BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

Transkripsi

1 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui apakah analisis menggunakan spectroscopy fourier transform infrared (FTIR) dapat digunakan untuk melakukan identifikasi bakteri melalui spektra FTIR asam lemak yang terdapat pada bakteri. Analisis kandungan asam lemak bakteri dalam penelitian ini menggunakan kombinasi metode FTIR dengan principle component analysis (PCA) secara kualitatif, yang bertujuan untuk mengetahui kemampuan metode tersebut dalam menganalisis kandungan asam lemak bakteri, sehingga dapat digunakan untuk identifikasi bakteri secara cepat. Analisis asam lemak dalam bakteri menggunakan kombinasi antara FTIR dengan PCA karena metode tersebut memiliki keuntungan berupa sensitifitas yang tinggi, waktu analisis cepat, akurasi dan reprodusibilitas frekuensi yang baik. Dengan menggunakan spektroskopi inframerah untuk mengukur getaran ikatan gugus fungsional dalam asam lemak yang diperoleh dari sel-sel bakteri maka diperoleh spektrum inframerah pada daerah sidik jari yang digunakan untuk identifikasi. Untuk mengekstrak dan menganalisis informasi yang khas dari kompleks asam lemak bakteri tertentu dari spektrum inframerah. metode statistik juga diperlukan, algoritma yang tersedia secara komersial berbasis komputer statistik yang digunakan dalam penelitian ini adalah analisis Principal component analysis (PCA). PCA pada dasarnya adalah teknik reduksi data multivariat, ketika antar variabel terjadi korelasi. Sampel dengan komponen utama yang hampir sama mempunyai sifat fisika-kimia yang hampir sama, sehingga PCA dapat digunakan untuk pengelompokan. Oleh karena itu, PCA sering disebut juga sebagai variabel tersembunyi (latent variables) karena kemampuannya sebagai teknik untuk melakukan pengelompokan. Penelitian sebelumnya pada isolat WK45 telah diuji biokimia yang dilakukan oleh Yulianis pada tahun 2012 antara lain : 18

2 1. Uji Katalase Isolat WK45 negatif mengandung H2O2. uji katalase untuk mengetahui bakteri tersebut aerob atau tidak yang ditandai dengan ada tidaknya gas H2O2, dengan adanya gas tersebut bakteri bersifat aerob yang dapat menghasilkan enzim katalase. 2. Uji Oksidase Isolat WK45 negatif mengandung enzim sitokrom C oksidase. Enzim sitokrom C oksidase berperan penting dalam transport elektron selama respirasi aerob. Enzim tersebut dihasilkan oleh bakteri aerob, fakultatif anaerob dan mikroaerofilik. 3. Uji Methyl Red Isolat WK45 terbentuk cincin berwarna merah maka bakteri tersebut positif dapat memfermentasikan glukosa untuk menghasilkan asam. 4. Uji Voges Proskauer Isolat WK45 positif menghasilkan asetimetil karbinol dan fermentasi glukosa karena larutan berubah menjadi merah. Asetilmetil karbinol dalam lingkungan yang mengandung potasium hidroksida dan udara, teroksidasi menjadi senyawa diasetil. Senyawa ini dengan alfa-naftol dan inti guanidine serta asam-aminoorgania (dari pepton) menghasilkan warna merah. Identifikasi bakteri isolat WK45 dilakukan berdasarkan buku identifikasi bakteri dari Holt dkk (1994) dalam Bergey s Manual Of Determinative Bacteriology 9 th. Identifikasi diawali dengan mengamati hasil uji katalase dan oksidase dalam buku experimental mikrobiology. Bakteri negatif oksidase yaitu bakteri streptococcus, leuconostoc, lactobacillus dan clostridium. Dengan demikian bakteri isolat WK45 termasuk dalam genus Streptococcus. Kemudian penelitian selanjutnya yang dilakukan oleh Hendri pada tahun 2013 pada isolat WK45 memiliki ukuran fragmen DNA setelah dibandingkan

