BAB I PENDAHULUAN. A. Latar Belakang. dicampur bahan perasa seperti udang dan ikan. Sedangkan kerupuk kulit atau yang

Transkripsi

1 BAB I PENDAHULUAN A. Latar Belakang Kerupuk adalah makanan ringan yang dibuat dari adonan tepung tapioka dicampur bahan perasa seperti udang dan ikan. Sedangkan kerupuk kulit atau yang dikenal dengan nama kerupuk rambak adalah kerupuk yang tidak dibuat dari adonan tepung tapioka, melainkan dari kulit sapi, kerbau, kelinci, ayam atau kulit ikan yang dikeringkan (Amertaningtyas, 2011). Secara kuantitatif belum ada data yang menggambarkan jumlah konsumsi kerupuk. Meskipun demikian dapat diperkirakan bahwa jumlah konsumsi kerupuk relatif tinggi karena makanan olahan ini banyak digemari oleh masyarakat luas (Permana, 2010). Masalah yang timbul khususnya bagi masyarakat yang beragama Islam adalah jaminan kehalalan kulit yang akan dijadikan kerupuk rambak karena dikhawatirkan berasal dari kulit babi (Amertaningtyas, 2011). Menurut KH. Abdurrahman Navis, Ketua Bidang Fatwa MUI Jawa Timur, kerupuk rambak yang tidak jelas kehalalannya, yaitu kulit dari bangkai (disembelih tidak secara Islam), kulit impor dan kulit limbah. Kulit tersebut selain haram untuk dikonsumsi juga dapat mengakibatkan penyakit (Surya, 2010). Pemalsuan bahan baku dalam pembuatan kerupuk rambak dilakukan dengan dua alasan. Pertama, harga kulit babi dan kulit limbah yaitu berturut-turut Rp 5.000/kg dan Rp /kg jauh lebih murah dibandingkan dengan harga kulit sapi segar yang mencapai Rp /kg. 1

2 2 Kedua, tidak adanya pengawasan rutin dari pihak terkait yaitu Lembaga Pengkajian Pangan, Obat-obatan dan Kosmetika Majelis Ulama Indonesia (LPPOM MUI) (Ari, 2009). Dahulu, keaslian bahan baku suatu produk makanan dibuktikan dengan deteksi protein secara spesifik untuk spesies yang berbeda. Analisis dapat dilakukan dengan menggunakan berbagai reaksi imunologi dan metode elektroforesis yaitu SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis). Kekurangan identifikasi spesies menggunakan protein adalah terjadinya denaturasi protein akibat pemanasan selama proses pembuatan makanan dan ekspresi protein bergantung dari jaringan yang digunakan sebagai bahan baku (Lockley & Bardsley, 2000). DNA merupakan salah satu asam nukleat yang dapat digunakan dalam analisis produk makanan olahan karena DNA lebih stabil terhadap pemanasan dibandingkan dengan protein (Lockley & Bardsley, 2000). Saat ini metode yang telah banyak digunakan adalah metode PCR dan real-time PCR untuk tujuan kuantifikasi DNA. Identifikasi campuran daging babi dalam berbagai produk olahan daging telah banyak dilakukan, misalnya identifikasi derivat babi dalam produk makanan dengan metode Polymerase Chain Reaction (PCR) (Man et al., 2007) dan kuantifikasi daging babi dalam produk olahan daging unggas dengan metode real-time PCR (Soares et al., 2013). Identifikasi DNA babi menggukanan metode PCR membutuhkan suatu primer yang spesifik yang hanya dapat menempel pada target fragmen DNA babi pada urutan basa tertentu dan selanjutnya fragmen tersebut dapat teramplifikasi.

