BAB I PENDAHULUAN. baik berupa cairan, serbuk, maupun granul, dalam cangkang lunak maupun keras

Transkripsi

1 BAB I PENDAHULUAN A. Latar Belakang Masalah Kapsul merupakan bentuk sediaan padat yang mengandung bahan aktif, baik berupa cairan, serbuk, maupun granul, dalam cangkang lunak maupun keras untuk diberikan peroral (Gunsel, 1976). Bentuk sediaan obat yang beredar di pasaran 10% berupa kapsul (Augsburger, 1990). Cangkang kapsul yang licin dapat mempermudah pasien menelan obat. Selain itu, cangkang kapsul juga dapat menutupi rasa dan bau yang tidak menyenangkan dari obat, sehingga dapat meningkatkan kepatuhan pasien dalam minum obat (Agrawal, 2007). Cangkang kapsul dibedakan menjadi 2 jenis, yaitu cangkang lunak dan cangkang keras (Karteek, 2011). Komponen utama cangkang tersebut adalah gelatin. Gelatin merupakan protein yang dihasilkan dari proses hidrolisis parsial jaringan kolagen yang dapat diekstraksi dari kulit, jaringan konektif, dan tulang hewan ternak, termasuk ikan dan unggas (USP34, 2011). Hewan yang sering digunakan adalah babi, sapi, dan ikan (GMIA, 2012). Campuran tulang dan kulit babi mampu menghasilkan kapsul kualitas terbaik dibanding formula lain. Gelatin tulang babi menghasilkan karakteristik kapsul dengan lapisan film kencang dan tidak mudah rapuh, sedangkan gelatin kulit babi memberikan karakteristik kapsul yang jernih, sehingga formula campuran ter sebut menghasilkan kapsul kualitas tinggi (Agrawal, 2007). 1

2 Berdasarkan data Badan Pusat Statistik tahun 2007, jumlah impor gelatin di Indonesia mencapai kg senilai dolar AS. Laporan statistik tersebut memberikan kekhawatiran bagi masyarakat Indonesia yang sebagian besar beragama Islam. Dalam Al-Qur an surah Al-Maidah ayat 3, terdapat larangan bagi umat islam, untuk mengonsumsi segala bentuk produk olahan yang menggunakan babi dan hewan yang disembelih di luar tata cara islam. Oleh karena itu dibutuhkan metode analisis identifikasi yang tepat terhadap sumber gelatin pada berbagai produk olahan yang beredar di Indonesia, salah satunya adalah kapsul. Real Time Polymerase Chain Reaction atau disebut juga quantitative Polymerase Chain Reaction (qpcr) merupakan metode analisis DNA yang sesuai untuk mendeteksi sampel dalam jumlah sedikit, termasuk sampel dalam produk olahan, dengan memberikan data kualitatif dan kuantitatif sekaligus. Prinsip kerja PCR secara umum adalah mengamplifikasi fragmen spesifik DNA target dalam sampel melalui reaksi enzimatis dengan menggunakan sepasang primer spesifik (Joshi dkk., 2010). Rancangan primer spesifik merupakan topik penelitian yang menarik untuk analisis identifikasi menggunakan qpcr secara selektif, spesifik, dan efektif. Berdasarkan penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh Wardani (2014), terkait analisis identifikasi gelatin babi dalam cangkang kapsul komersial menggunakan primer spesifik D-loop babi dengan metode qpcr dengan panjang amplikon 108 pb memberikan hasil negatif, yang berarti bahwa sampel yang diuji 2

3 tidak mengandung DNA babi. Akan tetapi, hakikatnya hasil negatif dari suatu pengujian untuk penjaminan halal perlu dilakukan konfirmasi, agar konsumen yakin bahwa DNA yang terkandung dalam suatu produk berasal dari spesies yang halal. Oleh karena itu diperlukan metode konfirmasi yang secara spesifik dapat mendeteksi keberadaan DNA yang berasal dari hewan halal dan banyak digunakan sebagai sumber pem buatan gelatin, yakni DNA sapi (bovine). Beberapa penelitian terkait identifikasi DNA sapi menggunakan metode PCR telah banyak dilakukan. Diantaranya, Jerilyn dkk. (2003) yang berhasil merancang primer spesifik terhadap genom mt-dna sapi dengan panjang amplikon 98 pb. Kemudian Chun-Lai dkk. (2007) telah berhasil merancang primer spesifik terhadap DNA mitokondria (mt-dna) sapi daerah sitokrom b (cyt-b) untuk menguantifikasi DNA sapi yang terkandung dalam daging, susu, dan keju dengan metode qpcr menggunakan pelacak Taqman. Penelitian terbaru dilakukan oleh Anita dkk. (2016) yang merancang primer spesifik terhadap m t- DNA sapi daerah sitokrom oksidase subunit I (COI) dengan panjang amplikon 255 pb untuk mengidentifikasi DNA sapi dalam campuran daging. Keterbaruan pada penelitian ini adalah merancang primer spesifik terhadap fragmen gen D-loop bovine dengan panjang amplikon pb, sehingga primer yang dirancang lebih spesifik terhadap DNA sapi meskipun sampel dalam jumlah sedikit. Penelitian ini diharapkan dapat menjadi referensi primer spesifik untuk melakukan konfirmasi hasil analisis identifikasi menggunakan primer spesifik 3