3 dengan maker yaitu 1600bp (1,6 kbp). Yang kemudian dibandingkan dengan genus streptococcus kemudian spesies bakteri yang dipilih sebagai pembanding adalah Streptococcus pneumonia teramplifikasi pada ukuran 1,5Kbp dan Streptococcus pneumonia 1055 teramplifikasi pada ukuran 1,4 Kbp. Hasil penelitian menunjukan bahwa enzim hindiii tidak berhasil memotong produk PCR dari 16S rrna dari bakteri isolat WK45. A. Ekstraksi Lemak Bakteri Ekstraksi asam lemak bakteri menggunakan metode saponifikasi. Saponifikasi adalah proses hidrolisis ester dengan alkali pada lemak, biasanya dengan penambahan basa kuat hal ini sesuai dengan metode yang dilakukan oleh Sasser (1990). Saponifikasi pada penelitian ini menggunakan larutan NaOH 3,75N yang dilarutkan dalam metanol-air hal ini bertujuan untuk melisiskan sel bakteri. Bakteri yang sudah ditumbuhkan pada media nutrient borth yang diinkubasi selama 24 jam pada suhu optimal pertumbuhan bakteri tersebut pada suhu 37 o C sambil dishaker. kemudian dipanen dengan cara bakteri yang sudah tumbuh pada media cair dimasukkan dalam tabung flakon clonikal yang sudah steril lalu disentrifuge dengan kecepatan 3000 rpm selama 15 menit maka bakteri akan mengendap. Endapan bakteri dimasukan dalam mikrotube dan ditimbang antara mg lalu ditambahkan dengan cairan saponikasi sebanyak 1,0 ml kemudian divortex sebentar lalu dimasukkan kedalam wadah yang berisi air mendidih selama ±5 menit. Vortex kembali selama 5-10 detik kemudian masukan kembali kedalam wadah berisi air mendidih untuk menyelesaikan pemanasan 30 menit. B. Analisis lemak dengan FTIR FTIR memiliki prinsip spektroskopi, yaitu memanfaatkan sinar cahaya untuk analisis. Prinsip analisis FTIR adalah menggunakan sinar radiasi inframerah. Signal yang ditangkap oleh detektor dikonversi menggunakan converter analog-to-digital, kemudian signal digital ditransfer menuju computer untuk Fourier-transformation (Stuart, 2004). Spektra IR merupakan teknik analisis kualitatif yang sangat bagus karena spektra IR

4 merupakan spetra sidik jari yang berarti bahwa tidak ada 2 molekul yang mempunyai spektrum IR yang sama, baik dari jumlah puncak, intensitas, atau frekuensi eksak untuk tiap puncak. Analisis spektroskopi FTIR didasarkan pada karakterisasi gugus fungsi yang terdapat pada asam lemak bakteri. Data spektra IR masingmasing sampel diperoleh dari hasil scanning dengan alat FTIR dengan asesoris ATR (Attenuated Total Reflectance) kemudian discaning 32 kali pada rentang bilangan gelombang cm -1 dengan resolusi 16 cm -1 dan direkam dalam bentuk absorbansi. Keuntungan menggunakan ATR adalah dapat digunakan untuk sampel yang mengandung air atau yang bersifat asam di alam dengan data spektra inframerah yang optimal pada rentang frekuensi antara 4000 cm -1 sampai 400cm -1, dan cara pengerjaan yang mudah dengan cara meneteskan sampel diatas kristal ATR. Asam lemak dari setiap bakteri dibaca dengan spektrokopi FTIR menggunakan teknik penanganan ATR yang dilakukan dengan cara meneteskan larutan hasil ekstraksi pada kristal ZnSe. Merupakan kristal yang memiliki indeks bias yang tinggi. Spektroskopi inframerah ATR menggunakan fenomena pemantulan internal total. Berkas radiasi yang memasuki kristal akan mengalami pemantulan internal total ketika sudut datang pada permukaan antara sampel dan kristal lebih besar dari sudut kritisnya. Sudut kritis merupakan fungsi indeks bias dua permukaan. Berkas sinar akan mempenetrasikan sebagian panjang gelombang di luar permukaan yang memantul, dan ketika sesuatu bahan yang secara selektif mampu menyerap radiasi berada di atas permukaan kristal ATR, maka berkas sinar akan kehilangan energi pada panjang gelombang yang mana bahan (sampel) menyerap pada panjang gelombang tersebut kemudian akan dibaca oleh detektor dan diterjemahkan sebagai spektra FTIR. Untuk menghindari adanya variasi spektra antara sampel yang satu dengan yang lainnya, maka spektrum dasar (background) diukur setiap kali sebelum pengukuran dimulai. Pembacaan spektrum dasar dilakukan karena spektroskopi FTIR merupakan single beam sehingga pembacaan sampel

