BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

Transkripsi

1 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1. Hasil Pemisahan dengan VLC Hasil pemisahaan dengan VLC menggimakan eluen heksan 100% sampai diklorometan : metanol (50 : 50) didiperoleh 11 fraksi. Pengujian KLT terhadap pemisahaan VLC menunjukkan adanya vial yang mempunyai harga Rf yang sama sehingga dapat digabungkan yaitu fraksi 7 dan fraksi 8 (Lampiran 4), hasil gabungan dilakukan uji KLT kembali dan tidak dilakukan pemisahan lebih lanjut. Hasil KLT tidak dilakukan pemisahaan lebih lanjut karena dari hasil uji toksisitas fraksi 7 dan fraksi 8 tidak bersifat toksik terhadap larva udang dan fraksi tersebut dapat dilihat pada Lampiran 3 dan Tabel 1. Tabel 1. KLT hasil VLC No. No. Berat Keterangan Fraksi Vial (g) F, noda F noda F noda F noda F noda F noda F noda F noda F noda F,o noda Fn noda tidak naik Pemisahan dengan kromatografi kolom Hasil pemisahaan kromatografi kolom dari F2 dan F3 dilakukan uji KLT dengan eluen heksan : diklorometan (7 : 3) dan diperoleh senyawa F23 dan F37. Hasil pemisahannya diperoleh kristal bubuk berwama putih, dari hasil KLT kedua kristal tersebut mempunyai harga Rf yang sama dan didukung dengan pengukuran titik leleh kedua senyawa tersebut, kemudian dilakukan juga KLT 24

2 dengan membandingkan senyawa TsM dan TS menunjukkan bahwa ketiga senyawa tersebut sama karena harga Rf nya sama. Hasil KLT ketiga senyawa tersebut dapat dilihat pada lampiran 10. Tabel 2. KLT hasil kolom kromatografi F2 No No vial Eluen Rf Keterangan H:DCM (100%) 0.5 ; noda noda J ; 0.6 ; noda H:DCM (9:1) noda Tabel 3. KLT hasil kolom kromatografi F3 No No vial Eluen Rf Keterangan Heksan(100%) H:DCM(9:1) 0.48 ; noda H:DCM (8:2) 0.5 ; noda H:DCM (7:3) 0.5 ; noda noda H:DCM (6:4) 0.36 ; noda H:DCM (5:5) 0.32 ; noda H:DCM (4:6) noda H:DCM (3:7) noda noda noda H:DCM (2:8) noda ; noda 0.04; noda 25

3 Pemisahan dengan KLT preparatif Hasil dari KLT preparatif nodanya tidak terpisah karena nodanya tidak begitu jelas ketika dilihat pada lampu UV. Hasil uji KLT dapat dilihat pada Lampiran Isolasi dan pemurnian Hasil pemisahaan dari F2 sebanyak gram diperoleh senyawa TsH sebanyak 32 miligram berbentuk bubuk putih dengan titik leleh "C, sedikit larut dengan metanol, larut dajam pelarut n-heksan. Senyawa hasil isolasi dari kolom kromatogrfi F3 sebanyak 0.9 gram diperoleh senyawa yang sama dengan fraksi 2 sebanyak 28 miligram berbentuk bubuk putih dengan titik leleh "C. Hasil analisis KLT dapat dilihat pada Lampiran Rekristalisasi dan penentuan titik leleh Kristal yang diperoleh dari fraksi 2 dan fraksi 3 direkristalisasi menghasilkan kristal bubuk putih seberat 28 mg dan 32 mg kemudian diukur titik lelehnya dengan menggunakan alat Fisher Jhon, untuk mengetahui kristal tersebut telah mumi dilakukan uji KLT dengan berbagai eluen yang hasilnya tetap satu noda. Hasil analisis KLT dapat dilihat pada Lampiran 9 dan Tabel 4. Tabel 4. Hasil uji KLT dan titik leleh senyawa TsH Karakteristik senyawa TsH Senyawa TsH Titik leleli 180"-182"C Bentuk Kristal putih Perbandingan eluen dan harga Rf n-heksan : diklorometan (7:3); Rf = 0,56 n-heksan : diklorometan (5:5); Rf = 0,75 n-heksan : diklorometan (3:7); Rf = Hasil pemenksaan spektroskopi ultraviolet Hasil pemeriksaan dengan menggunakan spektroskopi ultraviolet terhadap senyawa TsH dalam pelarut kloroform menunjukkan serapan maksimum pada panjang gelombang 276 nm(a = 0.085), nm(a = 0.084) dan 234 nm (A= 0.246) (Gambar 3). 26

