BAB II TINJAUAN PUSTAKA

Transkripsi

1 4 BAB II TINJAUAN PUSTAKA A. Definisi Kebab Kata kabab ( اب ) berasal dari bahasa Arab atau Persia yang berarti daging yang digoreng dan bukanlah daging yang dipanggang. Kata kabab dari bahasa Arab tersebut berasal dari Arabaic kabbaba yang berasal dari daerah Akkadian kababu, yang berarti membakar atau menggosongkan Kebab terbuat dari daging sapi maupun daging domba atau kambing, yang digiling kasar lalu diolah dengan bumbu-bumbu khusus dan diproses melalui tiga tahapan, yakni pencampuran bumbu, pencetakan daging, dan pemasakan daging dengan cara dipanggang. B. Definisi Babi Babi adalah sejenis hewan ungulata yang bermoncong panjang dan berhidung lemper dan merupakan hewan yang berasal dari Eurasia. Babi termasuk hewan yang sangat kotor karena biasanya memakan segalanya yang diberikan kepadanya dari mulai bangkai, kotorannya sendiri sampai kotoran manusia. Secara psikis babi memiliki kebiasaan yang malas, tidak menyukai matahari, sangat suka makan dan tidur dan memiliki sifat tamak. Sedangkan secara fisik babi menyimpan banyak bibit penyakit, seperti penyakit pathogen yang disebabkan karena cacing gelang dan pita (Trichinella spiralis dan Taenia solium), oleh sebab itu babi diharamkan. Daging babi adalah daging yang paling sulit untuk dicerna, karena kandungan zat lemaknya yang sangat tinggi. Dari hasil penelitian diperoleh bahwa daging kambing dan daging sapi berada di dalam lambung selama 3 jam untuk proses pencernaan yang sempurna, sementara daging babi bisa berada dalam lambung selama 5 jam hanya untuk memperoleh hasil pencernaan yang sempurna. Beberapa ilmuwan barat pun telah menegaskan bahwa mengkonsumsi daging babi dapat menyebabkan kanker dan penyakit 4

2 5 lain. Keberadaan babi dapat dideteksi dengan menggunakan cuplikan daging, tulang atau rambut. C. Protein dan Asam Nukleat Protein dan asam nukleat merupakan dua kelompok makromolekul yang mempunyai peranan sangat khusus bagi proses molekular dalam sel. Protein merupakan polipeptida yang mempunyai bermacam-macam fungsi seperti sebagai katalisator reaksi-reaksi biokimia dalam sel, sebagai pengangkut molekul-molekul kecil dan ion, sebagai komponen sistem kekebalan tubuh, sebagai pengatur ekspresi genetik, sebagai penerus impuls saraf dan sebagai komponen pendukung kekuatan-regang. Sedangkan asam nukleat merupakan polimer nukleotida yang berfungsi dalam penyimpanan serta pemindahan informasi genetik (Yuwono, 2009). Dua tipe utama asam nukleat adalah asam dioksiribonukleat (DNA) dan asam ribonukleat (RNA) (Fessenden, 1990). D. DNA 1. Struktur dan Sifat Fisika Kimia DNA DNA merupakan asam nukleat yang mengandung materi genetik yang berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler (Yuwono, 2009). DNA adalah polimer asam nukleat yang tersusun secara sistematis dan merupakan pembawa informasi genetik yang diturunkan kepada jasad keturunannya (Yuwono, 2009). Komponen satu nukleotida terdiri dari tiga bagian, yaitu gula pentosa (deoksiribosa pada DNA dan ribosa pada RNA), basa nitrogen, dan gugus fosfat. Basa nitrogen yang menyusun asam nukleat adalah basa purin (adenine= A, guanine= G) serta basa pirimidin (cytosine= C, thymine= T, uracil= U). Thymin hanya terdapat pada DNA sedangkan urasil hanya terdapat pada RNA (Yuwono, 2009)

