mating (TPM) menggunakan tiga jenis primer untuk gen lisozim (kolom 1, 2 dan 3 dengan primer Lis-F dan Lis-R; 4, 5 dan 6 dengan primer 35S-F dan Lis-R; 7, 8 dan 9 dengan primer Lis-F dan Nos-R). M= marka DNA 100 pb ladder (Fermentas), 1 = 4 = 7 adalah A. tumefaciens LBA4404 pembawa pmsh1-lis, 2 = 5= 8 adalah kontrol positif (DH5α hasil transformasi pmsh1-lis), 3 =6 =9 adalah kontrol negatif (LBA4404 non-transforman). Transformasi gen lisozim pada talus Kappaphycus alvarezii Transformasi gen lisozim pada talus K. alvarezii yang sebelumnya diadaptasikan pada media kultur PES cair dan padat. Sebanyak 225 talus digunakan dalam transformasi. Talus yang telah diinfeksi dengan A. tumefaciens diseleksi pada media PES yang mengandung higromisin 20 mg/l selama 2 bulan. Tahapan transformasi genetik K. alvarezii dapat dilihat pada Gambar 8. Talus rumput laut yang mampu bertahan di media seleksi higromisin sebanyak 53 talus, dengan persentase sebesar 23,56%. Talus yang berhasil bertunas putatif berjumlah 6, dengan efisiensi sebesar 11,32% (Tabel 1). Efisiensi talus bertunas putatif ditentukan berdasarkan rasio jumlah talus bertunas putatif terhadap jumlah talus yang mampu bertahan di media seleksi higromisin. Efisiensi tunas putatif talus yang ditransformasi lebih rendah daripada efisiensi tunas pada talus kontrol positif yang tidak ditransformasi (22%). Rendahnya efisiensi tunas putatif diduga disebabkan oleh perlakuan infeksi Agrobacterium dan seleksi antibiotik yang mengakibatkan penurunan daya regenerasi talus untuk bertunas putatif. Hal ini sejalan dengan pendapat Suma et al. (2008) penambahan antibiotik dalam media seleksi dapat menyebabkan penurunan pertumbuhan dan perkembangan kalus. Pembentukan tunas dari talus yang tahan higromisin mulai teramati pada minggu keempat setelah infeksi. Pembentukan tunas diawali dengan munculnya titik-titik coklat pada talus. Setelah 2 minggu, titik coklat membesar dan membentuk tunas (Gambar 8C). Tunas yang terbentuk, secara umum muncul dari bagian talus yang dipotong. Talus yang mampu bertahan dimedia seleksi higromisin, selanjutnya diaklimatisasi skala kecil di media PES cair (Gambar 8D). Analisis molekuler terhadap talus yang tahan higromisin dengan PCR menggunakan kombinasi primer spesifik gen lisozim, promoter 35S CaMV dan terminator Nos menunjukkan bahwa tiga tunas yang terbentuk dari tiga talus mengandung gen lisozim. Tidak semua tunas yang terbentuk mengandung gen lisozim (Tabel 1), hal ini diduga disebabkan oleh tidak semua sel pada satu talus berhasil ditransformasi dengan gen lisozim. Analisis molekuler terhadap tunas
8 20 yang berasal dari sel-sel yang mengandung gen lisozim akan mengandung gen lisozim juga. Sedangkan tunas yang secara molekuler tidak mengandung gen lisozim, kemungkinan berasal dari sel-sel yang tidak mengandung gen lisozim. Persentase transformasi yang diperoleh pada penelitian ini sebesar 23,56% (Tabel 1). Persentase transformasi ini lebih rendah dibandingkan dengan persentase transformasi gen LacZ pada Gracilaria changii menggunakan metode tembakan partikel (particle bombardment) yaitu sebesar 80-94%. Rendahnya persentase transformasi yang diperoleh pada penelitian ini diduga dipengaruhi oleh perbedaan metode yang digunakan dalam proses transformasi. Selain itu, kemungkinan juga disebabkan karena masih kurang optimalnya tahapan dalam proses transformasi menggunakan A. tumefaciens, terutama pada tahap infeksi dan ko-kutivasi. Tabel 1. Persentase transformasi dan tunas putatif rumput laut Kappaphycus alvarezii dengan gen Lisozim. Perlakuan Jumlah Talus Persentase Transformasi a) Jumlah Talus Tahan Higromisin Jumlah Tunas Putatif Jumlah Positif PCR Efisiensi Tunas Putatif Transformasi ,56% ,32% b) Kontrol - 1) Kontrol + 2) % a) Jumlah talus tahan higromisin/jumlah kalus awal x 100% b) Jumlah talus yang bertunas putatif / jumlah kalus tahan higromisin x 100% 1) Talus non-transgenik yang ditumbuhkan pada media seleksi higromisin 2) Talus non-transgenik yang ditumbuhkan pada media PES tanpa higromisin Hasil transformasi menunjukkan bahwa penambahan 100 µm asetosiringon dengan OD 0,5-0,8 selama masa infeksi 30 menit di media PES yang mengandung A. tumefaciens menunjukkan pertumbuhan eksplan pada media seleksi (Gambar 8). Menurut James et al. (1993), penambahan asetosiringon ke dalam media kokultivasi efektif meningkatkan efisiensi transformasi. Penambahan asetosiringon mampu menginduksi gen vir yang berfungsi mentransfer T-DNA ke dalam sel tanaman dan mempertinggi efektivitas infeksi A. tumefaciens sehingga meningkatkan jumlah sel transforman (Rashid et al. 2010). Selain itu, perlakuan lama ko-kultivasi (inkubasi) antara bakteri dan eksplan sangat mempengaruhi efektivitas infeksi bakteri. Inkubasi yang terlalu cepat dapat mempengaruhi keberhasilan transformasi, karena bakteri belum sempat menginfeksi sel-sel