5 dilakukan satu persatu. Pengukuran background ini merupakan pengukuran spektrum lingkungan, yang terdiri dari gas dan uap air yang dapat mengabsorpsi sinar inframerah. Pada saat analisis sampel spektrum yang diperoleh merupakan hasil rasio/pengurangan spektra sampel dikurangkan dengan background udara secara otomatis untuk menghasilkan spektra sampel yang dianalisis. Pengukuran resolusi 16 cm -1 menunjukan setiap jarak ukur 16cm -1 terdapat satu titik pengukuran intensitas. Resolusi akan mempengaruhi pola pita yang terjadi, sehingga pemilihan resolusi yang kecil bertujuan agar puncak terlihat jelas, karena semakin kecil resolusi maka puncak akan semakin terlihat jelas dan memudahkan pengamatan. Ada tiga teknik utama untuk identifikasi bakteri yaitu tes biokimia, profil asam lemak, dan sekuensing DNA. Dalam MIDI Sherlock digunakan untuk identifikasi mikroba. Sherlock Sistem mengidentifikasi mikroorganisme berdasarkan analisis kromatografi gas (GC) dengan mengekstraksi asam lemak mikroba dalam bentuk metil esternya. Profil asam lemak mikroba yang unik dari satu spesies ke spesies lain, dan ini telah memungkinkan untuk melakukan identifikasi dan pembuatan data library spesies mikroba. Saat ini Sherlock Sistem memiliki data library lebih dari spesies bakteri dan 200 spesies ragi. Lebih dari 300 asam lemak dan senyawa terkait ditemukan pada bakteri. Kekayaan informasi yang terkandung dalam senyawa ini adalah baik dalam perbedaan kualitatif (biasanya di tingkat genus) dan perbedaan kuantitatif (biasanya di tingkat spesies). Dengan demikian Spekra FTIR asam lemak dari setiap bakteri (Gambar 1) dapat digunakan untuk melakukan identifikasi mikroba. Jika diamati secara visual terlihat mirip namun tetap ada perbedaan antara intensitas dan absorbansi maksimum antar spektra selain itu juga ada peakpeak tertentu yang khas muncul pada spektrum FTIR asam lemak bakteri tertentu. Hal ini disebabkan karena adanya perbedaan komposisi asam lemak pada bakteri. Kebanyakan asam lemak ditemukan dalam bentuk esterifikasi sebagai triacylglycerol atau glycerophospholipid. Phosphatidate merupakan

6 lanjutan dalam sintesis triacylglycesol atau glycerophospholipid. Itu dibentuk dari pemindahan gugus acyl dari molekul lemak acyl CoA pada atom C-1 dan C-2 dari senyawa glycerol-3-phosphate. (Horton, 2006) Gambar 1. Spektra FTIR asam lemak 1 (S. mutan), 2 (S. pneumonia), 3 (isolat WK 45), 4 (E. coli) pada bilangan gelombang cm -1. Secara visual perbedaan spektrum FTIR asam lemak tiap bakteri yaitu pada peak a yang khas dibilangan gelombang cm -1 merupakan Vibrasi P H ulur,. Gugus pospat pada bakteri banyak terdapat pada bakteri gram positif karena pada bakteri gram positif, pada dinding sel bakteri terdiri atas beberapa lapis peptidoglikan dan senyawa nonpeptidoglikan. Senyawa nonpeptidoglikan tersebut adalah asam teikoat, asam teikuronat, polisakarida, asam lipotekoat, glikolipid, dan asam mikolat. Asam teikoat merupakan polimer robitol fosfat atau gliserol fosfat. Fungsi utama asam teikoat adalah memberikan bentuk sel bakteri. Polisakarida merupakan senyawa penting dalam klasifikasi streptococcus spp yaitu untuk membedakan kelompok serologisnya. Asam lipoteikoat (LTA) merupakan polimer gliserol fosfat dan lemak yang terikat secara kovalen. (Purwoko, 2009). Kemudian pada peak bilangan gelombang 1735 cm -1 merupakan vibrasi ulur C=O, kemudian pada peak bilangan gelombang 771 cm -1 merupakan pita karakteristik untuk senyawa aromatik tersubtitusi mono. Dengan adanya peak-peak yang khas