4 Hasil pemeriksaan spektroskopi inframerah Spektrum inframerah untuk senyawa TsH menunjukkan adanya pita serapan pada bilangan gelombang : cm"' (sedang), cm'' (sedang), cm"' (sedang), cm'' (kuat), cm'' (sedang), cm'' (sedang), cm"' (kuat), cm"' (lemah), cm"' (lemah) (Gambar 2). Cambaf 4. Spektrum IR senyawa TsTi Hasil pemeriksaan spektroskopi NMR Karakterisasi senyawa TsH menggunakan spektroskopi NMR yang meliputi NMR ID yakni 'H-NMR. Spektrum 'H-NMR (Gambar 4) memperlihatkan pergeseran kimia proton. Pelarut yang digunakan untuk 27

5 pengukuran spektrum NMR yaitu CDCI3, spektrum 'H-NMR diukur pada frekwensi 500 MHz. Gambar 5. Spektrum ' H-NMR senyawa TsH X t fittyr Miami OC Gambar 6. Spektrum '^C-NMR senyawa TsH 28

6 Hasil uji toiisisitas Uji pendahuluan aktifitas sitotoksik dengan metoda Brine Shrimps Lethality Test (BSLT) terhadap ekstrak total n-heksan dan hasil VLC untuk Fi, F2, F3, F4., F5, Fe, F7, Fg, F9, Fio, Fi 1, dapat dilihat pada Tabel 5. Tabel 5. Nilai LC50 ekstrak total, Fi, F2, F3, F4, F5, Fe, F7, Fg, F9, Fio, dan Fn. No Fraksi LC50 (ppm) 1 Ekstrak total F, F F F F F Fg F, F,o Fn TsH Pembahasan Pemisahan menggunakan kromatografi vakum cair dihasilkan 11 fraksi, yaitu Fi, F2, F3, F4, F5, Fe, F7, Fg^ F9, Fio, dan Fn. Dalam hal ini yang menjadi alasan kenapa F2 dan F3 yang dipilih imtuk diteliti hanya karena fraksi ini diperoleh paling banyak dibandingkan fraksi-fraksi lainnya yang merupakan hasil partisi dengan menggunakan kromatografi vakum cair dan pada fraksi 3 sudah berupa kristal kuning tetapi masih berbentuk dua noda dengan uji KLT. Seianjutnya F2 dan F3 ini dipisahkan menggunakan kromatografi kolom. Fasa diam (eluen) yang digimakan untuk kromatografi kolom ini berdasarkan sistem "S^ep Gradient Polarity^ yaitu menggimakan pelarut yang kepolaraimya ditingkatkan secara perlahan-lahan sehingga didapatkan pemisahan sampel yang cukup baik. 29

7 Fraksi-fraksi hasil pemisahan dengan kromatografi kolom seianjutnya diuji dengan KLT untuk mengetahuifraksi-fraksimana saja yang memiliki harga Rf {Retardation Factor) yang sama sehingga dapat digabungkan menjadi satu fraksi. Eluen yang digunakan untuk uji KLT hasil pemisahan kromatografi kolom dengan menggimakan eluen heksan : diklorometan (7 : 3). Kristal yang diperoleh dari pemisahan kolom kromatografi kedua fraksi tersebut dimumikan dengan cara rekristalisasi. Hasil isolasi diperoleh dua kristal mumi yaitu F23 dan F37. Hal ini dibuktikan dengan uji KLT masing-masing senyawa dan gabungan dari kedua senyawa tersebut dengan menggunakan eluen heksan : diklorometan (7 : 3), dilihat dari pola kromatogramnya dapat diasumsikan bahwa kedua senyawa tersebut sama, jadi untuk analisis seianjutnya hanya menggunakan satu senyawa saja. Senyawa yang diperoleh dilakukan uji KLT dengan membandingkan senyawa yang diperoleh peneliti terdahulu yaitu senyawa TsM (Mamik., 2009) dan TS (Deni.,2009), dilihat dari pola kromatogram ketiga senyawa ini diasumsikan sama, pola kromatogram ketiga senyawa ini dapat dilihat pada Lampiran 10. Tabel 6. Data spektrum inframerah senyawa TsH, TsM dan TS No Pita serapan Pita serapan Pita serapan Keterangan senyawa TsH (cm'') senyawa TsM (cm"') senyawa TS (cm') (1) 3446 Vibrasi ulur O-H ) (s) 2949 Vibrasi ulur C-H (s) 2924 alkana 2910 (s) (s) 2848 Vibrasi ulur C-H 2852 (s) aldehid , (k) 1734 C=0 ester ( C=C 1454 (s) (s) 1365 Vibrasi tekuk C (k) 1244 H dari CH3 gemdimetil (1) 1145 Vibrasi ulur C-O (1)