eksplan secara sempurna. Menurut Alimohammadi & Bagherieh-Najjar (2009) keberhasilan transfer gen oleh A. tumefaciens sangat ditentukan oleh ada tidaknya luka/perlukaan, kerapatan bakteri (optical density), lama inokulasi dan lama kokultivasi. Talus transforman dapat tumbuh di media seleksi higromisin 20 mg/l, sedangkan talus non-transforman tidak mampu tumbuh pada media seleksi higromisin (Gambar 9). Kemampuan talus transforman tumbuh di media seleksi higromisin disebabkan adanya gen ketahanan terhadap higromisin yaitu hpt (hygromycin phosphotransferase) pada T-DNA yang ditransformasikan ke talus transforman. Sedangkan pada talus non-transforman tidak memiliki gen ketahanan tersebut sehingga talus tidak resisten terhadap higromisin dan mengalami
9 21 kematian. Talus non-transforman mengalami kematian secara bertahap pada media seleksi higromisin. Kematian talus non-transforman mulai teramati pada minggu ketiga di media seleksi higromisin 20 mg/l. Kematian talus diawali dengan memutihnya warna talus dan tekstur talus lebih rapuh. Setelah 12 minggu di media seleksi higromisin, seluruh talus non-transforman mengalami kematian (Gambar 9). Warna talus hijau menunjukkan talus masih hidup, sedangkan warna talus putih menunjukkan talus mengalami kematian (Gambar 9B, 9E dan 9H). Gambar 8. Tahapan transformasi genetik rumput laut Kappaphycus alvarezii. A. Talus rumput laut pada media ko-kultivasi; B. Talus rumput laut pada media recovery; C. Talus rumput laut pada media seleksi higromisin 20 mg/l; D. Talus positif PCR yang mengandung gen lisozim yang telah diaklimatisasi skala kecil. Konfirmasi rumput laut transgenik melalui keberadaan gen lisozim pada talus rumput laut hasil transformasi dilakukan dengan PCR. Pasangan primer yang digunakan adalah Lis-F dan Lis-R dengan ukuran fragmen amplikon yang dihasilkan sebesar 460 pb, 35S CaMV-F dan Lis-R dengan ukuran fragmen amplikon yang dihasilkan sebesar 680 pb serta Lis-F dan Nos-R dengan ukuran fragmen amplikon yang dihasilkan sebesar 570 pb. Plasmid pmsh1-lis digunakan sebagai kontrol positif, sedangkan rumput laut tipe liar digunakan sebagai kontrol negatif. Hasil PCR menunjukkan bahwa rumput laut hasil transformasi terbukti positif sebagai rumput laut transgenik (Gambar 10), sedangkan rumput laut non transgenik tidak menunjukkan amplifikasi fragmen tersebut.
10 22 Gambar 9. Tahapan perkembangan talus Kappaphycus alvarezii. Talus transforman pada media seleksi higromisin 20 mg/l, masingmasing umur empat (A), delapan (D) dan 12 minggu (G). Talus non-transforman pada media seleksi higromisin 20 mg/l, masingmasing umur empat minggu (B), delapan minggu (E) dan 12 minggu (H). Talus non-transforman pada media tanpa higromisin, masing-masing umur empat minggu (C), delapan minggu (F) dan 12 minggu (I). Pada B, E, dan H, warna talus hijau menunjukkan talus hidup, sedangkan warna talus putih menunjukkan talus mati. Keberhasilan transformasi genetik pada rumput laut ditandai dengan terintegrasinya gen yang diintroduksikan ke dalam genom rumput laut dan terekspresi serta tetap terpelihara dalam seluruh proses pembelahan sel sampai regenerasi rumput laut. Untuk mengetahui integrasi gen lisozim ke dalam rumput laut K. alvarezii dapat dilakukan dengan menggunakan marka seleksi terhadap antibiotik higromisin dan dapat dianalisis secara molekuler menggunakan teknik PCR. Berdasarkan kemampuan talus K. alvarezii tumbuh di dalam media seleksi (media PES dengan penambahan higromisin) (Tabel 1) dan konfirmasi rumput laut transgenik melalui keberadaan gen lisozim pada talus rumput laut hasil transformasi dengan PCR (Gambar 10), menunjukkan bahwa gen lisozim telah terintegrasi ke dalam genom rumput laut.
11 23 Gambar 10. Hasil analisis PCR DNA rumput laut hasil transformasi dengan gen Lisozim menggunakan tiga jenis primer (kolom 1, 2 dan 3 dengan primer Lis-F dan Lis-R; 4, 5 dan 6 dengan primer 35S-F dan Lis-R; 7, 8 dan 9 dengan primer Lis-F dan Nos-R). M = marka DNA 100 pb ladder (Fermentas), 1 = 4 = 7 adalah rumput laut transgenik, 2 = 5= 8 adalah kontrol positif (plasmid pmsh1-lis), 3 = 6 = 9 adalah kontrol negatif (rumput laut non-transforman). Kappaphycus alvarezii transgenik ini dapat dimanfaatkan untuk mempelajari mekanisme pertahanan rumput laut terhadap infeksi bakteri penyebab penyakit ice-ice. Uji tantang K. alvarezii terhadap bakteri penyebab iceice dapat dilakukan setelah diperoleh talus yang berasal dari subkultur tunas yang mengandung gen lisozim. Selain itu, ketika K. alvarezii transgenik ini telah tahan terhadap penyakit ice-ice, dapat berguna untuk meningkatkan produksi rumput laut di musim pada saat penyakit ice-ice sering menginfeksi. Metode transformasi yang diperoleh dalam penelitian ini dapat digunakan untuk menghasilkan rumput laut transgenik lainnya yang mengekspresikan protein yang mengatur sifat penting dalam akuakultur.