7 pada spektrum FTIR asam lemak bakteri dijadikan dasar untuk melakukan identifikasi bakteri. Adapun peak-peak yang lain muncul pada Spektrum FTIR asam lemak antara lain Vibrasi ulur OH pada asam lemak yang muncul sebagai serangkaian pita yang terdistribusi pada kisaran yang sangat lebar yaitu di antara cm -1. Meskipun pita ulur O H cukup lebar, vibrasi ulur C H alifatik yang karakteristik akan muncul di sekitar 2915cm -1. Vibrasi ulur C=C diketahui pada bilangan cm -1. Pita yang kuat di sekitar cm -1 merupakan pita karakteristik untuk senyawa aromatik tersubtitusi mono. Vibrasi P H ulur terjadi di daerah cm -1. Senyawa-senyawa fosfor alifatik yang mengandung ikatan P O C menunjukan pita kuat antara cm -1 disebabkan oleh vibrasi asimetrik ulur. Dua buah pita yang ditimbulkan oleh uluran C O dan tekukan O H dalam spektrum asam lemak muncul di dekat cm -1 dan didekat cm -1 berturut-turut. Kedua buah pita tersebut melibatkan antaraksi-antaraksi antara uluran C O dan tekukan C O H pada bidang. Asam-asam lemak berantai panjang biasanya muncul sebagai dwikembar. Pita tekukan C O H di dekat cm -1 mempunyai kekuatan sedang dan terletak di daerah yang sama dengan getaran gunting CH2 yang dilakukan oleh gugus CH2 tetangga karbonil. C. Analisis kualitatif asam lemak dengan principle component analysis (PCA) Peak dari spektrum FTIR yang diperoleh tersebut dimasukan ke multivariat statistik Program MINITAB 16 dengan analisis menggunakan teknik principle component analysis (PCA) merupakan teknik yang digunankan untuk mengklasifikasikam sampel berdasarkan kemiripan yang terjadi diantara sampel, sehingga dapat digunakan untuk mengklasifikasi antara setiap asam lemak bakteri menggunakan variabel intensitas puncak (absorbansi) yang sesuai dengan hukum lamber beer hasil spektra FTIR. Daerah yang diambil yaitu pada bilangan gelombang yang spesifik yang

8 terdapat pada setiap bakteri. Dengan dipilihnya daerah yang spesifik bertujuan untuk mengurangi variabel data dan mempermudah pengelompokan bakteri. Nilai absorbansi pada daerah sidik jari berasal dari vibrasi-vibrasi yang tidak sempurna, sehingga perubahan sterik atau elektrolik yang kecil dapat mengakibatkan pergeseran intensitas puncak. Sehingga daerah ini dipakai untuk klasifikasi dengan PCA karena pergeseran speksifik. PC1 yang merupakan variabel terbesar untuk lemak dan PC2 yang merupakan variabel terbesar kedua adalah lemak sampel. Principal component analysis (PCA) pada dasarnya adalah teknik reduksi data multivariat, ketika antar variabel terjadi korelasi. Objek (sampel) dengan komponen utama komponen utama (principle components, PCs) yang hampir sama mempunyai sifat fisika-kimia yang hampir sama, sehingga PCA dapat digunakan untuk pengelompokkan. Oleh karena itu, PCA sering disebut juga sebagai variabel tersembunyi (latent variables) karena kemampuannya sebagai tetknik untuk melakukan pengelompokkan. Dari spektrum FTIR terlihat bahwa secara umum sampel memiliki puncak-puncak serapan pada bilangan gelombang yang hampir identik, namun jika dibandingkan lebih rinci, diantara puncak-puncak serapan yang dihasilkan (absorbansi) pada masing-masing bilangan gelombang secara kualitatif relatif berbeda. Berdasarkan kontribusi PC1 dan PC2 maka dapat dibuat kurva score plot. Kurva score plot digunakan untuk menaksir struktur data yaitu sebagai dasar perbedaan lemak pada setiap bakteri. Semakin dekat letak antara sampel pada score plot, maka semakin besar pula kemiripannya atau sampel merupakan kelompok yang sama. Sampel dengan nilai score plot yang hampir sama mempunyai sifat fisika kimia yang hampir sama. Pengelompokan dilakukan berdasarkan posisi sampel pada score plot, apakah memiliki nilai PC1 dan PC2 yang positif atau negatif.

9 Score Plot of C2;...; C7 2 Second Component E. coli 1 E. coli 2 E. coli 3 S. S. mutan mutan 3 1 S. mutan 2 S. pneumonia 3 S. pneumonia 1 S. pneumonia 2-2 Isolat WK45.2 Isolat WK45.3 Isolat WK First Component 1 2 Gambar 2. Hasil analisis score plot asam lemak bakteri secara kualitatif dengan menggunakan PCA Bedasarkan hasil kurva score plot diatas bakteri dibagi menjadi 4 kuadran. Semakin dekat jarak antara titik maka semakin dekat dengan pula hubungan yang dimiliki oleh antara sampel yang dianalisis nampak bahwa S. pneumonia dan isolat WK45 terletak pada kuadran yang sama hal ini menunjukan bahwa isolat WK45 memiliki sifat fisika dan kimia asam lemak yang hampir sama. Sedangkan E. coli dan S. mutan terletak pada kuadran yang berbeda hal ini menunjukan bahwa E. coli dan S. mutan meliki sifat fisika dan kimia asam lemak yang berbeda dari sempel bakteri yang lain.