3 3 Fatimah (2013) telah mendesain primer dengan target amplifikasi DNA mitokondria D-loop pada basa urutan D-loop forward: 5 - TCGTATGCAAACCAAAACGCC-3 ) dan (D-loop reverse: 5 - ATGCATGGGGACTAGCAGTTA-3 ), amplikon 176 pasang basa (pb). Primer ini telah digunakan untuk mengamplifikasi DNA babi pada campuran bakso babi dan ayam dengan metode real time PCR dengan suhu annealing primer optimum 59 C. Primer mitokondria D-loop 22 juga telah teruji dapat mengamplifikasi DNA babi yang terdapat pada campuran abon sapi dan babi secara spesifik (Rahmawati et al., 2016). Kerupuk rambak melewati proses pembuatan yang cukup panjang diantaranya melalui proses perebusan, pengeringan, dan penggorengan. Adanya proses yang menggunakan panas dalam pembuatan kerupuk rambak tersebut dapat menyebabkan DNA di dalam sel terdegradasi (terpotong-potong) menjadi ukuran yang lebih kecil (Bauer et al., 2003). Namun, di dalam sel terdapat mitokondria DNA (mtdna) yang memiliki bentuk sirkuler terkondensasi yang tidak mudah terdegradasi oleh pemanasan dibandingkan dengan nukleus DNA (ndna) yang mempunyai struktur linear dan panjang (Bogenhagen, 2009). Diketahui bahwa isolasi DNA dan amplifikasi DNA babi dapat dilakukan terhadap abon yang juga mengalami pemanasan dalam proses pembuatannya (Rahmawati et al., 2016). Oleh karena itu, di dalam penelitian ini akan dilakukan isolasi DNA dari kerupuk rambak dan isolat DNA tersebut diamplifikasi dengan metode real-time PCR menggunakan primer

4 4 mitokondria D-loop 22. Primer tersebut memiliki target pada DNA mitokondria babi pada daerah D-loop. B. Rumusan Masalah 1. Apakah DNA babi dan sapi dapat diisolasi dari kerupuk rambak? 2. Apakah primer mitokondria D-loop 22 dapat mengamplifikasi DNA babi secara spesifik pada kerupuk rambak dengan metode real-time PCR? 3. Berapakah nilai batas deteksi, efisiensi, linearitas, dan keterulangan (CV) primer mitokondria D-loop 22 dalam mengidentifikasi DNA babi pada rambak babi 100% serta pada kerupuk rambak campuran babi dan sapi dengan metode realtime PCR? C. Urgensi Penelitian Penelitian ini diharapkan dapat menghasilkan metode yang sensitif dan selektif untuk mengidentifikasi kontaminasi kulit babi pada produk kerupuk rambak. Metode yang diperoleh tersebut selanjutnya dapat digunakan oleh LPPOM MUI dalam menentukan status kehalalan dan keaslian produk yang beredar di pasaran. D. Tujuan Penelitian 1. Melakukan isolasi DNA sapi dan babi dari kerupuk rambak. 2. Mengetahui bahwa primer mitokondria D-loop 22 dapat mengamplifikasi DNA babi pada kerupuk rambak secara spesifik dengan metode real-time PCR.

5 5 3. Menentukan batas deteksi, efisiensi, linearitas, dan keterulangan (CV) primer mitokondria D-loop 22 dalam mengidentifikasi DNA babi pada rambak babi 100% serta rambak campuran babi dan sapi dengan metode real-time PCR. E. Tinjauan Pustaka 1. Kerupuk rambak Kerupuk rambak merupakan kerupuk yang terbuat dari bahan dasar kulit hewan dan bumbu-bumbu. Kulit yang digunakan sebagai bahan dasar kerupuk rambak biasanya berasal dari kulit sapi, kulit kambing ataupun kulit kerbau. Kualitas kerupuk rambak akan lebih baik apabila dibuat dari kulit sapi (Wahyono & Marzuki, 2002). Secara kasat mata kerupuk rambak dari bahan kulit babi berwarna lebih putih, cerah dan memiliki tekstur lebih halus dengan lubang udara kecil-kecil. Sebaliknya, kerupuk rambak dari kulit sapi berwarna agak cokelat, pori-porinya lebih besar dan kasar. Namun demikian, kerupuk rambak berbahan kulit sapi dan berbahan kulit babi masih sulit untuk dibedakan dengan pasti dari segi fisik karena kondisinya dipengaruhi pula oleh kondisi kulit yang digunakan sebagai bahan dasar. Kerupuk rambak adalah produk makanan ringan yang dibuat dari kulit sapi atau kerbau melalui tahap proses pembuangan bulu, pembersihan kulit, perebusan, pengeringan, perendaman dengan bumbu untuk kerupuk rambak kulit mentah dan dilanjutkan dengan penggorengan untuk kerupuk rambak kulit siap konsumsi (Anonim, 1996). Kerupuk rambak mengandung energi 362 Kkal per 100 g; protein