4 terhadap DNA babi yang memberikan hasil negatif, dengan primer spesifik terhadap DNA sapi menggunakan metode qpcr. B. Rumusan Masalah 1. Apakah primer yang di rancangan, yakni primer D-loop 575 dan D- loop 93 spesifik dan selektif terhadap fragmen gen D-loop dari DNA mitokondria bovine? 2. Apakah metode yang digunakan memenuhi kriteria validasi untuk identifikasi DNA sapi dalam cangkang kapsul? 3. Apakah metode konfirmasi yang dirancang dapat diaplikasikan pada sampel cangkang kapsul yang beredar di Yogyakarta untuk membuktikan keberadaan DNA gelatin sapi pada sampel tersebut? C. Urgensi Penelitian Penelitian ini sangat penting dalam kaitannya dengan metode analisis identifikasi DNA babi menggunakan qpcr dengan primer spesifik dalam berbagai produk untuk mengeluarkan status halal. Hasil negatif dari penelitian tersebut masih perlu dikonfirmasi menggunakan primer spesifik terhadap DNA sapi untuk membuktikan bahwa ketidakberadaan DNA babi menunjukkan DNA sapi benar-benar terdapat dalam produk tersebut. Penelitian ini juga diharapkan dapat memberikan data ilmiah yang valid mengenai sumber gelatin dalam cangkang kapsul yang beredar di Indonesia, khususnya Yogyakarta, dan dapat 4

5 dipublikasikan dalam jurnal ilm iah. Aplikasi dari metode ini juga sangat berguna untuk menjamin keaslian cangkang kapsul terutama dari kontaminasi silang maupun pemalsuan. D. Tujuan Penelitian 1. Tujuan Umum Merancangan primer spesifik terhadap DNA sapi untuk pengujian konfirmasi kehalalan berbagai produk dengan metode PCR. 2. Tujuan Khusus a. Mengetahui spesifitas dan selektivitas primer yang dirancang terhadap fragmen gen D-loop dari DNA mitokondria bovine. b. Memvalidasi metode quantitative PCR untuk identifikasi DNA sapi dalam cangkang kapsul. c. Mengaplikasikan metode konfirmasi yang dirancang pada sampel cangkang kapsul pasaran yang beredar di Yogyakarta untuk membuktikan keberadaan DNA gelatin sapi pada sampel tersebut. E. TINJAUAN PUSTAKA 1. Gelatin Gelatin merupakan polipeptida hasil hidrolisis parsial kolagen yang didapatkan dari kulit, jaringan konektif, dan tulang hewan, seperti sapi, babi, ikan, dan bahkan serangga (Morison dkk., 1999; Abdelfadeel, 2012). Sumber gelatin 5

6 terbesar berasal dari mamalia, yaitu kulit babi (46%), kulit sapi (29,4%), serta tulang babi dan sapi (23,1%) (Gomez-Guillen dkk., 2009). Berdasarkan katalis proses hidrolisisnya, gelatin mamalia dibedakan menjadi dua, yaitu tipe A dan tipe B (Rabadiya, 2013). Gelatin tipe A adalah gelatin yang diekstraksi dari kulit/tulang babi dengan menggunakan katalis asam yang menghasilkan titik isoelektrik (pi) pada ph ~7-9, sedangkan gelatin tipe B diekstraksi dari kulit/tulang sapi dengan katalis basa yang menghasilkan pi pada ph ~4-5 (Rabadiya, 2013; GMIA, 2012). Gelatin merupakan hidrokoloid yang paling banyak digunakan dalam produk farmasi dan makanan (G udmundsson, 2002), karena mengandung asam - asam amino esensial kecuali triptofan yang mudah dicerna, tidak toksik, dapat membentuk lapisan film yang kuat dan fleksibel, dengan strukturnya yang homogen (Ladislaus dkk., 2007; Agrawal, 2007). Komposisi asam amino dari tiap sumber gelatin berbeda-beda, namun semua sumber gelatin sebagian besar asam amino penyusunnya adalah glisin, prolin, dan hidroksiprolin (Gilsenan dan Ross- Murphy, 2000). Gelatin dipilih sebagai bahan dasar pembuatan kapsul karena kemudahannya berubah dari bentuk larutan menjadi bentuk gel pada suhu tepat d i atas suhu ruang, sehingga memungkinkan terbentuknya lapisan film yang cepat pada cetakan (Agrawal, 2007). Gelatin kapsul cukup dapat membantu melindungi bahan aktif obat dari reaksi oksidasi serta menutupi rasa dan bau yang tidak menyenangkan dari bahan aktif obat (Agrawal, 2007; Nishimoto dkk., 2005). 6