4 HASIL DAN PEMBAHASAN
17 4 HASIL DAN PEMBAHASAN Konstruksi plasmid biner pmsh1-lisozim Konstruksi plasmid biner dilakukan dengan meligasi gen lisozim ayam dan pmsh1. Plasmid hasil ligasi berukuran 13.449 pb (Gambar 5A kolom
Lebih terperinciPembuatan Media Kultur Bakteri Pemanenan sel bakteri. Isolasi DNA kromosom bakteri. Kloning DNA
LAMPIRAN 15 15 Lampiran 1 Tahapan penelitian Pembuatan Media Kultur Bakteri Pemanenan sel bakteri Isolasi DNA kromosom bakteri Pemotongan DNA dengan enzim restriksi Kloning DNA Isolasi DNA plasmid hasil
Lebih terperinciBAHAN DAN METODE. 1. Waktu dan Tempat penelitian
BAHAN DAN METODE 1. Waktu dan Tempat penelitian Penelitian dilakukan di Laboratorium Biologi Molekuler dan Rumah Kaca Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian
Lebih terperinciHASIL DAN PEMBAHASAN 1. Konstruksi vektor over-ekspresi gen OsWRKY 1.1 Amplifikasi dan purifikasi fragmen gen OsWRKY76
HASIL DAN PEMBAHASAN Kegiatan rekayasa genetik tanaman keberhasilannya tergantung pada beberapa hal, diantaranya adalah gen yang akan diintroduksikan, metode transformasi, sistem regenerasi tanaman dan
Lebih terperinciBAHAN DAN METODE. Produksi Protein Rekombinan Hormon Pertumbuhan (rgh)
11 BAHAN DAN METODE Penelitian ini terdiri atas 2 tahapan utama, yaitu produksi protein rekombinan hormon pertumbuhan (rgh) dari ikan kerapu kertang, ikan gurame, dan ikan mas, dan uji bioaktivitas protein
Lebih terperincibio.unsoed.ac.id METODE PENELITIAN A. Materi, Lokasi, dan Waktu Penelitian 1. Materi Penelitian
III. METODE PENELITIAN A. Materi, Lokasi, dan Waktu Penelitian 1. Materi Penelitian 1.1. Peralatan Penelitian Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah botol sampel, beaker glass, cool box, labu
Lebih terperinciBAB III METODE PENELITIAN. Jenis penelitian yang dilakukan termasuk dalam penelitian dasar yang. dilakukan dengan metode deskriptif (Nazir, 1998).
BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis Penelitian Jenis penelitian yang dilakukan termasuk dalam penelitian dasar yang dilakukan dengan metode deskriptif (Nazir, 1998). B. Populasi dan Sampel 1. Populasi yang
Lebih terperinciHASIL DAN PEMBAHASAN Transformasi, Kokultivasi, dan Regenerasi
26 HASIL DAN PEMBAHASAN Transformasi, Kokultivasi, dan Regenerasi Konstruksi vektor ekspresi yang digunakan pada penelitian ini adalah p35scamv::tclfy. Promoter p35s CaMV digunakan dalam penelitian ini
Lebih terperinciBAB III METODE PENELITIAN
BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis Penelitian Jenis penelitian yang digunakan adalah penelitian dasar dengan metode deskriptif (Nazir, 1983). B. Populasi dan Sampel Populasi dalam penelitian ini adalah
Lebih terperinci4 HASIL DAN PEMBAHASAN. 4.1 Transformasi genetik Oryza sativa L. dengan gen MaMt2
27 4 HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Transformasi genetik Oryza sativa L. dengan gen MaMt2 Transformasi genetik Oryza sativa L. kultivar Kasalath dan Nipponbare dilakukan menggunakan eksplan yang berupa kalus
Lebih terperinciBAB III METODE PENELITIAN
BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis Penelitian deskriptif. Jenis penelitian yang digunakan adalah penelitian dasar dengan metode B. Objek Penelitian Objek penelitian ini adalah sampel DNA koleksi hasil
Lebih terperinciKONSTRUKSI VEKTOR BINER DAN TRANSFORMASI GEN LISOZIM PADA RUMPUT LAUT Kappaphycus alvarezii MENGGUNAKAN PERANTARA Agrobacterium tumefaciens
KONSTRUKSI VEKTOR BINER DAN TRANSFORMASI GEN LISOZIM PADA RUMPUT LAUT Kappaphycus alvarezii MENGGUNAKAN PERANTARA Agrobacterium tumefaciens TRI HANDAYANI SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR
Lebih terperinciBAB III METODE PENELITIAN
BAB III METODE PENELITIAN 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Januari 2012 sampai bulan Juli 2012, yang bertempat di Laboratorium Genetika dan Biologi Molekuler Jurusan Biologi
Lebih terperinciBAHAN DAN METODE. Tempat dan Waktu Penelitian
BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian dilakukan di Laboratorium Kerjasama Bioteknologi Indonesia- Belanda (BIORIN) dan Laboratorium Biologi Molekuler dan Seluler Tanaman (BMST), Pusat
Lebih terperinciIII. BAHAN DAN METODE
III. BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian dilakukan di Laboratorium BIORIN (Biotechnology Research Indonesian - The Netherlands) Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi IPB. Penelitian
Lebih terperinciIII. BAHAN DAN METODE
11 III. BAHAN DAN METODE 3.1 Ikan Uji Larva ikan gurame diperoleh dari pembenihan di Desa Ciherang Kec. Darmaga, Kab. Bogor. Larva dipelihara dalam akuarium berukuran 1,0x0,5x0,5 m 3 dengan kepadatan sekitar
Lebih terperinciBAB 3 METODOLOGI PENELITIAN
BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN 3.1 Desain Penelitian Bentuk desain penelitian yang akan digunakan adalah bentuk deskriptif molekuler potong lintang untuk mengetahui dan membandingkan kekerapan mikrodelesi
Lebih terperinciKEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAAN DIREKTORAT JENDERAL PENDIDIKAN MENENGAH DIREKTORAT PEMBINAAN SEKOLAH MENENGAH ATAS
KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAAN DIREKTORAT JENDERAL PENDIDIKAN MENENGAH DIREKTORAT PEMBINAAN SEKOLAH MENENGAH ATAS Test Seleksi Calon Peserta International Biology Olympiad (IBO) 2014 2 8 September
Lebih terperinciBAB III METODE PENELITIAN
BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis Penelitian Penelitian ini merupakan penelitian murni yang dilakukan dengan metode deskriptif, yaitu suatu metode penelitian untuk membuat deskripsi, gambaran atau lukisan
Lebih terperinciHASIL DAN PEMBAHASAN bp bp bp
HASIL DAN PEBAHASAN Purifikasi dan Pengujian Produk PCR (Stilbena Sintase) Purifikasi ini menggunakan high pure plasmid isolation kit dari Invitrogen. Percobaan dilakukan sesuai dengan prosedur yang terdapat
Lebih terperinciBAB III METODE PENELITIAN
BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis penelitian Jenis penelitian yang dilakukan adalah penelitian dasar dengan metode deskriptif (Nazir, 1988). B. Populasi dan sampel Populasi pada penelitian ini adalah
Lebih terperinciBAB 4 HASIL PERCOBAAN DAN PEMBAHASAN
BAB 4 HASIL PERCOBAAN DAN PEMBAHASAN Sebelum melakukan PCR, terlebih dahulu dilakukan perancangan primer menggunakan program DNA Star. Pemilihan primer dilakukan dengan mempertimbangkan parameter spesifisitas,
Lebih terperinciHASIL DAN PEMBAHASAN
HASIL DAN PEMBAHASAN Pemotongan Parsial dan Penyisipan Nukleotida pada Ujung Fragmen DNA Konstruksi pustaka genom membutuhkan potongan DNA yang besar. Untuk mendapatkan fragmen-fragmen dengan ukuran relatif
Lebih terperinciBAB III METODE PENELITIAN
BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis Penelitian Metode penelitian yang digunakan pada penelitian ini adalah deskriptif. Penelitian deskriptif bertujuan untuk membuat deskripsi, gambaran, atau lukisan secara
Lebih terperinciIII. BAHAN DAN METODE
15 III. BAHAN DAN METODE 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan pada bulan November 2009 hingga Februari 2010. Tempat penelitian adalah di Laboratorium Reproduksi dan Genetika Organisme
Lebih terperinciLAPORAN PRAKTIKUM REKAYASA GENETIKA
LAPORAN PRAKTIKUM REKAYASA GENETIKA LAPORAN IV (ISOLASI RNA DARI TANAMAN) KHAIRUL ANAM P051090031/BTK BIOTEKNOLOGI SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2010 0 ISOLASI RNA DARI TANAMAN TUJUAN Tujuan
Lebih terperinciBAHAN DAN METODE. Gambar 7 Peta linier pbd80. B11. BamHI. SalI. pflap amp r GOI. pbd80 ColE oriv NPTIII LB NPTII Pro GOI Term RB pbd80
15 BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian berlangsung dari bulan Februari 2009 sampai Mei 2012 di Laboratorium Penelitian Fisiologi dan Biologi Molekular Tumbuhan serta Rumah Kaca Departemen
Lebih terperinciBAB II. BAHAN DAN METODE
BAB II. BAHAN DAN METODE 2.1 Kultur Bakteri Pembawa Vaksin Bakteri Escherichia coli pembawa vaksin DNA (Nuryati, 2010) dikultur dengan cara menginokulasi satu koloni bakteri media LB tripton dengan penambahan
Lebih terperinciVII. UJI EKSPRESI GEN TcAP1 (APETALA1 KAKAO) PADA TANAMAN MODEL. Abstrak
VII. UJI EKSPRESI GEN TcAP1 (APETALA1 KAKAO) PADA TANAMAN MODEL Abstrak Pada berbagai spesies termasuk kakao, gen AP1 (APETALA1) diketahui sebagai gen penanda pembungaan yang mengendalikan terbentuknya
Lebih terperinciBAB III METODE PENELITIAN
39 BAB III METODE PENELITIAN A. Desain Penelitian Penelitian yang dilakukan merupakan penelitian deskriptif. Penelitian membuat deskripsi secara sistematis, faktual dan akurat mengenai fakta-fakta dan
Lebih terperinciANALISA HASIL TRANSFORMASI DENGAN MENGGUNAKAN PCR KOLONI DAN RESTRIKSI
1 ANALISA HASIL TRANSFORMASI DENGAN MENGGUNAKAN PCR KOLONI DAN RESTRIKSI PENDAHULUAN Polimerase Chain Reaction (PCR) PCR adalah suatu reaksi invitro untuk menggandakan jumlah molekul DNA pada target tertentu
Lebih terperinciBAB III METODE PENELITIAN. Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental dengan 7 sampel dari 7
BAB III METODE PENELITIAN 3.1 Rancangan Penelitian Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental dengan 7 sampel dari 7 individu udang Jari yang diambil dari Segara Anakan Kabupaten Cilacap Jawa Tengah.
Lebih terperinciBAB III METODE PENELITIAN
25 BAB III METODE PENELITIAN 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian telah berlangsung sejak bulan Januari 2012 - Juli 2012 di Laboratorium Mikrobiologi, Lab. Optik, Lab. Genetika dan Lab. Biologi Molekuler Jurusan
Lebih terperinciIV. HASIL DAN PEMBAHASAN
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Isolasi Fragmen DNA Penyandi CcGH Mature Plasmid pgem-t Easy yang mengandung cdna GH ikan mas telah berhasil diisolasi. Hal ini ditunjukkan dengan adanya pita DNA pada ukuran
Lebih terperinciLAPORAN II (ISOLASI DNA GENOM)
LAPORAN PRAKTIKUM REKAYASA GENETIKA LAPORAN II (ISOLASI DNA GENOM) KHAIRUL ANAM P051090031/BTK BIOTEKNOLOGI SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2010 0 ISOLASI DNA GENOM TUJUAN 16s rrna. Praktikum
Lebih terperinciGambar 1. Skema penggolongan HIV-1 [Sumber: Korber dkk. 2001: ]
75 Gambar 1. Skema penggolongan HIV-1 [Sumber: Korber dkk. 2001: 22--25.] Gambar 2. Struktur virus HIV-1 [Sumber: Henriksen 2003: 12.] 76 Keterangan: 5 LTR : daerah 5 Long Terminal Region gag : gen gag
Lebih terperinciBAHAN DAN METODE. ditranskipsi dan produk translasi yang dikode oleh gen (Nasution 1999).