6 6 82,91%; karbohidrat 0,43%; mineral 0,04%; serta natrium glutamat 0,80% (Sihombing, 1996). Secara statistik belum didapatkan angka pasti mengenai jumlah konsumsi kerupuk rambak di Indonesia. Meskipun demikian melihat masyarakat yang sangat gemar terhadap kerupuk dan keberadaannya yang tersebar luas dapat diduga bahwa konsumsi kerupuk ini sangat besar. Besarnya permintaan terhadap kerupuk rambak tidak didukung dengan ketersediaan bahan baku kulit yang dibutuhkan. Beberapa industri rumah tangga mengaku kesulitan untuk mendapatkan bahan baku kulit dan jika ada, harganya melambung tinggi karena minimnya pasokan dan tingginya permintaan (Anonim, 2008). Hal tersebut membuat beberapa produsen kerupuk rambak yang tidak bertanggungjawab memalsukan produknya dengan menggunakan kulit limbah tekstil atau dengan menggunakan kulit babi untuk klaim rambak sapi. Pemalsuan bahan baku dalam pembuatan kerupuk rambak dilakukan dengan dua alasan yaitu harga kulit babi dan kulit limbah jauh lebih murah dibandingkan dengan harga kulit sapi segar dan tidak adanya pengawasan rutin dari pihak terkait (Ari, 2009). Pengawasan secara rutin dan ketat dari pihak terkait seperti LPPOM MUI sangatlah penting untuk menjamin kualitas produk kerupuk rambak. Adanya cemaran kulit babi di dalam kerupuk rambak sapi dapat diketahui dengan melakukan analisis pada tingkat molekular (DNA) sehingga isolasi DNA harus dilakukan terlebih dahulu.

7 7 2. Isolasi DNA Teknik molekular bervariasi dalam cara pelaksanaan untuk mendapatkan data. Baik teknik maupun tingkatan target data yang digunakan, disesuaikan dengan kemudahan pelaksanaan, ketersediaan sumber daya manusia, fasilitas dan dana (Karp et al., 1997). Isolasi atau ekstraksi biomolekul, DNA, RNA (Ribonucleic Acid), dan protein merupakan metode yang paling penting dalam analisis biologi molekuler (Wink, 2006). Proses isolasi DNA dilakukan melalui empat tahap utama, yaitu memecahkan sel atau jaringan, denaturasi kompleks nukleoprotein, inaktivasi RNA dengan RNase dan memisahkan DNA dari komponen-komponen lain (Doyle, 1996). Pemecahan jaringan dapat dilakukan dengan menggerus jaringan dengan bantuan dry ice atau nitrogen cair sedangkan untuk memecah membran sel dapat dilakukan dengan menggunakan deterjen, seperti SDS (Sodium Dodesil Sulfat) (Hui, 2005). DNA hasil isolasi harus bebas dari kontaminan seperti protein, karbohidrat, lipid dan RNA (Buckingham & Flaws, 2007). Secara umum metode isolasi dibagi menjadi dua cara, yaitu melalui penggunaan guanidinium tiosianat atau penggunaan fenol dan SDS (Doyle, 1996). Protein, lipid, karbohidrat, dan bagian sel lainnya dapat dihilangkan melalui ekstraksi fase air dengan fase organik campuran antara fenol dan kloroform (Sambrook & Russel, 2001). Suatu emulsi dua fase akan terbentuk setelah fenol dan kloroform ditambahkan. Lapisan hidrofobik akan berada di bagian bawah sedangkan fase hidrofilik berada di atas setelah dilakukan sentrifugasi. Fase atas yang mengandung DNA dikumpulkan dan DNA dapat diendapkan dari supernatan dengan