7 Tabel 1. Komposisi Asam Amino dalam Gelatin (%) Jenis Protein Tipe A (kulit babi) Tipe B (kulit sapi) Tipe B (tulang sapi) Alanin 8,6 10,7 9,3 11,0 10,1 14,2 Arginin 8,3 9,1 8,55 8,8 5,0 9,0 Asam Aspartat 6,2 6,7 6,6 6,9 4,6 6,7 Sistein 0,1 Kelumit Asam Glutamat 11,3 11,7 11,1 11,4 8,5 11,6 Glisin 26,4 30,5 26,9 27,5 24,5 28,8 Histidin 0,9 1,0 0,74 0,8 0,4 0,7 Hidroksilisin 1,0 kelumit 0,91 1,2 0,7 0,9 Hidroksiprolin 13,5 kelumit 14,0 14,5 11,9 13,4 Isoleusin 1,4 kelumit 1,7 1,8 1,3 1,5 Leusin 3,1 3,3 3,1 3,4 2,8 3,5 Lisin 4,1 5,2 4,5 4,6 2,1 4,4 Metionin 0,8 0,9 0,8 0,9 0,0 0,6 Fenilalanin 2,1 2,6 2,2 2,5 1,3 2,5 Prolin 16,2 18,0 14,8 16,4 13,5 15,5 Serin 2,9 4,1 3,2 4,2 3,4 3,8 Treonin 2,2 kelumit 2,2 kelumit 2,0 2,4 Tirosin 0,4 0,9 0,2 1,0 0,0 0,2 Gelatin dapat larut dalam air pada suhu > 40 o C, namun akan membentuk gel pada suhu <35 o C. Dalam proses pembentukan gel, struktur gelatin mengalami perubahan konformasi dari struktur primer (random coil) menjadi struktur sekunder (α-helix), untuk kembali membentuk struktur awal kolagen berupa triple-α-helix melalui pembentukan ikatan hidrogen intra dan inter rantai peptida, sehingga terbentuk anyaman/crosslink (Djabourov dkk., 1983). Perubahan konformasi struktur gelatin diilustrasikan pada Gambar 1. 7

8 triple-α- Susunan asam amino tripleα-helix dengan ikatan hidrogen intra dan inter rantai peptida Struktur ball-stick triple-α-helix Gambar 1. Perubahan konformasi struktur gelatin Berdasarkan jenis cangkangnya, kapsul dibedakan menjadi dua, yaitu kapsul cangkang keras dan kapsul cangkang lunak (Agrawal, 2007). Sebagian besar kapsul terbuat dari cangkang keras, karena biaya produksi yang lebih rendah daripada cangkang lunak, sedangkan cangkang lunak biasanya diproduksi untuk bahan aktif yang mudah menguap, dan mudah terhidrolisis (Granger, 1980; Patel dkk., 1989). Selain itu, kapsul lunak diformulasikan untuk tujuan khusus, yaitu meningkatakan bioavailabilitas obat-obat hidrofobik (Agrawal, 2007). Kapsul cangkang keras terbuat dari campuran gelatin, gula dan air, yang menghasilkan karakteristik cangkang yang bersih (tidak keruh), tidak 8

9 berwarna dan hambar (Rabadiya, 2013). Kapsul cangkang lunak terbuat dari gelatin dan air dengan tambahan alkohol polihidrat sebagai plasticizer seperti gliserol dan sorbitol yang memberikan karakteristik fleksibel pada cangkang kapsul yang dihasilkan (Rabadiya, 2013). 2. Quantitative Polymerase Chain Reaction (qpcr) Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan teknik analisis di bidang biologi molekuler dengan mengamplifikasi secara eksponensial terhadap sekuen dari rantai tunggal atau rantai ganda DNA melalui reaksi enzimatik secara in vitro (Saiki dkk., 1985; Joshi, 2010). Saat ini, penggunaan teknik PCR tidak hanya terbatas pada analisis biologi molekuler, seperti kloning DNA, deteksi ekspresi gen, diagnosis dibidang forensik dan medis, serta pola ekspresi gen dalam kaitannya dengan polimorfirsme, namun teknik ini telah berkembang untuk analisis di berbagai bidang, seperti analisis halal produk olahan, dan deteksi bakteri patogen serta virus virulen dalam makanan maupun dalam cairan hayati (Somma dan Querci, 2006). Prinsip teknik PCR sama seperti mekanisme replikasi DNA secara in vivo, mulai dari denaturasi DNA menjadi rantai tunggal, duplikasi dan pembentukan rantai ganda DNA kembali (Somma dan Querci, 2006), sehingga dalam teknik PCR pun juga terdapat tiga tahap utama, yaitu: denaturasi, penempelan (annealing), pemanjangan (extention) (Joshi, 2010). Pada tahap pertama, DNA 9