4 ditranskipsi dan produk translasi yang dikode oleh gen (Nasution 1999). Polymerase Chain Reaction (PCR) PCR merupakan suatu reaksi in vitro untuk menggandakan jumlah molekul DNA pada target tertentu
Lebih terperinciVISUALISASI HASIL PCR DENGAN METODE PCR LANGSUNG DAN TIDAK LANGSUNG PADA SAMPEL BAKTERI Pseudomonas fluorescens dan Ralstonia solanacearum
VISUALISASI HASIL PCR DENGAN METODE PCR LANGSUNG DAN TIDAK LANGSUNG PADA SAMPEL BAKTERI Pseudomonas fluorescens dan Ralstonia solanacearum Pendahuluan Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah suatu teknik
Lebih terperinciBAHAN DAN METODE. Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Juli 2007 sampai bulan Juni 2008 di
BAHAN DAN METODE : Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Juli 2007 sampai bulan Juni 2008 di 1. Laboratorium Bioteknologi Hewan dan Biomedis PPSHB IPB 2. Laboratorium Mikrobiologi
Lebih terperinciMETODE PENELITIAN Waktu dan Tempat Penelitian Bahan Metode penelitian Isolasi RNA total
METODE PENELITIAN Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilakukan mulai bulan Februari 2005 hingga bulan Maret 2008 di Laboratorium Biologi Molekuler dan Seluler Tanaman dan Laboratorium BIORIN (Biotechnology
Lebih terperinciKloning Domain KS dan Domain A ke dalam Sel E. coli DH5α. Analisis Bioinformatika. HASIL Penapisan Bakteri Penghasil Senyawa Antibakteri
3 selama 1 menit, dan elongasi pada suhu 72 0 C selama 1 menit. Tahap terakhir dilakukan pada suhu 72 0 C selama 10 menit. Produk PCR dielektroforesis pada gel agarosa 1 % (b/v) menggunakan tegangan 70
Lebih terperinciBAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Bahan Metode Isolasi C. gloeosporioides dari Buah Avokad
15 BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Balai Besar Karantina Pertanian (BBKP) Tanjung Priok Wilayah Kerja Bogor, mulai bulan Oktober 2011 sampai Februari 2012. Bahan
Lebih terperinciGambar 2 Vektor pengklonan pgem T Easy
BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan dari bulan September 2007 sampai dengan bulan April 2008. Penelitian dilakukan di Laboratorium Biologi Molekuler Seluler Tanaman, dan Laboratorium
Lebih terperinciHASIL DAN PEMBAHASAN Isolasi DNA Genomik Sengon
HASIL DAN PEMBAHASAN Isolasi DNA Genomik Sengon DNA genomik sengon diisolasi dari daun muda pohon sengon. Hasil uji integritas DNA metode 1, metode 2 dan metode 3 pada gel agarose dapat dilihat pada Gambar
Lebih terperinciBAHAN DAN METODE. Waktu dan Tempat
BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian dilakukan terhadap sampel yang dikoleksi selama tujuh bulan mulai September 2009 hingga Maret 2010 di Kabupaten Indramayu. Penelitian dilaksanakan di Laboratorium
Lebih terperinciBAHAN DAN METODE. tumefaciens LBA4404 yang membawa gen xyloglucanase, gen nptii, dan
BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian dilaksanakan di laboratorium Biologi Molekuler Tanaman, Pusat Penelitian Bioteknologi - LIPI, Cibinong, mulai bulan Agustus 2006 sarnpai dengan Agustus 2007.
Lebih terperinciKONSTRUKSI VEKTOR BINER GEN KAPPA(κ)-CARRAGEENASE DAN TRANSFORMASI KE Agrobacterium tumefaciens SEBAGAI MEDIA UNTUK PEMBUATAN RUMPUT LAUT TRANSGENIK
Jurnal Ilmu dan Teknologi Kelautan Tropis, Vol. 8, No. 1, Hlm. 335-344, Juni 2016 KONSTRUKSI VEKTOR BINER GEN KAPPA(κ)-CARRAGEENASE DAN TRANSFORMASI KE Agrobacterium tumefaciens SEBAGAI MEDIA UNTUK PEMBUATAN
Lebih terperinciBAB 3 PERCOBAAN. Alat elektroforesis agarosa (Biorad), autoklaf, cawan Petri, GeneAid High Speed Plasmid
BAB 3 PERCOBAAN 3.1 Alat Alat elektroforesis agarosa (Biorad), autoklaf, cawan Petri, GeneAid High Speed Plasmid Mini kit, inkubator goyang (GSL), jarum Ose bundar, kit GFX (GE Healthcare), kompor listrik
Lebih terperinciI. PENDAHULUAN. protein dalam jumlah besar (Reece dkk., 2011). kompeten biasanya dibuat dari inokulum awal dengan konsentrasi 2% ( v / v )
I. PENDAHULUAN A. Latar Belakang Penelitian Plasmid merupakan molekul DNA berukuran relatif kecil, melingkar, dan beruntai ganda. Plasmid membawa gen-gen yang terpisah dari kromosom bakteri. Plasmid digunakan
Lebih terperinciBAB III METODE PENELITIAN
BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis Penelitian Jenis penelitian ini adalah penelitian deskriptif yang mengangkat fenomena alam sebagai salah satu masalah dalam penelitian. Penelitian ini dapat menerangkan
Lebih terperinciBAB 3 PERCOBAAN 3.1 Bahan 3.2 Alat
BAB 3 PERCOBAAN 3.1 Bahan Bahan yang digunakan memiliki kualitas pro analisis atau pro biologi molekular, yaitu : primer M. tuberculosis forward: 5 GGATCCGATGAGCAAGCTGATCGAA3 (Proligo) dan primer M. tuberculosis
Lebih terperinci3. METODE PENELITIAN
19 3. METODE PENELITIAN 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Maret sampai Juni 2010 di Laboratorium Mikrobiologi, Biokimia dan Bioteknologi Hasil Perairan Departemen Teknologi Hasil