8 8 menambahkan etanol atau isopropanol dengan perbandingan 2 : 1 atau 1 : 1 dan garam dengan konsentrasi tinggi. Endapan DNA dikumpulkan melalui sentrifugasi dan kelebihan garam dibilas dengan etanol 70% serta kembali disentrifugasi untuk membuang supernatan etanol. Pelet DNA dilarutkan dengan dapar TE (Tris EDTA) atau aquabidest steril (Buckingham & Flaws, 2007). Sebelum dilakukan amplifikasi DNA dengan menggunakan metode real-time PCR, analisis awal terhadap isolat DNA dilakukan untuk mengetahui kemurnian dan kuantitas DNA yang didapat. Metode yang dapat digunakan yaitu elektroforesis gel agarosa untuk uji kemurnian dan spektrofotometri ultraviolet (UV) untuk uji kemurnian serta kuantifikasi hasil isolasi. 3. Elektroforesis gel agarosa Elektroforesis adalah teknik pemisahan molekul DNA dengan menempatkan sampel di dalam matriks padat, biasanya agarosa atau poliakrilamid. Migrasi molekul dapat terjadi karena adanya pengaruh medan listrik yang diberikan. Agarosa adalah polisakarida yang diekstraksi dari rumput laut. Jika dicampur dengan air dan dipanaskan maka agarosa akan meleleh dan membentuk larutan yang homogen. Gel akan membentuk lembaran ketika didinginkan dan di dalamnya terdapat pori-pori kecil dengan ukuran yang dipengaruhi oleh konsentrasi gel. Etidium bromida (EtBr) perlu ditambahkan sebelum gel memadat untuk memberi warna pada pita-pita DNA. EtBr akan terikat pada pita DNA atau RNA dengan kuat dan spesifik sehingga dapat memberikan warna oranye terang di bawah sinar UV (Clark & Pazdernik, 2013).

9 9 Pemisahan molekul dilakukan berdasarkan perbedaan ukuran yang sangat dipengaruhi oleh ukuran pori matriks dimana molekul yang lebih kecil akan lebih mudah melewati matriks padat. Beberapa parameter yang mempengaruhi pemisahan dan pergerakan molekul DNA dalam elektroforesis gel adalah komposisi dan konsentrasi gel, dapar, suhu, dan voltage. Kualitas DNA yang baik dan tidak terdegradasi pada hasil elektroforesis tidak menampakkan pola pita yang smear (Birren & Eric, 1993). 4. Spektrofotometri UV Spektrofotometri UV merupakan metode yang umum digunakan untuk menentukan kemurnian dan kuantifikasi awal hasil isolasi DNA. Metode spektrofotometri UV tidak menggunakan sampel dalam jumlah yang besar dan tidak memerlukan reagen tambahan atau waktu inkubasi. Hal yang dapat menjadi masalah adalah jika sampel memiliki konsentrasi yang rendah atau DNA dilarutkan pada volume rendah dari proses isolasi. Metode ini juga kurang sensitif dibandingkan dengan metode lain seperti PCR. Konsentrasi DNA terkecil yang dapat diukur dengan menggunakan metode spektrofotometri UV adalah 1,5 µg/ml (Kelly et al., 2012). DNA merupakan asam nukleat berupa dua untai polinukleotida yang berpilin satu sama lain membentuk double helix dan terdiri dari nukleotida-nukleotida. Masing-masing nukleotida tersusun atas satu basa nitrogen (guanin (G), adenine (A), sitosin (C), timin (T)), gula monosakarida (deoksiribosa), dan gugus fosfat (Gambar 1). Analisis kuantitatif dengan menggunakan metode spektrofotometri didasarkan pada hukum Lambert-Beer, A = ɛcl, dimana A adalah nilai absorbansi pada panjang

10 10 gelombang tertentu, C adalah konsentrasi DNA, l adalah lebar kuvet yang digunakan (biasanya 1 cm), dan ɛ adalah koefisien ekstingsi molar (Gallagher & Philippe, 2007). Gambar 1. Struktur DNA. Tiap nukleotida dalam DNA tersusun dari satu basa nitrogen, gula monosakarida (deoksiribosa) dan gugus fosfat Basa nitrogen memiliki nilai ɛ cukup besar (Tabel I) yang sangat berperan dalam absorpsi sinar UV sehingga DNA dapat diukur secara kuantitatif menggunakan spektrofotometer UV. Tabel I. Nilai ɛ dari basa nitrogen penyusun DNA (Gallagher & Philippe, 2007) Basa Nitrogen ɛ (1M, 260 nm) Adenin Sitosin Guanin Timin Pada metode spektrofotometri UV, sampel dimasukkan dalam kuvet dan ditempatkan dalam spektrofotometer UV. Sampel diukur dengan menggunakan dua panjang gelombang (λ) yaitu pada 260 nm yang akan mengukur semua asam nukleat