10 didenaturasi menggunakan suhu tinggi (90 97 o C) agar menjadi rantai tunggal yang memungkinkan primer menempel pada rantai tunggal DNA, pada fragmen spesifik yang akan diamplifikasi (Joshi, 2010). Primer merupakan sepasang sekuen oligonukleotida yang komplemen terhadap sekuen target dari cetakan DNA (DNA template), sehingga mampu mengapit cetakan DNA dari arah depan (forward) dan belakang (reverse) untuk diamplifikasi dengan bantuan enzim (Somma dan Querci, 2006; Saiki dkk., 1985). Tahap selanjutnya adalah tahap penempelan (annealing) primer pada fragmen spesifik dari cetakan DNA, dengan suhu lebih rendah daripada suhu denaturasi (Joshi, 2010). Tahap terakhir adalah tahap pemanjangan (extention) sekuen DNA target melalui primer dengan penambahan nukleotida (dntp) menggunakan DNA polimerase dengan katalis ion Mg 2+ pada suhu sekitar 72 o C (Somma dan Querci, 2006; Joshi, 2010). 10

11 Suhu 100 Denaturasi Pemanjangan 70 Penempelan Waktu Gambar 2. Siklus suhu di tiap tahap metode PCR : (1) Pada suhu 95 o C terjadi pengubahan DNA menjadi rantai tunggal, (2) pada suhu lebih rendah terjadi penempelan primer, (3) pada suhu 72 o C enzim polimerase melakukan pemanjangan sekuen DNA target. (Molecular Aspects of Medicine, 2006) QPCR merupakan teknik variasi dari PCR konvensional, yang telah banyak digunakan untuk menguantifikasi DNA atau RNA dalam sampel, dengan menggunakan primer/probe fluoresen atau pewarna DNA yang berfluoresen, sehingga jumlah amplikon yang terbentuk dapat diamati pada saat siklus sedang berlangsung (real time), oleh karena itu disebut juga quantitative-pcr (qpcr) (Anonim a, 2012). Senyawa berfluoresen yang digunakan dapat berikatan dengan amplikon yang terbentuk, sehingga menghasilkan sinyal yang intensitasnya proporsional dengan jumlah amplikon yang terbentuk. Intensitas sinyal fluoresen yang tinggi menunjukkan banyaknya amplikon yang dihasilkan (Kubista dkk., 2001). Di permulaan siklus, sinyal fluoresen yang terbentuk sangat lemah dan diganggu oleh sinyal pengganggu (noise), kemudian semakin kuat seiring dengan 11

12 semakin banyak amplikon yang terakumulasi secara eksponensial dalam sik lus reaksi PCR, dan akhirnya akan mencapai titik jenuh saat primer, senyawa fluoresen, maupun dntp telah berkurang banyak (Kubista dkk., 2001). Kemudian peningkatan sinyal fluoresensi dari tiap siklus amplifikasi dihubungkan dengan nomor siklus dalam suatu kurva amplifikasi qpcr (Smith dan Osborn, 2008). Analisis kurva qpcr didasarkan atas tiga parameter penting, yaitu garis dasar (baseline), garis ambang batas (threshold), dan nilai threshold cycle (Ct atau Cq). Baseline ditentukan dari sinyal yang ditemukan di daerah awal terjadinya amplifikasi, yang bebas dari intervensi sinyal pengganggu (noise), biasanya muncul pada siklus ke-3 sampai ke-15. Baseline ditentukan dengan hati-hati, agar menghasilkan siklus ambang batas (Threshold cycle / Ct) yang akurat (Anonim a, 2012). Threshold merupakan nilai ambang yang terletak pada fase linier dan di atas sinyal tertinggi dari nilai baseline atau 10 kali dari sinyal baseline dan dapat dimunculkan secara otomatis pada kurva melalui pengaturan instrumen (Anonim a, 2012). Threshold cycle (Ct) adalah suatu sinyal yang menunjukkan perpotongan antara respon fluoresensi sampel dengan nilai ambang rata-rata (threshold) pada siklus tertentu (Shipley, 2007). Semakin besar jum lah DNA cetakan awal maka semakin cepat mencapai nilai ambang, artinya semakin cepat mendapat nilai Ct, sehingga muncul pada nomor siklus yang kecil (Shipley, 2007). Nilai Ct yang diperoleh dari tiap siklus kemudian dirajahkan terhadap logaritma pengenceran masa senyawa standar berupa DNA/RNA murni ( log 12