Lebih terperinciMATERI DAN METODE. Materi. Tabel 1. Sampel Darah Sapi Perah dan Sapi Pedaging yang Digunakan No. Bangsa Sapi Jenis Kelamin
MATERI DAN METODE Lokasi dan Waktu Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Genetika Molekuler Ternak, Bagian Pemuliaan dan Genetika, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Penelitian ini berlangsung
Lebih terperinciBAB III METODE PENELITIAN Bagan Alir Penelitian ini secara umum dapat digambarkan pada skema berikut:
BAB III METODE PENELITIAN Tahapan-tahapan yang dilakukan dalam penelitian ini adalah: pengumpulan sampel, lisis terhadap sampel mtdna yang telah diperoleh, amplifikasi daerah HVI mtdna sampel dengan menggunakan
Lebih terperinciI. PENDAHULUAN. genom sel tanaman adalah kloning gen. Proses ini dilakukan dengan
I. PENDAHULUAN A. LATAR BELAKANG Salah satu proses umum dalam manipulasi gen yang akan ditransfer ke genom sel tanaman adalah kloning gen. Proses ini dilakukan dengan menyisipkan gen target ke dalam vektor
Lebih terperinciBAB III METODE PENELITIAN
BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis penelitian Jenis penelitian ini adalah penelitian deskriptif yang mengangkat fenomena alam sebagai salah satu masalah dalam penelitian, sehingga dapat menerangkan arti
Lebih terperinciBAB 3 PERCOBAAN Mikroba C. violaceum, Bacillus cereus dan E. coli JM 109
9 BAB 3 PERCOBAAN 3.1 Alat, Bahan dan Miroba 3.1.1 Alat Bunsen, inkubator 37 o C, sentrifuga (Mikro 200R Hettich), Eppendorf 100 ul, 500 ul, 1,5 ml, tabung mikrosentrifuga (Eppendorf), neraca timbang (Mettler
Lebih terperinciPETUNJUK PRAKTIKUM BIOLOGI SEL DAN MOLEKULER Oleh: Ixora Sartika M ISOLASI DNA PLASMID
PETUNJUK PRAKTIKUM BIOLOGI SEL DAN MOLEKULER Oleh: Ixora Sartika M ixomerc@uny.ac.id ISOLASI DNA PLASMID Plasmid adalah DNA ekstrakromosom yang berbentuk sirkuler dan berukuran kecil (1 200 kb). Sebagian
Lebih terperinciBAB III METODE PENELITIAN. Penelitian ini merupakan penelitian yang dilakukan dengan metode
16 BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis Penelitian Penelitian ini merupakan penelitian yang dilakukan dengan metode deskriptif. Penelitian deskriptif adalah suatu metode penelitian untuk membuat deskripsi,
Lebih terperinciBAB III BAHAN DAN CARA KERJA. Penelitian dilakukan di Laboratorium Biologi Molekuler, Pusat
BAB III BAHAN DAN CARA KERJA A. LOKASI DAN WAKTU PENELITIAN Penelitian dilakukan di Laboratorium Biologi Molekuler, Pusat Penelitian Bioteknologi, LIPI, Cibinong selama 9 bulan (Maret 2008-- November 2008).
Lebih terperinciBAB III. METODOLOGI PENELITIAN. Pengambilan sampel. Penyiapan templat mtdna dengan metode lisis sel
16 BAB III. METODOLOGI PENELITIAN Bab ini menggambarkan tahapan penelitian yang terdiri dari pengambilan sampel, penyiapan templat mtdna dengan metode lisis sel, amplifikasi D-loop mtdna dengan teknik
Lebih terperinciHASIL DAN PEMBAHASAN. Hasil konfirmasi dicek dengan elektroforesis gel agarosa 1%.
reaction mix pada tabung mikro, kemudian program PCR dilanjutkan kembali dengan program PCR biasa: 94 o C selama 30 detik, 55 o C selama 1 menit, dan 72 o C selama 2 menit. Hasil konfirmasi dicek dengan
Lebih terperinciFAKULTAS BIOLOGI LABORATORIUM GENETIKA & PEMULIAAN INSTRUKSI KERJA UJI
ISOLASI TOTAL DNA TUMBUHAN DENGAN KIT EKSTRAKSI DNA PHYTOPURE Halaman : 1 dari 5 1. RUANG LINGKUP Metode ini digunakan untuk mengisolasi DNA dari sampel jaringan tumbuhan, dapat dari daun, akar, batang,
Lebih terperinciBAB III METODE PENELITIAN. Secara garis besar langkah-langkah yang dilakukan dalam penelitian ini
BAB III METODE PENELITIAN Secara garis besar langkah-langkah yang dilakukan dalam penelitian ini adalah: pengumpulan sampel; lisis terhadap sampel mtdna yang telah diperoleh; amplifikasi daerah D-loop
Lebih terperinciBAB III METODE PENELITIAN. Dalam penelitian ini dilakukan lima tahap utama yang meliputi tahap
BAB III METODE PENELITIAN Dalam penelitian ini dilakukan lima tahap utama yang meliputi tahap penyiapan templat mtdna, amplifikasi fragmen mtdna pada daerah D-loop mtdna manusia dengan teknik PCR, deteksi
Lebih terperinciBAB in. METODE PENELITIAN
BAB in. METODE PENELITIAN Waktu Dan Tempat Penelitian Penelitian ini telah dilakukan dari April sampai November 2009 di laboratorium Biologi Molekular dan Rekayasa Genetika, Balai Penelitian Bioteknologi
Lebih terperinciBAB 4 HASIL PERCOBAAN DAN BAHASAN. Oligonukleotida sintetis daerah pengkode IFNα2b sintetis dirancang menggunakan
BAB 4 HASIL PERCOBAAN DAN BAHASAN Oligonukleotida sintetis daerah pengkode IFNα2b sintetis dirancang menggunakan program komputer berdasarkan metode sintesis dua arah TBIO, dimana proses sintesis daerah
Lebih terperinciPERAKITAN VEKTOR EKSPRESI PROTEIN G SUBUNIT α DARI KEDELAI (Glycine max) KULTIVAR SLAMET RIAN PRATIWI
PERAKITAN VEKTOR EKSPRESI PROTEIN G SUBUNIT α DARI KEDELAI (Glycine max) KULTIVAR SLAMET RIAN PRATIWI DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2012