11 11 baik DNA maupun RNA dan 280 nm yang akan mengukur kontaminasi protein dalam sampel (Leninger et al., 1975). Kualitas DNA dapat diketahui melalui kemurnian berdasarkan perbandingan nilai absorbansi λ 260 nm dan 280 nm (A 260 /A 280 ). Hasil isolasi DNA dikatakan memiliki tingkat kemurnian yang baik jika nilai dari A 260 /A 280 sebesar 1,8. Bila perbandingan yang diperoleh nilainya di bawah 1,8 artinya nilai serapan DNA pada λ 280 nm akan bertambah akibat adanya kandungan senyawa organik (karbohidrat dan protein) dan fenol yang ikut menyerap sinar UV. Sebaliknya, bila perbandingan yang diperoleh nilainya di atas 1,8 artinya nilai serapan pada λ 260 nm bertambah akibat adanya kandungan senyawa RNA yang menyerap sinar UV (Sambrook & Russel, 2001). 5. Polymerase Chain Reaction (PCR) PCR merupakan prosedur yang efektif untuk mengamplifikasi urutan DNA tertentu dalam jumlah besar secara in vitro. Bahan penting yang digunakan dalam melakukan metode PCR yaitu (1) dua primer oligonukleotida sintetik yang mengapit urutan DNA sasaran, (2) target urutan DNA sampel yang terletak diantara pasangan primer dan dengan panjang dari 100 sampai ~ bp, (3) polimerase DNA yang stabil pada pemanasan mencapai 95 C atau lebih, (4) empat deoxiribonukleotida (Glick & Jack, 1998). Reaksi dimulai dengan konversi dari double stranded DNA (dsdna) target menjadi single stranded DNA (ssdna) dan dengan menggunakan primer yang spesifik memungkinkan polimerase DNA bekerja. Pemilihan primer dan

12 12 hibridisasinya dengan masing-masing strand target, akan menentukan batas DNA target yang akan diamplifikasi (Crommelin & Robert, 1997). Denaturasi Annealing Sintesis Gambar 2. Tahap-tahap PCR. Amplifikasi DNA dimulai dengan denaturasi DNA, annealing dan sintesis selama siklus (Brown, 2010) Tahap-tahap dari metode PCR (Glick & Jack, 1998; Brown, 2010) yang dapat dilihat pada Gambar 2, yaitu: Proses diulang selama siklus 1. Denaturasi yaitu campuran dipanaskan sampai suhu 94 C, dimana pada suhu tersebut ikatan hidrogen yang membentuk molekul double stranded DNA rusak sehingga molekul akan terdenaturasi menjadi single stranded DNA.

13 13 2. Annealing yaitu campuran didinginkan hingga suhu C. Selama tahap ini primer akan menempel di molekul DNA pada daerah yang spesifik. 3. Sintesis yaitu suhu kembali dinaikkan hingga mencapai 74 C yang merupakan suhu optimum bagi Taq DNA polymerase (salah satu jenis polimerase DNA). 6. Real-Time PCR Real-time PCR adalah suatu metode yang didasarkan pada prinsip-prinsip PCR konvensional dan terus mengalami perkembangan hingga saat ini. Real-time PCR mengintegrasikan siklus PCR dengan metode fluorometri sehingga dapat dilakukan monitoring terhadap reaksi amplifikasi untuk tujuan kuantifikasi dan karakterisasi produk PCR (Dorak, 2006). Metode real-time PCR mempunyai keunggulan dibandingkan dengan metode PCR yang lain, yaitu sensitif, spesifik, dan dapat dilakukan kuantifikasi tanpa memerlukan tahap lanjutan (Soares et al., 2013; Cammá, 2012). Tanpa adanya tahap lanjutan PCR, metode real-time PCR dilakukan dalam satu tahap yang dapat mengurangi kemungkinan kesalahan atau hilangnya sampel serta kontaminasi sampel saat proses pemindahan (Coleman & Gregory, 2006). Kuantitatifikasi pada real-time PCR adalah konversi dari sinyal fluoresen dari setiap reaksi menjadi nilai numerik untuk setiap sampel (Dorak, 2006). Pada kurva amplifikasi (Gambar 3) terlihat adanya 2 fase, yaitu fase eksponensial yang diikuti dengan fase non eksponensial (plateau phase). Selama fase eksponensial, jumlah produk amplifikasi dengan metode PCR meningkat dua kali