13 input), sebagai kurva standar, sehingga diperoleh persamaan regresi linier (Fraga dkk., 2008). Berdasarkan persamaan regresi tersebut dapat diestimasikan efisiensi primer (E) dalam mengamplifikasi DNA cetakan untuk menghasilkan amplikon yang murni hanya mengandung fragmen target, melalui slope (k) yang dihasilkan, dengan menggunakan rum us E = (10-1/k 1) x 100% (Rutledge dan Cote, 2003). Intersep kurva standar menunjukkan konsentrasi senyawa standar yang hanya mengandung satu molekul target, dengan kata lain intersep merupakan parameter batas deteksi (Limit of Detection / LoD) (Akane dkk., 1994; Izraeli dkk., 1991; Al- Soud dkk., 2000). 13

14 Fluoresens Ct Ct = 25 DNA= 5 Log Jum lah DNA Gambar 3. Ilustrasi Kurva Hasil Kuantifikasi DNA dengan metode qpcr. Dengan membandingakan nilai Ct dari sampel dengan kurva standar, maka jumlah DNA sampel dapat diketahui. Nilai efisiensi ~100% dengan slope -3.3 menunjukkan sensitivitas yang baik. (qpcr guide from IDT, 2012) Baselin e Threshol Batas deteksi (Ct) Nomor Siklus Gambar 4. Ilustrasi kurva hasil amplifikasi DNA. Prinsip deteksi fluoresensi pada qpcr dan pengukuran konsentrasi amplikon target menggunakan Ct. Nilai Ct berbanding terbalik dengan jumlah awal DNA cetakan. Jumlah awal DNA cetakan tertinggi (sampel 1) berkorelasi dengan Ct yang muncul pada siklus reaksi nomor terkecil (Ct 1 ). (qpcr guide from IDT, 2012) 14

15 3. SYBR Green Real Time PCR (qpcr) dapat menguantifikasi amplikon yang terbentuk dengan menggunakan senyawa fluoresen sebagai pelapor sinyalnya (Fraga dkk., 2008). Senyawa fluoresen yang banyak digunakan salah satunya adalah SYBR Green (Wittwer dkk., 1997). SYBR Green pada Gambar 5 merupakan senyawa cyanine asimetris yang memiliki dua cincin aromatis yang dihubungkan oleh jembatan metena, dan masing-masing cincin mengandung atom nitrogen, dan salah satunya bermuatan positif (Nygren dkk., 1998). Gambar 5. Struktur molekul SYBR Green (digambar ulang menggunakan Chem Draw, 2016) SYBR Green ini tidak dapat berfluoresensi ketika berada dalam bentuk bebas dalam larutan, karena vibrasi dari cincin-cincin aromatisnya mampu mengubah energi eksitasi elektron menjadi energi panas dan disebarkan dalam 15

16 larutan (Nygren dkk., 1998). Ketika SYBR Green berada dalam larutan yang mengandung double stranded DNA (ds-dna), maka SYBR Green dapat terikat pada ds-dna dan akan memancarkan sinyal fluoresen pada panjang gelombang 520 nm. Hal ini dikarenakan SYBR Green mampu mengadakan interkalasi pada ds-dna melalui basa nukleotida yang berdekatan, sehingga vibrasi dari cincincincin aromatisnya sangat terbatas dan terjadi eksitasi elektron ke tingkat yang lebih tinggi pada panjang gelombang 254 dan 497 nm (Smith dan Osborn, 2008; Nygren dkk., 1998). Fluoresensi akan meningkat seiring dengan banyaknya rantai ganda DNA yang terbentuk (Jansen dkk., 1993). Karakterisasi level fluoresensi yang dihasilkan oleh SYBR Green dapat dilihat melalui nilai Ct, yaitu pada siklus amplifikasi fragmen DNA pertama kali terdeteksi (Adams, 2006). Fase peningkatan fluoresensi digambarkan melalui kurva amplifikasi yang menunjukkan tiga fase, yaitu fase inisiasi, fase eksponensial, dan fase stabil (plateu). Selama proses inisiasi, primer berhibridisasi ke untai tunggal DNA target dan sedikit daerah untai ganda DNA yang berinterkalasi dengan SYBR Green yang menyebabkan adanya sedikit fluoresensi, namun masih terlalu lemah untuk mencapai background. Pada fase eksponensial, terbentuk DNA untai ganda yang lebih banyak dari proses amplifikasi, sehingga lebih banyak SYBR Green yang mengadakan interkelasi dengan untai ganda DNA, akibatnya sinyal fluoresensi/ RFU (Relative Fluorecent Unit) meningkat. Setelah siklus, semua DNA berbentuk DNA untai ganda 16

