1. PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang

Transkripsi

1 1 1. PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Asam deoksiribonukleat atau deoxyribonucleic acid (DNA) merupakan salah satu jenis asam nukleat yang membawa ribuan gen yang menentukan sifat tertentu dari satu generasi ke generasi turunannya, termasuk informasi untuk diferensiasi sel sehingga terbentuk tumbuhan, hewan, manusia dan organisme lainnya. Karakteristik DNA tersebut sangat membantu dalam mengungkap identitas individu makhluk hidup berdasarkan hubungan kekerabatannya, termasuk manusia (Toha 2001). Teknologi di bidang biologi molekuler mengalami kemajuan yang pesat. Kemajuan teknologi tersebut adalah ditemukannya teknik amplifikasi in vitro fragmen gen tertentu yang terletak di antara pasangan oligonukleotida primer spesifik yang disebut polymerase chain reaction (PCR), dan teknik pelacak DNA (DNA probe) berdasarkan prinsip hibridisasi DNA. Kedua teknologi tersebut kini semakin memudahkan banyak bidang kehidupan manusia antara lain kesehatan, intensifikasi pertanian, konservasi, dan forensik. Bidang forensik kini mengalami perkembangan sedemikian rupa. Teknik yang digunakan dalam bidang forensik sebelumnya adalah odontologi (susunan gigi geligi) dan fingerprint (sidik jari), namun teknik tersebut belum mampu untuk menyingkap identitas seseorang (baik korban maupun pelaku) dalam kasus-kasus kriminalitas, atau pun korban musibah dan bencana alam. Kesulitan yang sering dihadapi adalah proses identifikasi korban berdasarkan tulang belulang yang tersisa karena organ tubuh lainnya telah rusak akibat pembusukan atau pun terbakar. Asam deoksiribonukleat atau DNA yang berasal dari gigi dan tulang adalah pilihan terakhir yang tersisa bagi upaya di bidang forensik saat sumber lain dari tubuh manusia seperti daging, darah, sperma atau rambut tidak lagi dapat ditemukan atau digunakan karena sudah rusak. Tulang paha (femur) yang ukurannya paling besar daripada tulang lainnya paling sering digunakan untuk mendapatkan kuantitas DNA yang memadai. Kuantitas DNA hasil ekstraksi dan presipitasi sampel tulang seringkali tidak cukup untuk dapat digunakan dalam

2 2 tahap sequencing karena umumnya mengandung DNA yang sangat sedikit (picogram atau nanogram) atau low copy number sehingga proses ekstraksi dan presipitasi DNA tulang harus dilakukan berulang kali. Hal ini tentu membutuhkan waktu lebih lama, tenaga lebih besar, konsentrasi dan biaya yang lebih tinggi (Widodo, komunikasi pribadi 2012). Presipitasi DNA tulang yang memiliki kadar DNA sangat rendah membutuhkan bahan pembantu yang dapat meningkatkan efektivitas etanol atau isopropanol dalam mempresipitasi DNA. Menurut Bartram et al. (2009), bahan yang ditambahkan untuk meningkatkan efektivitas presipitasi DNA lebih dikenal dengan istilah carrier atau ko-presipitan. Linear polyacrylamide (LPA), yeastderived trna, dan glikogen adalah contoh bahan yang tergolong ko-presipitan dalam presipitasi DNA. Sumber bahan baku glikogen komersial dengan grade biologi molekular atau kemurnian yang tinggi umumnya berasal dari kerang-kerangan. Temilok adalah salah satu jenis kerang-kerangan yang masih mudah dijumpai di hutan bakau di beberapa pulau di Indonesia, termasuk di Pulau Bangka. Harga temilok segar di Pulau Bangka berkisar antara Rp ,00 Rp ,00/ kg. Preparasi temilok juga relatif lebih mudah daripada tiram karena bagian mantel temilok tidak ditutupi oleh cangkang, dan tekstur sebagian besar mantel temilok yang lebih lunak. Kadar karbohidrat pada daging hewan menjadi indikasi awal kandungan glikogen. Menurut Syaputra et al. (2007), kadar karbohidrat temilok juga relatif tinggi yaitu sekitar 17%, sedangkan kadar proteinnya relatif rendah, yaitu sekitar 4,29%. Temilok tidak populer sebagai bahan pangan seperti halnya remis dan tiram, sehingga sangat potensial sebagai bahan baku ekstraksi glikogen. Menurut Nicoletti dan Baiocchi (1994), ekstraksi polisakarida glikogen dapat dilakukan dengan metode alkali panas. Pengadukan larutan glikogen dengan penambahan sejumlah resin kationik dapat menurunkan residu nitrogen ekstrak glikogen. Penelitian ini mencoba menerapkan prinsip ekstraksi glikogen metode Nicoletti dan Baiocchi untuk mendapatkan ekstrak glikogen dari temilok (Bactronophorus thoracites) lalu diuji kemampuannya sebagai ko-presipitan dalam presipitasi DNA femur.