14 14 lipat setiap siklus. Reaksi yang tejadi dalam proses amplifikasi akan mengurangi komponen-komponen dalam reaksi, seperti primer dan polimerase DNA sehingga reaksi akan berjalan lebih lambat. Reaksi yang melambat menunjukkan proses amplifikasi telah memasuki fase non eksponensial (Anonim, 2006). Fase non ekspnensial Ct atau Cq Gambar 3. Fase amplifikasi pada metode real time PCR. Terdapat 2 fase dalam proses amplifikasi DNA yaitu fase ekponensial dan fas non eksponensial Ct (cycle threshold) atau Cq (cycle quantification) merupakan siklus dimana jumlah produk amplifikasi memberikan sinyal fluoresen yang cukup untuk dideteksi. Nilai Cq ditentukan oleh jumlah template DNA yang terdapat pada awal reaksi amplifikasi. Jika jumlah template DNA pada awal reaksi banyak maka hanya dalam beberapa siklus saja sinyal fluoresen telah melewati batas ambang (threshold) dan memiliki nilai Cq yang rendah. Sebaliknya, jika jumlah template DNA pada awal reaksi sedikit maka akan dibutuhkan jumlah siklus yang lebih banyak agar sinyal fluoresen telah melewati batas ambang (Anonim, 2006). Metode real-time PCR juga menghasilkan suatu kurva melt peak yang menunjukkan puncak denaturasi. Puncak tersebut dapat digunakan untuk mengetahui

15 15 adanya produk non spesifik dari hasil amplifikasi dengan metode real-time PCR. Puncak denaturasi diperoleh dengan meningkatkan suhu dengan rentang tertentu setelah proses amplifikasi selesai sehingga DNA yang berbentuk double stranded terdenaturasi menjadi single stranded dan menurunkan nilai sinyal fluoresen. Karakteristik produk PCR dilihat dari puncak denaturasi yang juga menunjukkan suhu leleh (melting temperature) produk yaitu suhu dimana dsdna berubah menjadi ssdna (Anonim, 2006). Terdapat beberapa pendekatan untuk mendeteksi produk PCR, yaitu berdasarkan ikatan spesifik antara probe dengan urutan DNA target atau menggunakan zat berfluoresensi yang mampu mengikat produk PCR double stranded secara tidak spesifik (Dorak, 2006). EvaGreen merupakan salah satu zat yang mampu mendeteksi produk PCR secara tidak spesifik. EvaGreen memiliki mekanisme deteksi sama dengan SYBR Green. Dengan menggunakan SYBR Green, metode PCR lebih flexibel tanpa harus mendesain probe yang spesifik untuk DNA target (Terzi et al., 2004). Zat tersebut juga lebih murah dibandingkan dengan menggunakan probe untuk mendeteksi campuran daging secara simultan (Sakalar & Fatih, 2012). SYBR Green dan EvaGreen menghasilan sinyal fluoresen yang rendah ketika berada dalam keadaan bebas di dalam larutan. Sinyal fluoresen akan meningkat mencapai kali lipat ketika SYBR Green atau EvaGreen berikatan dengan dsdna (Gambar 4). Oleh karena itu, banyaknya sinyal fluoresen yang

16 16 dihasilkan dari reaksi sebanding dengan jumlah dsdna yang ada dan akan terus meningkat ketika dsdna teramplifikasi. SYBR Green SYBR Green terikat dengan dsdna Gambar 4. Mekanisme deteksi hasil amplifikasi metode real-time PCR dengan SYBR Green. Sinyal fluoresen meningkat ketika SYBR Green berikatan dengan dsdna (Anonim, 2006) 7. Primer Mitokondria D-loop Primer merupakan suatu oligonukleotida yang diperlukan pada amplifikasi enzimatik fragmen DNA menggunakan metode PCR yang komplementer dengan ujung 5 dari kedua untaian sekuen target. Oligonukleotida ini memungkinkan template DNA diperbanyak oleh DNA polymerase (Nasir, 2002). Pada sel eukariotik, DNA sebagai material genetik terdapat dalam setiap sel dan terletak di nukleus (ndna) serta mitokondria (mtdna). Kedua jenis DNA tersebut dapat dijadikan sebagai target amplifikasi primer untuk metode PCR. Lokasi DNA menentukan kemudahan DNA untuk terdegradasi dan ndna lebih mudah tedegradasi daripada mtdna (Mohamad et al., 2013). Di dalam nukleus, DNA mempunyai bentuk panjang dan linear double stranded yang melilit pada protein histon sedangkan