17 dan jumlah interkelasi SYBR mencapai maksimum, sehingga intensitas sinyal masuk dalam daerah plateu/stabil (Ponchel, 2006). SYBR Green banyak digunakan untuk tujuan optimasi amplifikasi menggunakan qpcr, karena lebih mudah dan murah dibandingkan probe (Fraga dkk., 2008). Namun dalam penggunaan SYBR Green perlu dilakukan optimasi konsentrasi primer yang digunakan untuk memastikan bahwa fluoresensi yang dihasilkan murni dari amplikon yang diharapkan, bukan dari dimer primer. Hal ini dapat diatasi dengan melakukan analisis kurva titik leleh (melting curve) setelah proses PCR selesai (Smith dan Osborn, 2008). Keberadaan dimer primer sangat mudah untuk dianalisis menggunakan melting curve, karena dimer primer memiliki titik leleh (Tm) yang lebih rendah daripada amplikon yang diharapkan (Kubista dkk., 2006). 17

18 Denaturasi Penempelan primer Pemanjangan I (A) (B) (C) Pemanjangan II (D) Akhir reaksi amplifikasi (E) Gambar 6. Proses terbentuknya fluoresensi di tiap tahap PCR (A )Pada saat denaturasi tidak ada SYBR yang menempel pada rantai tunggal DNA; (B)Pada saat penempelan primer tidak ada SYBR yang menempel karena rantai ganda DNA belum terbentuk; (C ) & (D)Pada saat pemanjangan I sudah ada SYBR yang menempel pada rantai ganda DNA yang terbentuk, dan semakin banyak yang menempel seiring dengan pertambahan panjang rantai ganda yang terbentuk pada pemanjangan II sehingaa sinyal fluoresen semakin kuat; (E)Pada akhir reaksi amplifikasi SYBR telah menempel secara maksimal pada rantai ganda DNA 4. Rancangan Primer Memilih primer yang sesuai dengan sekuen target dari DNA cetakan merupakan salah satu faktor yang mempengaruhi keberhasilan amplifikasi menggunakan PCR (Ye dkk., 2012). Primer yang spesifik merupakan primer yang hanya mengenali dan berikatan dengan sekuen target dari DNA cetakan, bukan dengan sekuen lain dari organisme lain atau bahkan sekuen organisme yang sama, dan tidak berikatan dengan pasangannya, sehingga membentuk dimer dan/atau amplikon-amplikon yang tidak diharapkan (Borah, 2011). 18

19 Proses merancangan primer yang spesifik terdiri dari dua tahap, tahap pertama adalah merancangan pasangan primer yang mampu mengapit daerah spesifik dari DNA cetakan, tahap ini dapat dilakukan secara manual maupun dengan menggunakan perangkat lunak (Ye dkk., 2012). Tahap kedua adalah tahap menguji spesifitas primer tersebut terhadap berbagai potensial target, baik dari organisme lain maupun organisme sejenis, yang dapat dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) yang disediakan oleh salah satu badan penelitian bioteknologi di Amerika Serikat yakni, NCBI (National Center for Biotechnology Information) (Ye dkk., 2012). Beberapa hal yang perlu dipertimbangkan untuk merancang primer secara spesifik antara lain : a) Panjang primer Panjang primer yang optimal adalah pb yang cukup spesifik dan mudah menempel pada sekuen target pada temperatur annealing-nya (Borah, 2011). Primer yang terlalu panjang atau terlalu pendek dapat menurunkan spesifitas primer sehingga memungkinkan primer menempel pada berbagai tempat dari DNA cetakan (Compton, 1990). b) Temperatur pelelehan (melting temperature / Tm) Tm didefinisikan sebagai temperatur dimana 50% rantai ganda DNA berubah menjadi rantai tunggal. Primer dengan Tm berkisar 52 o -58 o C, secara 19