8 Tabel 7. Data spektrum UV TsH, TsM dan TS No X senyawa TsM (nm) X senyawa TsM (nm) X senyawa TS (nm) ] Senyawa yang didapat kemudian dilakukan uji KLT dengan berbagai variasi perbandingan yaitu eluen heksan : diklorometan (7 : 3), heksan : diklorometan (5 : 5) dan heksan : diklorometan (3 : 7) menunjukkan pola satu noda dan dilakukan pengukuran titik leleh yang mempunyai nilai C maka senyawa ini dapat dikatakan mumi karena harga titik lelehnya dengan kisaran < 2 menunjukkan bahwa kristal telah mumi. Analisis spektrum ultraviolet dari senyawa TsH dalam kloroform menunjukkan serapan maksimum pada panjang gelombang 276 nm(a = 0.085), nm(a = 0.084) dan 234 nm (A= 0.246), ini menunjukkan bahwa senyawa TsH tidak memiliki sistem elektron n terkonjugasi. Serapan ini hanya disebabkan oleh gugus karbonil. Hal ini didukung oleh data IR yang menunjukkan serapan pada panjang gelombang cm"' yang mengindikasikan adanya karbonil. Analisis spektrum inframerah senyawa TsH memberikan informasi bahwa serapan pada bilangan gelombang cm"', cm"' mengindikasikan adanya vibrasi C-H alkana, serapan pada bilangan gelombang cm"' mengindikasikan adanya vibrasi C-H aldehid, bilangan gelombang 1734,01 cm"' mengindikasikan adanya gugus C=0 (karbonil), bilangan gelombang cm"' menimjukan adanya CH dari aldehid, bilangan gelombang 1452,40 cm"' mengindikasikan adanya vibrasi C-H alkena, bilangan gelombang 1381,03 cm"', 1365,60 cm"' mengindikasikan adanya vibrasi C-H dari -CH2-, bilangan gelombang cm"' mengindikasikan adanya vibrasi tekuk C-H dari -CHs, Serapan pada panjang gelombang cm"', cm"' dan cm'memperlihatkan adanya vibrasi ulur C-O. Spektrum ' H-NMR senyawa TsH memperlihatkan adanya 4 sinyal singlet proton terdapat pada 6H ppm, 5H ppm, 5H ppm, 6H ppm, 5H ppm, seianjutnya terdapat 3 sinyal dublet proton pada 5H ppm, 5H ppm, 6H 0.86 ppm. 4 sinyal triplet proton terdapat pada 8H ppm, 5H 4.50 ppm, 6H ppm, 6H ppm, 5H ppm. 7 sinyal multiplet 31

9 proton terdapat pada 5H 2.00, 5H ppm, 8H ppm, 6H ppm, 6H ppm, 5H ppm, 6H ppm (Tabel 9). Spektrum '^C-NMR TsH menunjukkan senyawa ini mengandung 31 atom karbon yang muncul pada 6c 15.9 ppm, 6c 16.9 ppm, 6c 17.0 ppm, 5c 17.7 ppm, 6c 18.4 ppm, 6c 21.5 ppm, 6c21.6 ppm, 5c23.4 ppm, 5c 23.5 ppm, 5c 23.8 ppm, 5c 26.8 ppm, 6c 28.2 ppm, 6c 28.9 ppm, 5c 31.4 ppm, 6c 33.0 ppm, 6c 33.9 ppm, 6c 36.9 ppm, 5c 37.9 ppm, 6c 38.6 ppm, 6c 39.7 ppm, 6c 39.8 ppm, 6c 40.2 ppm, 6c 41.7 ppm, 5c 42.2 ppm, 6c 47.8 ppm, 5c 55.4 ppm, 5c 59.2 ppm, 5c 81.1 ppm, 6c ppm, 5c ppm, 5c ppm (Tabel 8). Tabel 8. Perbandingan data pergeseran kimia 'H & '^C NMR senyawa TsH (CDCI3, 500 MHz) dengan 'H-NMR (CDCI3) dan '^C-NMR (CDCI3) senyawa metil oleanolat. No 'H-NMR 'H-NMR»c- '^C-NMR TsH Metil oleanolat NMR Metil oleanolat (Mamik,S.^008) TsH (Mamik,S.^008) , , , , , , , , , , , , , , , ,