3 3 Ekstraksi glikogen dengan metode alkali panas untuk pertama kalinya dilakukan oleh Claude Bernard pada tahun Pada tahun 1942, Warburg dan Christian meletakkan prinsip pengukuran protein dan asam nukleat menggunakan spektrofotometer. Prinsip ini sangat membantu di dalam pengukuran residu pengotor glikogen terekstrak. Pada tahun 1994, Nicoletti dan Baiocchi mempatenkan metode ekstraksi glikogen dengan prosedur penurunan residu nitrogen menggunakan resin kationik. Bennett et al. (2007) menegaskan bahwa pengukuran kadar glukosa di dalam glikogen dengan fenol-sulfat (fesul) adalah metode terbaik. Syaputra et al. (2007) melaporkan bahwa temilok (Bactronophorus sp.) merupakan spesies kerang pengebor kayu dengan kadar karbohidrat sekitar 17%. Bartram et al. (2009) melaporkan bahwa pemanfaatan glikogen sebagai bahan pembantu dalam presipitasi DNA harus memperhitungkan residu asam nukleatnya. Roadmap penelitian ini disajikan pada Gambar 1. Ekstraksi glikogen dari liver anjing dengan metode alkali panas ( Bernard 1857) Pemurnian ekstrak glikogen Mytilus gallus Provincialis dengan resin kationik (Nicoletti & Baiocchi 1994) Rendemen daging dan analisis proksimat Bactronophorus sp. (Syaputra et al. 2007) Metode presipitasi asam nukleat dengan visible carrier (McCormick 2009) Prinsip pengukuran protein dan asam nukleat dengan spektrofotometer (Warburg & Christian 1942) Kadar glukosa di dalam glikogen (Bennett et al. 2007) Analisis asam lemak dan asam amino Bactronophorus thoracites (Leiwakabessy 2011) Residu nukleat di dalam glikogen biology molecular grade sebagai carrier presipitasi DNA (Bartram 2009) Optimasi ekstraksi glikogen dari Bactronophorus thoracites dengan metode Nicoletti dan Baiocchi Gambar 1 Roadmap penelitian.

4 4 1.2 Perumusan Masalah Glikogen merupakan salah satu bahan ko-presipitan DNA yang dapat meningkatkan laju presipitasi low copy number DNA. Glikogen yang beredar di pasaran sebagian besar adalah produk impor dan masih menggunakan kerang sumber protein seperti remis dan tiram sebagai bahan baku sehingga harganya masih relatif mahal yaitu sekitar US$ 179 per ml. Temilok adalah salah satu jenis kerang air payau dengan kadar karbohidrat yang relatif tinggi sehingga sangat potensial sebagai bahan baku penghasil glikogen. Komposisi kimia bahan baku yang berbeda sangat mempengaruhi karakteristik glikogen hasil ekstraksi, sehingga uji proksimat terhadap temilok perlu dilakukan. Ekstraksi glikogen dengan alkali panas dapat menurunkan kadar pengotor glikogen yaitu residu nitrogen, namun juga dapat mendegradasi glikogen sehingga dapat menurunkan rendemen glikogen terekstrak. Residu nitrogen dari glikogen terekstrak dapat dikurangi dengan penambahan sejumlah resin kationik. Efektivitas resin kationik dalam menurunkan residu asam nukleat dari larutan ekstrak glikogen temilok selama pengadukan belum pernah dilaporkan. Residu nitrogen di dalam glikogen terekstrak, baik dalam bentuk protein maupun asam nukleat, dapat menurunkan kapasitas glikogen sebagai ko-presipitan DNA. Kapasitas dan kinerja glikogen temilok dengan residu nitrogen tertentu sebagai ko-presipitan DNA berukuran nanogram atau picogram yang diekstrak dari tulang manusia belum pernah dilaporkan sehingga penelitian ini penting untuk dilakukan. 1.3 Tujuan Penelitian Tujuan penelitian ini adalah menentukan : 1) Konsentrasi KOH (%) yang optimal untuk menghasilkan ekstrak glikogen temilok dengan residu nitrogen yang rendah. 2) Lama pengadukan (jam) dan persentase resin kationik Amberlite IR-120 Na (g resin per 100 g temilok) yang optimal untuk menghasilkan ekstrak glikogen temilok dengan residu asam nukleat paling rendah. 3) Konsentrasi DNA femur (ng/µl) yang terpresipitasi setelah larutan ekstrak glikogen ditambahkan sebagai ko-presipitan dalam media etanol.

5 5 1.4 Manfaat Penelitian Penelitian ini dapat digunakan sebagai informasi dasar bagi optimalisasi ekstraksi glikogen temilok dengan metode alkali panas. Pemanfaatan temilok sebagai bahan baku alternatif sumber glikogen dapat menggantikan penggunaan remis dan tiram yang lebih populer sebagai bahan pangan. Glikogen yang dihasilkan diharapkan mengandung residu pengotor yang sangat rendah, sehingga dapat diaplikasikan sebagai ko-presipitan DNA yang pada saat ini harganya masih relatif mahal, yaitu sekitar US$ 179 per ml. 1.5 Hipotesis 1) Konsentrasi KOH mempengaruhi residu nitrogen ekstrak glikogen. 2) Lama pengadukan dan persentase resin kationik mempengaruhi rendemen glikogen terekstrak dan residu asam nukleatnya. 3) Penambahan glikogen temilok sebagai ko-presipitan mempengaruhi jumlah DNA femur yang terpresipitasi.

6 6