17 17 mtdna dari sebagian besar spesies berbentuk sirkuler yang mengandung struktur terkondensasi disebut nukleods (Bogenhagen, 2009). Bentuk yang sirkuler inilah yang menyebabkan mtdna lebih stabil sehingga tidak mudah terdegradasi, seperti saat proses pembuatan makanan. Dari sudut pandang lain, ukuran mtdna jauh lebih pendek dibandingkan ndna dan sangat bervariasi antara organisme. Daerah pengkode pada mtdna megandung 13 gen untuk mengkode protein yang terlibat dalam produksi enzim untuk transport elektron dan fosforilasi oksidatif, 2 gen untuk RNA ribosom (12S dan 16S rrna) serta 22 gen untuk transfer RNA (trna). Pada vertebrata, suatu daerah non penyandi yang berjumlah sekitar 1000 bp yang dapat ditemukan di mtdna disebut displacement Loop (D-loop) dan mengandung origin replikasi dari mtdna (Magoulas, 2005). Daerah D-loop sering dipilih untuk identifikasi daging karena tingkat substitusi tinggi di wilayah yang paling cepat berkembang di genom mitokondria (Fajardo et al., 2008). D-loop merupakan daerah non penyandi yang memiliki polimorfisme tertinggi dalam mtdna. Hal ini menunjukkan potensi penggunaan D- loop mitokondria untuk membedakan antar dan intra spesies hewan. Penentuan kuantitatif daging sapi dalam sampel campuran menggunakan primer spesifik yang menargetkan wilayah D-loop telah dilaporkan oleh Sawyer et al., (2003). Primer dapat mendeteksi DNA sapi secara spesifik dalam campuran daging sapi (0,10%) dan domba serta di sampel DNA yang tidak diketahui. Gambar 5 menunjukkan posisi D- loop di dalam genom mitokondria DNA.

18 18 D-loop Gambar 5. Posisi D-loop di dalam genom mitokondria DNA. Daerah D-loop (biru) berada diantara daerah 12S RNA dan cytochrome b (cyt b) (Anonim, 2015) Primer mitokondria D-loop 22 adalah sepasang primer spesifik spesies babi yang dapat mengamplifikasi fragmen mitokondria D-loop babi dengan urutan basa ke dengan ukuran amplikon 176 pb. F. Landasan Teori Kerupuk rambak merupakan salah satu olahan kulit seperti kulit sapi atau babi. Di setiap jaringan makhluk hidup termasuk jaringan kulit mengandung urutan DNA yang sama. Oleh karena itu, adanya cemaran babi pada rambak sapi dapat dideteksi secara molekuler yaitu pada tingkat DNA dengan terlebih dahulu dilakukan isolasi DNA. Namun, sebagian besar DNA yang terdapat dalam kerupuk kemugkinan telah terdegradasi saat proses pembuatan sehingga diperlukan suatu metode analisis yang sensitif dan selektif untuk mengidentifikasi DNA babi.

19 19 Metode yang dapat digunakan yaitu metode real-time PCR yang mempunyai beberapa kelebihan antara lain, sensitif, selektif, dan dapat dilakukan kuantifikasi secara langsung. Metode tersebut memerlukan primer yang dapat mengamplifikasi DNA babi secara spesifik. Primer mitokondria D-loop 22 yang telah didesain oleh Fatimah (2013) dapat secara spesifik mengidentifikasi target DNA babi di antara DNA sapi, ayam, kambing, dan kuda pada suhu annealing primer 59 C dengan metode real-time PCR (Rahmawati et al., 2016). Primer mitokondria D-loop 22 juga telah terbukti dapat digunakan untuk mendeteksi DNA babi dalam bakso ayam dan abon sapi secara spesifik. Primer memiliki target amplifikasi berupa DNA mitokondria pada daerah D-loop dengan dengan urutan basa ke dengan ukuran amplikon 176 pb (Fatimah, 2013). DNA mitokondria dipilih sebagai target amplifikasi primer dikarenakan DNA mitokondria lebih stabil terhadap pemasanan dan jumlahnya di dalam sel lebih banyak dibandingkan dengan DNA nukleus (Lockley & Bardsley, 2000; Branicki et al., 2003). G. Hipotesis 1. DNA sapi maupun babi dapat diisolasi dari kerupuk rambak. 2. Primer mitokondria D-loop 22 mampu mengamplifikasi DNA babi hasil isolasi secara spesifik pada kerupuk rambak.