3

4 7 pembangkit tenaga bagi sel. Mitokondria merupakan organel yang mempunyai DNA sendiri, disebut dengan DNA mitokondria atau sering disingkat menjadi mtdna. mtdna berbentuk sirkuler dengan panjang pb terdiri dari 37 gen pengkode, yaitu 2 rrna, 22 trna dan 13 polipeptida (Solihin, 1994). DNA mitokondria hewan berukuran sekitar pasang basa. DNA mitokondria merupakan DNA rantai ganda berbentuk sirkuler. Ukuran DNA mitokondria relatif sangat kecil dibandingkan dengan ukuran genom intinya. Dengan ukuran genomnya yang relatif kecil, maka genom ini dapat dipelajari secara menyeluruh sebagai suatu unit tersendiri (Solihin, 1994). DNA mitokondria pada hewan secara umum memiliki jumlah dan jenis gen yang sama, yaitu 13 daerah yang mengkode protein (URF1, URF2, URF3, URF4, URF5, URF6, URFA6L, URF4L, Cytochrome Oxidase unit I, Cytochrome Oxidase unit II, Cytochrome Oxidase unit III, Cytochrome b dan ATPase 6); 2 gen pengkode rrna yaitu 12S rrna dan 16S rrna; 22 gen pengkode trna (Solihin, 1994). Gambar 2. Struktur DNA Mitokondria (Sriati, 2011)

5 8 Karakteristik DNA mitokondria (mtdna) dapat dijadikan sebagai alat yang signifikan untuk keperluan analisis. mtdna mempunyai jumlah copy yang tinggi, meskipun berada dalam sel yang tidak mengandung inti. Jumlah copy per selnya yaitu sekitar sehingga mtdna mudah diisolasi dan dipurifikasi untuk berbagai keperluan analisis genom. mtdna manusia diturunkan secara maternal sehingga setiap individu pada garis keturunan ibu yang sama akan mempunyai tipe mtdna yang identik. Variasi pada DNA mitokondria cukup untuk penanda genetik terhadap sifat-sifat produksi seperti daging dan susu (Lelana et al, 2003). 3. Isolasi dan Pemurnian DNA Prinsip isolasi DNA adalah memisahkan DNA dari komponenkomponen sel lain. Isolasi DNA dapat dilakukan dari berbagai sumber, antara lain organ manusia, darah, daun, daging buah, serangga, kalus, akar batang, daging dan sisik ikan. Pada individu yang sama DNA yang diperoleh dari berbagai sumber akan memiliki jenis jumlah dan ukuran yang sama. Isolasi DNA pada organisme eukariot dilakukan melalui proses penghancuran sel (lysis), pemusnahan protein dan RNA, dan pemurnian DNA. Secara kimiawi, penghancuran sel dilakukan dengan cara memanfaatkan senyawa kimia seperti lisozim, EDTA (etilen diamin tetra asetat), dan SDS (sodium dodesil sulfat). Isolasi DNA dapat juga dilakukan dengan menggunakan mesin kit pemurnian DNA yang bekerja secara otomatis, singkat dan efisien. Pemurnian DNA dari darah, sel-sel, atau sampel jaringan. Instrumen ini melakukan pemurnian DNA secara magnetik yang dapat memproses sampai dengan 16 sampel dalam waktu menit. DNA yang telah dimurnikan dapat digunakan langsung untuk berbagai aplikasi termasuk PCR, restriksi oleh enzim endonuklease dan elektroforesis gel agarosa.