20 umum memberikan amplikon yang spesifik (Patricia dkk., 2009). Tm suatu primer sangat ditentukan panjang primer dan jumlah basa Guanine (G) dan Cytosine (C) dalam sekuennya. c) Temperatur penempelan primer (annealing temperature/ta) Dalam penggunaan PCR, Ta primer dapat diperkirakan secara manual, pada umumnya Ta diperkirakan 5 o C dari rata-rata Tm pasangan primer, yang mana Tm primer dapat dihitung menggunakan rumus Tm = 4 (G+C) + 2(A+T) o C (Innis dan Gelfand, 1990). Primer dengan Ta yang tinggi cenderung mengalami penempelan yang tidak spesifik pada DNA cetakan (Patricia dkk., 2009), sedangkan Ta yang terlalu rendah menyebabkan primer tidak dapat menempel pada DNA cetakan (Rychlik dkk., 1990). d) Pengulangan basa nukleotida dalam sekuen primer Pengulangan basa nukleotida G-C pada 5 basa terakhir dari ujung 3 akan meningkatakan spesifitas primer, karena ikatan hidrogennya lebih kuat dibanding A-T (Borah, 2011). Pengulangan basa G-C yang optimal adalah 40-60%, jika lebih dari itu akan mengakibatkan kesalahan dalam penempelan (misprime), sehingga pengulangan dua basa nukleotida tidak boleh lebih dari 4 kali (Patricia dkk., 2009). Spesifitas primer dapat diuji menggunakan kurva titik leleh (melting curve) yang dihasilkan dari proses amplifikasi qpcr (Kubista dkk., 2006). Hal 20

21 ini didasarkan atas perbedaan Tm antara amplikon yang tidak spesifik dengan amplikon yang spesifik (amplikon yang diharapkan), sehingga amplikon spesifik hanya akan menghasilkan satu puncak kurva pelelehan (melting curve) yang semakin tinggi seiring dengan banyaknya amplikon yang terbentuk (Fraga dkk., 2008). 5. Fragmen D-loop DNA mitokondria (mt-dna) mamalia berbentuk sirkuler rantai ganda yang telah sempurna dipetakan oleh Anderson dkk. pada tahun 1981 (Hoong dan Lek, 2005). Gefrides dan Welch (2011) menyatakan bahwa bentuk sirkuler m t- DNA memiliki kontribusi dalam stabilitas yang lebih baik dibandingkan DNA inti. DNA mitokondria lebih tahan terhadap degradasi pada makanan yang diolah dengan pemrosesan tinggi karena ruang membran ganda di sitoplasma akan memberikan perlindungan selama proses isolasi mitokondria dari sel (Bogenhagen, 2009). Hal ini sejalan dengan yang dilaporkan oleh Foran (2006) bahwa lokasi seluler DNA dapat mempengaruhi kerentanan terhadap degradasi DNA, sehingga DNA inti cenderung terdegradasi lebih cepat dibandingkan mt- DNA. Sebagian besar sel mamalia mempunyai ratusan mitokondria dan ribuan kopi mt-dna (Wallace, 1994), karakteristik ini yang membuat mt-dna mudah diisolasi untuk keperluan analisis (Witas dan Zawiciki, 2004). DNA mitokondria mempunyai jumlah kopi yang tinggi, meskipun di dalam sel tidak mengandung 21

22 inti. Mitokondria mengandung 2-10 kopi mt-dna sehingga jumlah kopi per sel akan berlipat (tergantung jaringan dan spesies). Karakteristik ini membuat mt- DNA dapat digunakan untuk analisis sampel dengan jum lah DNA yang sangat terbatas, atau DNA yang mudah terdegradasi, apabila DNA inti tidak dapat ditemukan (Wolf dkk., 1999). Panjang mt-dna adalah pb, terdiri atas Kompleks I, II, III, IV, dan V (Nicholls dan Minczuk, 2014), yang mengode 13 subunit sistem fosforilasi oksidatif, 2 rrna, dan 22 trna (Hoong dan Lek, 2005; Ketmaier dan Bernardini, 2005). Displacement loop (D-loop) merupakan salah satu daerah dalam genom mt-dna yang terletak dalam non-coding region (NCR) dari DNA mitokondria (Pereira et al., 2004), dibentuk melalui tiga rantai tunggal DNA NCR (~650 nukleotida) (Nicholls dan M inczuk, 2014). D-loop merupakan pengatur utama terkespresinya mt-dna karena mengandung daerah replikasi dan promoter utama dalam proses transkripsi (Miyazono et al., 2002). Daerah D-loop merupakan daerah beruntai tiga, yang disebut 7S DNA. Pada daerah D -loop terdapat dua hipervariabel, yaitu HV1 pada urutan nukleotida , dan HV2 pada urutan nukleotida , yang mana dua daerah ini memiliki laju mutasi lebih tinggi dibanding daerah pengode (coding region) sehingga daerah ini sangat bervariasi antar individu, namun masih sama untuk kerabat keturunan ibu. Oleh karena itu, D-loop ini sangat bermanfaat dalam identifikasi individu (Robert, 2007). 22