10 Berdasarkan perbandingan data NMR senyawa TsH dengan senyawa metil oleanolat yang telah dilakukan oleh Mamik, S tahun 2008 (Tabel 9) dan senyawa TS oleh Deni, S tahun 2008 hanya terdapat sedikit perbedaan pergeseran kimia sehingga dapat diasumsikan senyawa TsH adalah metil oleanolat. Analisis IR pada senyawa TsH tidak menunjiikkan adanya vibrasi OH, ini disebabkan sistem pengaturan dari penarikan bilangan gelombang kurang pas sehingga vibrasi karakteristik dari OH tidak muncul tetapi jika diperhatikan dengan seksama ada spektrum yang speksifik sekitar 3450 cm'' dan pada TsM vibrasi OH pada bilangan gelombang cm'' dan TS pada bilangan gelombeng cm"'. Gambar 7. Metil oleanolat Uji toksisitas yang dilakukan dengan metoda Brine Shrimps Lethality Test (BSLT) menggunakan larva Artemia salina Leach terhadap ekstrak total n- heksan dan fi-aksi-fraksi menghasilkan suatu data (Tabel 3) yang kemudian diolah dengan metoda kurva xmtuk menentukan nilai LC50 (Lampiran 11). Dari analisis data diperoleh nilai LC50 untuk ekstrak total n-heksan ppm dan fi-aksi Fi, F3, F4, F5, F6, F7, Fg, F9, Fio dan Fn, masing-masing ppm, ppm, 50, 8159 ppm, ppm, 39,45 ppm, ppm, ppm, ppm, ppm dan ppm. Hal ini menimjukkan bahwa ekstrak total n- heksan, F3, F4, F5, Fe dan Fio mempunyai sifat toksik, F9 mempunyai sifat sangat toksik dan Fi, F7, Fg dan Fn tidak bersifat toksik terhadap uji kematian larva udang, karena suatu sampel dianggap toksik terhadap uji kematian larva udang jika konsentrasi maksimum 1000 ppm dengan LC50 < 500 ppm (Zetra dkk, 2007). Uji toksisitas senyawa TsH mempunyai nilai LC50 yaitu ppm, hal ini menunjukkan bahwa senyawa TsH bersifat toksik karena suatu senyawa dikatakan aktif anti kanker memiliki LC50 sebjisar < 250 ppm dan maksimal konsentrasi 500 ppm (Zetra dkk, 2007). 33

11 Hasil uji toksisitas pada ekstrak total, Fi, F2, F3, F4, F5, F6, F7, Fg, F9, Fio, Fu dan TsH menunjukan bahwa senyawa yang di isolasi dari fraksi n heksan buah Tabernaemontana spaerocarpha sudah terpisah antara senyawa yang aktif dan senyawa yang tidak aktif Senyawa TsH mempunyai sifat toksik karena senyawa TsH mempunyai gugus fimgsi yang bersifat aktif Senyawa TsH, TsM dan TS didapat dari jenis tanaman yang sama yaitu Tabernaemontana sphaerocarpa, tetapi pada senyawa TsM diperoleh dari fraksi etil asetat pada daun dan hanya dilakukan karaterisasi untuk penentuan struktur saja tetapi tidak dilakukan uji aktivitas dari senyawa yang didapat, senyawa TS dan senyawa TsH diperoleh dari fraksi heksan tapi senyawa TS dilakiikan uji anti bakteri sedangkan senyawa TsH dilakukan uji toksisitas. 34