6 9 Proses kerja mesin purifikasi DNA terdiri dari 4 tahapan yaitu proses pemecahan sel (lysis), pengikatan DNA atau RNA (binding), pencucian (washing) dan elusi (elution) (Otto, 2002). E. PCR Polymerase Chain Reacton (PCR) merupakan teknik sintesis dan amplifikasi DNA secara in vitro. Teknik PCR ini pertama kali dikembangkan oleh Karry Mullis pada tahun PCR dapat digunakan untuk mengamplifikasi segmen DNA dalam jumlah jutaan kali hanya dalam beberapa jam (Rudiretna et al, 2001). PCR adalah suatu teknik yang melibatkan beberapa tahap yang berulang (siklus) dan dalam setiap siklusnya terjadi duplikasi jumlah target DNA untai ganda. Untai ganda DNA templat (unamplified DNA) dipisahkan dengan denaturasi termal yang kemudian didinginkan hingga mencapai titik suhu tertentu untuk memberi waktu pada primer menempel (anneal primers) pada daerah tertentu dari target DNA. Polimerase DNA digunakan untuk memperpanjang primer (extend primers) dengan adanya dntps (datp, dctp, dgtp dan dttp) dan buffer yang sesuai. Komponen-komponen yang dibutuhkan pada proses PCR adalah templat DNA; sepasang primer, yaitu suatu oligonukleotida pendek yang mempunyai urutan nukleotida yang komplementer dengan urutan nukleotida DNA templat; dntps (Deoxynucleotide triphosphates); buffer PCR; magnesium klorida (MgCl) dan enzim polimerase DNA (Rudiretna et al,2001). Keberhasilan pada proses PCR sangat tergantung pada primer yang digunakan. Di dalam proses PCR, primer berfungsi sebagai pembatas fragmen DNA target yang akan diamplifikasi, sekaligus menyediakan gugus hidroksi (OH) pada ujung 3 yang diperlukan untuk proses eksistensi DNA. Perancangan primer dapat dilakukan berdasar urutan DNA yang telah diketahui ataupun pada urutan protein yang dituju. Data urutan DNA atau protein dapat diperoleh dari data base Gen Bank. Apabila urutan DNA ataupun urutan protein yang dituju belum diketahui maka perancangan primer

7 10 dapat berdasarkan pada hasil analisis homologi dari urutan DNA atau protein yang telah diketahui mempunyai hubungan kekerabatan yang terdekat. Kriteria-kriteria yang harus dipenuhi dalam melakukan perancangan primer: 1. Panjang primer Panjang primer yang akan digunakan dalam merancang suatu primer perlu diperhatikan. Umumnya panjang primer berkisar antara 10 sampai 40 pasangan basa dan merupakan komplementer dari DNA. Primer merupakan kunci keberhasilan PCR, karena primer akan mengawali proses polimerasi untaian DNA. Fungsi primer adalah menyediakan ujung 3 -OH yang akan digunakan untuk menempelkan molekul DNA (nukleotida) pertama pada untaian DNA baru dalam proses polimerasi (Yuwono, 2009). Konsentrasi primer yang digunakan untuk 30 siklus pada proses PCR sekitar 1µM. Jika konsentrasi primer tingggi dapat menyebabkan kesalahan penempelan pada sekuen DNA, sehingga hasil PCR tidak sesuai yang dibutuhkan. Jika konsentrasi primer rendah, proses PCR tidak dapat berjalan secara evisien, karena hasil amplifikasi yang diperoleh sangat sedikit (Muladno, 2010). 2. Komposisi primer Dalam merancang suatu primer perlu diperhatikan komposisinya, dimana rangkaian nukleotida yang sama perlu dihindari, karena dapat menurunkan spesifisitas primer yang memungkinkan terjadinya mispriming di tempat lain. Kandungan ((G+C) (% jumlah G dan C)) sebaiknya sama atau lebih besar dari kandungan (G+C) DNA target. Sebab primer dengan % (G+C) rendah diperkirakan tidak akan mampu berkompetisi untuk menempel secara efektif pada tempat yang dituju dengan demikian akan menurunkan efisiensi proses PCR. 3. Melting temperature (Tm) Melting temperatur (Tm) adalah temperatur dimana 50 % untai ganda DNA nya terpisah. Pemilihan Tm suatu primer sangat penting karena akan berpengaruh sekali di dalam pemilihan suhu annealing