Lebih terperinciBAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penyediaan Isolat dan Karakterisasi Bakteri Xanthomonas campestris
12 BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian dilaksanakan mulai Nopember 2011 sampai dengan Maret 2012 di Laboratorium Bakteriologi Tumbuhan dan Laboratorium Fisiologi dan Toksikologi Serangga Departemen
Lebih terperinciBAB V HASIL DAN PEMBAHASAN
21 BAB V HASIL DAN PEMBAHASAN Pada penelitian sebelumnya diperoleh kerangka baca terbuka gen IFNα2b yang mengandung tiga mutasi dengan lokasi mutasi yang letaknya berjauhan, sehingga mutagenesis terarah
Lebih terperinciBAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN. A. SINTESIS DAN AMPLIFIKASI FRAGMEN GEN tat HIV-1 MELALUI
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN A. SINTESIS DAN AMPLIFIKASI FRAGMEN GEN tat HIV-1 MELALUI TEKNIK PCR OVERLAPPING 1. Sintesis dan amplifikasi fragmen ekson 1 dan 2 gen tat HIV-1 Visualisasi gel elektroforesis
Lebih terperinciHASIL DAN PEMBAHASAN
19 HASIL DAN PEMBAHASAN Vektor Kloning Protein rgh Isolasi Plasmid cdna GH. Plasmid pgem-t Easy yang mengandung cdna; El-mGH, Og-mGH dan Cc-mGH berhasil diisolasi dari bakteri konstruksi E. coli DH5α dengan
Lebih terperinciIII. METODE PENELITIAN
III. METODE PENELITIAN 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan November 2007 hingga Juli 2009, bertempat di Laboratorium Reproduksi dan Genetika Organisme Akuatik Departemen
Lebih terperinciBAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Bahan dan Alat Metode Penelitian Isolasi Aktinomiset
BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Bakteriologi Tumbuhan, Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor, dari bulan Februari sampai dengan
Lebih terperinciGen Kitinase. A. tumefaciens. Transformasi. T. harzianum DT38. Transforman. -PCR -Southern blot. Aktivitas enzim kitinase pd transforman
13 ALUR PENELITIAN gpd Gen Kitinase trpc E.coli 1,5 Kb A. tumefaciens T. harzianum DT38 Transforman Transformasi Aktivitas enzim kitinase pd transforman Tri Parental Mating Seleksi dgn higromisin -PCR
Lebih terperinciMETODE PENELITIAN. Tabel 1 Sampel yang digunakan dalam penelitian
12 METODE PEELITIA Waktu dan Tempat Penelitian dilaksanakan pada bulan Mei sampai dengan April 2010, bertempat di Bagian Fungsi Hayati dan Perilaku Hewan, Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu
Lebih terperinciAsam Asetat Glacial = 5,7 ml EDTA 0,5 M ph 8.0 = 10 ml Aquades ditambahkan hingga volume larutan 100 ml
36 Lampiran 1. Pembuatan Larutan Stok dan Buffer A. Pembuatan Larutan Stok Tris HCL 1 M ph 8.0 (100 ml) : Timbang Tris sebanyak 12,114 g. Masukkan Tris ke dalam Erlenmeyer dan ditambahkan 80 ml aquades.
Lebih terperinciLAMPIRAN. Lampiran 1. Pembuatan Larutan Stok dan Buffer
LAMPIRAN Lampiran 1. Pembuatan Larutan Stok dan Buffer A. LARUTAN STOK CTAB 5 % (100 ml) - Ditimbang NaCl sebanyak 2.0 gram - Ditimbang CTAB sebanyak 5.0 gram. - Dimasukkan bahan kimia ke dalam erlenmeyer
Lebih terperinciBAB III METODE PENELITIAN. amplifikasi daerah HVI mtdna sampel dengan menggunakan teknik PCR;
BAB III METODE PENELITIAN Secara garis besar, langkah-langkah yang dilakukan dalam penelitian ini adalah: pengumpulan sampel; lisis terhadap sampel mtdna yang telah diperoleh; amplifikasi daerah HVI mtdna
Lebih terperinciBAHAN DAN METODE. Ekstraksi Senyawa Antimikrob
BAHAN DAN METODE Mikrob yang Digunakan dalam Penelitian Tiga isolat bakteri simbion spons yang digunakan dalam penelitian ini adalah isolat HAL-13, HAL-74, dan HAA-01. Ketiga isolat tersebut merupakan
Lebih terperinciII. MATERI DAN METODE. Tempat pengambilan sampel daun jati (Tectona grandis Linn. f.) dilakukan di
II. MATERI DAN METODE 2.1 Waktu dan Tempat Penelitian Tempat pengambilan sampel daun jati (Tectona grandis Linn. f.) dilakukan di enam desa yaitu tiga desa di Kecamatan Grokgak dan tiga desa di Kecamatan
Lebih terperinciBAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN. Isolasi DNA genom tanaman padi T0 telah dilakukan pada 118
45 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN A. HASIL Isolasi DNA genom tanaman padi T0 telah dilakukan pada 118 sampel. Berdasarkan hasil digesti DNA dengan enzim EcoRI, diperoleh sebanyak 74 sampel tanaman dari 118
Lebih terperinciBAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Bahan dan Alat
12 BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian ini dilakukan dari bulan April 2006 sampai dengan bulan April 2007. Penelitian dilakukan di rumah kaca, laboratorium Biologi Molekuler Seluler Tanaman, dan
Lebih terperinciPERBAIKAN METODE INTRODUKSI GEN PADA Kappaphycus alvarezii. IMPROVEMENT METHOD OF GENE TRANSFER IN Kappaphycus alvarezii. *
Jurnal Ilmu dan Teknologi Kelautan Tropis, Vol. 8, No. 1, Hlm. 249-258, Juni 2016 PERBAIKAN METODE INTRODUKSI GEN PADA Kappaphycus alvarezii IMPROVEMENT METHOD OF GENE TRANSFER IN Kappaphycus alvarezii