23 Gambar 7. Susunan gen-gen dalam DNA mitokondria mamalia (The Open Forensic Science Jurnal, 2014) Daerah D-loop dinilai spesifik untuk tujuan autentikasi dalam bahan baku maupun dalam makanan atau produk yang telah mengalami proses pemasakan dan degradasi, meskipun DNA terdegradasi daerah ini masih dapat teramplifikasi. Daerah D-loop sering dipilih untuk tujuan otentikasi daging karena tingkat substitusinya yang tinggi, dan merupakan daerah yang paling berkembang pesat dalam genom mitokondria. Mutasi dalam populasi hewan dan antar individu sangat sering terjadi di daerah D-loop, sehingga banyak dimanfaatkan untuk analisis polimorfisme nukleotida tunggal (Single Nucleotide Polymorphisme /SNP) 23

24 (Fajardo dkk., 2010). Hal ini menunjukkan bahwa daerah D-loop berpotensi tinggi dapat membedakan antar dan inter spesie s hewan (Mohammad dkk., 2013). F. LANDASAN TEORI Sekitar 10% sediaan farmasi yang beredar di masyarakat berupa kapsul dengan bahan utamanya berupa gelatin. Kapsul tidak hanya digunakan untuk tujuan pengobatan, melainkan juga untuk tujuan preventif, sehingga sebagian besar masyarakat pasti pernah mengonsum si kapsul. Bentuk sediaan kapsul memberikan berbagai kemudahan dan kenyamanan dalam penggunaan dibandingkan sedian padat produk farmasi yang lain, sehingga produsen lebih memilih memproduksi kapsul untuk berbagai keperluan untuk memenuhi kebutuhan pasar yang potensial. Namun, terdapat kehawatiran mengenai kehalalan kapsul, mengingat bahan utamanya yakni gelatin, dapat dibuat dari kulit maupun tulang babi, sapi dan ikan. Oleh karena itu diperlukan suatu metode analisis konfirmasi asal gelatin yang sensitif, dan spesifik. Metode qpcr dengan primer spesifik dapat digunakan untuk deteksi dan kuantifikasi material spesies sapi dalam gelatin dalam cangkang kapsul (utamanya), dan berbagai produk lain yang menggunakan bahan gelatin. Primer merupakan salah satu bagian penting dalam reaksi PCR karena kualitas primer yang digunakan akan menentukan spesifitas dan efisiensi metode PCR. Perancangan primer yang dilakukan dalam penelitian ini, menggunakan software online yang disediakan oleh situs resmi NCBI. Perancangan primer menghasilkan 24

25 4 kandidat primer, yang kemudian dikonfirmasi secara in silico dengan menggunakan fitur BLAST pada situs NCBI. Tujuan tahap konfirmasi ini adalah untuk membuktikan bahwa primer benar-benar spesifik menempel pada daerah D- loop bovine, bukan di daerah lain, atau pun di spesies lain, seperti yang terdapat pada Lampiran 1. Tahap konfirmasi in silico menghasilkan 2 primer yang terbaik, yakni primer D-loop 575, dan primer D-loop 93. Kedua primer ini kemudian diuji spesifitasnya secara in vitro dengan metode qpcr terhadap DNA jaringan segar, yakni sapi, babi, celeng, ayam, tikus, dan kambing. Setelah benar-benar spesifik terhadap DNA sapi, kemudian diaplikasikan pada DNA dari gelatin dan cangkang kapsul dengan pengaturan suhu reaksi amplifikasi yang telah optimal. Primer yang paling spesifik dari 2 primer yang diuji tersebut kemudian digunakan untuk pengujian sensitivitas guna mendapatkan nilai konsentrasi terkecil DNA sapi yang masih dapat diamplifikasi (LoD). Kemudian digunakan untuk melakukan uji keterulangan hasil amplifikasi terhadap DNA sapi baik dari gelatin maupun dari cangkang kapsul pembanding. Wardani dkk. (2014) telah berhasil mengidentifikasi keberadaan DNA gelatin babi dalam cangkang kapsul dengan metode qpcr. Oleh karena itu, pada penelitian ini dipilih metode qpcr dengan primer spesifik yang telah dirancang untuk mengidentifikasi keberadaan DNA gelatin sapi, yang selanjutnya digunakan untuk analisis cangkang kapsul yang beredar di pasaran. 25

26 G. HIPOTESIS 1. Primer yang di rancangan mampu mengamplifikasi gen bovine secara spesifik dan selektif sehingga dapat digunakan untuk analisis DNA sapi khususnya, pada gelatin cangkang kapsul, maupun produk olahan lain berbahan dasar sapi (bovine) dengan metode PCR. 2. Metode qpcr yang digunakan untuk identifikasi DNA sapi dalam cangkang kapsul memenuhi kriteria validasi. 3. Kondisi reaksi amplifikasi yang digunakan mampu membuktikan asal gelatin dalam cangkang kapsul yang beredar di Yogyakarta. 26