8 11 proses PCR. Tm berkaitan dengan komposisi primer dan panjang primer. Sebaiknya Tm primer berkisar antara 50 65ºC. 4. Interaksi primer-primer Interaksi primer-primer seperti self-homology dan cross-homology harus dihindari. Demikian juga dengan terjadinya mispriming pada daerah lain yang tidak diinginkan, karena ini semua dapat menyebabkan spesifisitas primer menjadi rendah dan konsentrasi primer yang digunakan juga menjadi berkurang selama proses akibat terjadinya mispriming. Kondisi ini akan berpengaruh pada efisiensi proses PCR. F. Real-Time PCR Real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) adalah salah satu teknik yang paling banyak digunakan dalam biologi molekuler modern (Vierman, 2004). Real-time PCR memiliki berbagai keunggulan. Selain untuk amplifikasi atau perbanyakan DNA fragmen yang dapat diamati secara cepat, teknik ini juga dapat digunakan untuk menentukan konsentrasi DNA yang terdapat dalam sampel. Maka teknik ini disebut Quantitative PCR (qpcr) (Yepihardi, 2009). Prinsip proses amplifikasi menggunakan real-time PCR sama dengan proses amplifikasi pada PCR secara konvensional. Namun dalam real-time PCR terdapat tambahan komponen PCR yaitu probe. Dimana Probe merupakan primer yang diberi label pewarna dye yang terdiri atas reporter dan peredam pewarna (quencher). Fluoresensi dari reporter hanya dilepaskan ketika dua pewarna secara fisik terpisah melalui hibridisasi atau aktivitas nuclease. Standar posisi label dye, yaitu quencher berada pada 3' dan reporter pada 5' probe (Johansson, 2006). Instrumen real-time PCR mendeteksi amplikon dengan cara mengukur peningkatan pewarna (dye) fluoresen yang berpendar ketika terikat dengan double-stranded DNA. Karena sifat inilah maka pertumbuhan fragment DNA hasil amplifikasi dapat diikuti secara seketika, semakin banyak DNA yang terbentuk semakin tinggi pula intensitas fluoresensi yang dihasilkan. Quantitative PCR dimungkinkan dapat mendeteksi secara akurat konsentrasi

9 12 DNA hingga hitungan picogram atau setara dengan sel tunggal karena sensitifitas dye yang sangat tinggi. Hasil peningkatan fluoresensi digambarkan melalui kurva amplifikasi yang menunjukkan tiga fasa yaitu fasa awal, fasa eksponensial atau puncak dan fasa plateau atau stabil (Vaerman, 2004). Tiga komponen utama dalam instrumen real-time PCR yaitu thermal block cycler sebagai akurasi data, optical system sebagai deteksi data, dan software sebagai analisis data. Real-time PCR juga dapat menganalisis banyak sampel dalam waktu bersamaan menggunakan multiwell plates (Roche¹, 2008). G. Elektroforesis Gel Elektroforesis gel adalah suatu teknik yang berdasarkan pada pergerakan molekul bermuatan dalam media penyanggah matriks stabil dibawah pengaruh medan listrik. Media yang umum digunakan adalah gel agarosa poliakrilamid. Elektroforesis gel agarosa digunakan untuk memisahkan fragmen DNA yang berukuran lebih besar dari 100 pb dan dijalankan secara horizontal, sedangkan eletroforesis akrilamid dapat memisahkan 1 pb dan dijalankan secara vertikal. Elektroforesis poliakrilamid biasanya digunakan untuk menentukan urutan DNA atau sekuensing (Gaffar, 2007). Larutan DNA yang bermuatan negatif dimasukkan kedalam sumur yang terdapat dalam gel agarosa dan diletakkan pada kutub negatif, apabila dialiri arus listrik dengan menggunkan larutan buffer yang sesuai maka DNA akan bergerak ke kutub positif. Laju migrasi DNA dalam medan listrik berbanding terbalik dengan massa DNA. Migrasi DNA terutama ditentukan oleh ukuran panjang dan bentuk DNA. Fragmen DNA yang berukuran kecil akan bermigrasi lebih cepat dibanding yang berukuran besar, sehingga elektroforesis mampu memisahkan fragmen DNA berdasarkan ukuran panjangnya.