Lebih terperinciSINTESIS DAN PENGKLONAAN FRAGMEN GEN tat (TRANSAKTIVATOR) HIV-1 KE DALAM VEKTOR EKSPRESI PROKARIOT pqe-80l EKAWATI BETTY PRATIWI
SINTESIS DAN PENGKLONAAN FRAGMEN GEN tat (TRANSAKTIVATOR) HIV-1 KE DALAM VEKTOR EKSPRESI PROKARIOT pqe-80l EKAWATI BETTY PRATIWI 0304040257 UNIVERSITAS INDONESIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN
Lebih terperinciPengertian TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN. Cloning DNA. Proses rekayasa genetik pada prokariot. Pemuliaan tanaman konvensional: TeknologiDNA rekombinan:
Materi Kuliah Bioteknologi Pertanian Prodi Agroteknologi Pertemuan Ke 9-10 TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN Ir. Sri Sumarsih, MP. Email: Sumarsih_03@yahoo.com Weblog: Sumarsih07.wordpress.com Website: agriculture.upnyk.ac.id
Lebih terperinciBAB 4 HASIL PERCOBAAN DAN BAHASAN
14 BAB 4 HASIL PERCOBAAN DAN BAHASAN Konfirmasi bakteri C. violaceum dan B. cereus dilakukan dengan pewarnaan Gram, identifikasi morfologi sel bakteri, sekuensing PCR 16s rdna dan uji kualitatif aktivitas
Lebih terperinciBAB IX. DASAR-DASAR TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN
BAB IX. DASAR-DASAR TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN Di dalam bab ini akan dibicarakan pengertian teknologi DNA rekombinan beserta tahapan-tahapan kloning gen, yang secara garis besar meliputi isolasi DNA kromosom
Lebih terperinciII. METODE PENELITIAN
II. METODE PENELITIAN 1. Materi, Lokasi, dan Waktu Penelitian 1.1. Materi Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah botol sampel, cawan petri, tabung reaksi, labu Erlenmeyer, beaker glass, object
Lebih terperinciMETODE PENELITIAN. Survei dan Pendataan
METODE PENELITIAN Tempat dan Waktu Penelitian Kegiatan identifikasi penyebab penyakit umbi bercabang pada wortel dilakukan di Laboratorium Nematologi dan Laboratorium Virologi Departemen Proteksi Tanaman
Lebih terperinciDi dalam bab ini akan dibicarakan pengertian teknologi DNA rekombinan. beserta tahapan-tahapan kloning gen, yang secara garis besar meliputi
Di dalam bab ini akan dibicarakan pengertian teknologi DNA rekombinan beserta tahapan-tahapan kloning gen, yang secara garis besar meliputi isolasi DNA kromosom dan DNA vektor, pemotongan DNA menggunakan
Lebih terperinciII. BAHAN DAN METODE. Betina BEST BB NB RB. Nirwana BN NN RN. Red NIFI BR NR RR
II. BAHAN DAN METODE Ikan Uji Ikan uji yang digunakan adalah ikan nila hibrida hasil persilangan resiprok 3 strain BEST, Nirwana dan Red NIFI koleksi Balai Riset Perikanan Budidaya Air Tawar Sempur, Bogor.
Lebih terperinciBAB III METODE A. Jenis Penelitian B. Populasi dan Sampel C. Waktu dan Lokasi Penelitian D. Alat dan Bahan Rizki Indah Permata Sari,2014
34 BAB III METODE A. Jenis Penelitian Penelitian ini merupakan penelitian murni atau pure research yang dilakukan dengan metode deskriptif, yaitu suatu metode penelitian untuk membuat deskripsi, gambaran
Lebih terperinciIV. HASIL DAN PEMBAHASAN
24 IV. HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Hasil 4.1.1 Perhitungan Kepadatan Artemia dan Kutu Air serta Jumlah Koloni Bakteri Sebanyak 1,2 x 10 8 sel bakteri hasil kultur yang membawa konstruksi gen keratin-gfp ditambahkan
Lebih terperinciBAB III METODE PENELITIAN
BAB III METODE PENELITIAN 3.1 Rancangan Penelitian Penelitian tentang Pengaruh Suhu Annealing pada Program PCR terhadap Keberhasilan Amplifikasi DNA Udang Jari (Metapenaeus elegans) Laguna Segara Anakan
Lebih terperinciBAB III METODOLOGI PENELITIAN. Penelitian akan diawali dengan preparasi alat dan bahan untuk sampling
16 BAB III METODOLOGI PENELITIAN Penelitian akan diawali dengan preparasi alat dan bahan untuk sampling sel folikel akar rambut. Sampel kemudian dilisis, diamplifikasi dan disekuensing dengan metode dideoksi
Lebih terperinciLampiran 1 Ekstraksi dan isolasi DNA dengan metode GeneAid
LAMPIRAN 9 Lampiran 1 Ekstraksi dan isolasi DNA dengan metode GeneAid Satu ruas tungkai udang mantis dalam etanol dipotong dan dimasukkan ke dalam tube 1,5 ml. Ruas tungkai yang telah dipotong (otot tungkai)
Lebih terperinciMATERI DAN METODE. Materi
MATERI DAN METODE Lokasi dan Waktu Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Genetika Molekuler Ternak, Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan, Fakultas Peternakan IPB dan Laboratorium Terpadu,
Lebih terperinciTUGAS TERSTRUKTUR BIOTEKNOLOGI PERTANIAN VEKTOR DNA
TUGAS TERSTRUKTUR BIOTEKNOLOGI PERTANIAN VEKTOR DNA Oleh: Gregorius Widodo Adhi Prasetyo A2A015009 KEMENTERIAN RISET TEKNOLOGI DAN PENDIDIKAN TINGGI UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN FAKULTAS PERTANIAN PROGRAM
Lebih terperinci3 METODOLOGI 3.1 Waktu dan Tempat 3.2 Bahan dan Alat
3 METODOLOGI 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian Autentikasi Bahan Baku Ikan Tuna (Thunnus sp.) dalam Rangka Peningkatan Keamanan Pangan dengan Metode Berbasis DNA dilaksanakan pada bulan Januari sampai dengan
Lebih terperinci