pc13-35s-intron-sma: VEKTOR BINER FLEKSIBEL UNTUK EKSPRESI GEN TARGET SECARA KONSTITUTIF PADA TRANSFORMASI TANAMAN MELALUI AGROBACTERIUM
|
|
- Ridwan Yuwono
- 6 tahun lalu
- Tontonan:
Transkripsi
1 pc13-35s-intron-sma: VEKTOR BINER FLEKSIBEL UNTUK EKSPRESI GEN TARGET SECARA KONSTITUTIF PADA TRANSFORMASI TANAMAN MELALUI AGROBACTERIUM NATALIA LUSIANNGSIH SUMANTO SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2015
2 RINGKASAN NATALIA LUSIANINGSIH SUMANTO. pc13-35s-intron-sma: Vektor Biner Fleksibel untuk Ekspresi Gen Target Secara Konstitutif pada Transformasi Tanaman Melalui Agrobacterium. Dibimbing oleh Prof. Dr. Ir. Antonius Suwanto, M.Sc dan Dr. Sigit Purwantomo. Teknik penyisipan gen target ke dalam tanaman menggunakan vektor alami Agrobacterium telah menjadi hal rutin dalam perakitan tanaman transgenik. Bakteri ini memiliki kemampuan dalam menyalin, memindahkan, dan menyisipkan daerah T-DNA ke dalam kromosom tanaman yang berada pada vektor biner. Vektor biner pc13-35s-intron-sma memungkinkan gen target yang disisipkan pada situs SmaI (CCCGGG) diatur ekspresinya oleh promoter kuat 35S dan terminator Nos untuk membentuk cassette ekspresi dengan cepat. Gen target akan mendapat tambahan intron (cat1) di ujung 5 - dan 6 kali histidin di ujung karboksil. Keberadaan intron untuk memastikan ekspresi gen target tidak berasal dari Agrobacterium. Komponen 6 kali histidin dapat berfungsi sebagai penanda untuk purifikasi dan deteksi pada tingkat protein. Untuk mengetahui keberhasilan dari konstruksi pc13-35s-intron-sma disisipkan gen enhanced green fluorescent protein (egfp) pada situs SmaI membentuk pc13-35s-intron-egfp dan ditransformasi ke padi varietas Nipponbare menggunakan Agrobacterium EHA105. Infeksi dilakukan pada kalus yang berumur lima hari dan ditanam pada media kultivasi. Pengamatan kalus transforman yang berusia satu bulan setelah infeksi menunjukkan adanya sinyal ekspresi egfp dengan terbentuknya pendaran berwarna hijau di bawah sinar biru. Hasil ini menunjukkan bahwa vektor biner pc13-35s-intron-sma dapat digunakan untuk transformasi tanaman dengan Agrobacterium. Kata kunci: vektor biner, egfp, intron, Agrobacterium, transformasi tanaman
3 SUMMARY NATALIA LUSIANINGSIH SUMANTO. pc13-35s-intron-sma: a flexible binary vector for Agrobacterium-mediated constitutive expression of target gene in plant. Supervised by Prof. Dr. Ir. Antonius Suwanto, M.Sc and Dr. Sigit Purwantomo. Insertion technique of foreign gene into plants using natural vector Agrobacterium has become a routine practice to generate transgenic plants. Agrobacerium has an ability to -copy, -move and -insert a DNA fragment from its T-DNA region located in a binary vector into plant chromosome. The binary vector pc13-35s-intron-sma allows a target gene to be inserted in SmaI site (CCCGGG). The gene will be directed by a strong promoter 35S of CaMV to create an expression cassette and get an intron (cat1) at 5 - end and a hexa histidine at its carboxyl end. The presence of intron will assure the expression of gene is derived from the plant but not Agrobacterium. Hexa histidine could serve as Tag for protein purification and detection. The enhanced green fluorescent protein (egfp) was inserted at SmaI site of pc13-35s-intron-sma to create pc13-35s-intron-egfp. This construct was used to test the expression of the gene with additional intron driven by the 35S promoter. The 5 days of early developed calli of Nipponbare rice were infected with Agrobacterium EHA105 harboring pc13-35s-intron-egfp followed by 3 days cocultivation. Some calli in selection medium containing 50 mg L -1 hygromycin showed egfp expression at one month after infection. This result indicated that the binary vector pc13-35s-intron-sma might be use for Agrobacterium-mediated plant transformation. Keywords: binary vector, egfp, intron, Agrobacterium, plant transformation
4
5 DAFTAR ISI DAFTAR TABEL vi DAFTAR GAMBAR vi 1 PENDAHULUAN 1 Latar Belakang 1 Perumusan Masalah 2 Tujuan Penelitian 2 Manfaat Penelitian 2 Ruang Lingkup Penelitian 2 2 TINJAUAN PUSTAKA 3 Transfer gen melalui perantaraan Agrobacterium tumefaciens 3 Sistem ekspresi vektor biner 4 Promoter 35S-Intron-Sma 4 Green fluoresence protein (egfp) 5 3 METODE 5 Waktu dan Tempat Penelitian 5 Bahan 6 Alat 6 Amplifikasi fragmen DNA 6 Kloning frgamen DNA ke pgem-t Easy 7 Konstruksi plasmid pc-13-35s-intron-sma 8 Transformasi Agrobacterium tumefaciens 8 Transformasi kalus padi Nipponbare 9 Isolasi DNA genom tanaman 9 4 HASIL DAN PEMBAHASAN 10 Konstruksi vektor biner pc13-35s-intron-sma 10 Konstruksi pc13-35s-intron-egfp 11 Transformasi kalus Padi Nipponbare 12 Pembahasan 14 5 SIMPULAN DAN SARAN 17 Simpulan 17 Saran 17 DAFTAR PUSTAKA 18 RIWAYAT HIDUP 21
6 DAFTAR TABEL 1 Daftar primer yang digunakan dalam konstruksi vektor pc-35s-intron- Sma 6 DAFTAR GAMBAR 1 Struktur dasar T-DNA plasmid pcambia Struktur T-DNA plasmid biner fleksibel 2 3 Mekanisme transfer daerah T-DNA dari plasmid Ti Agrobacterium tumefaciens ke dalam kromosom tanaman 3 4 Sistem ekspresi vektor biner 4 5 Konstruksi umum daerah T-DNA pada plasmid biner 4 6 Peta konstruksi plasmid pc13-35s-intron-sma 10 7 Hasil amplifikasi fragmen promoter 35S-Intron-Sma 10 8 Hasil verifikasi koloni yang membawa plasmid pc13-35s-intron-sma 11 9 Hasil verifikasi koloni transforman yang membawa pgem-egfp Hasil verifikasi koloni yang membawa plasmid pc13-35s-intron-egfp Hasil verifikasi koloni Agrobacterium yang membawa pc13-35s-intronegfp Hasil pengamatan ekspresi gen egfp Hasil pengamataneekspresi gen egfp di kalus transforman Hasil verifikasi penyisipan T-DNA pc13-35s-intron-egfp pada empat galur kalus transgenik 14
7 1 PENDAHULUAN Latar Belakang Teknik pemindahan dan penyisipan gen target ke dalam tanaman menggunakan vektor alami Agrobacterium telah menjadi hal rutin dalam merakit tanaman transgenik. Teknik ini merupakan teknik yang relatif ekonomis dibandingkan dengan teknik lain seperti penembakan biolistik. Vektor biner dibutuhkan untuk membawa cassette gen target ke inti dan menyisipkannya di kromosom tanaman. Salah satu vektor biner yang dapat diakses bebas adalah plasmid biner dari Cambia yaitu pcambia 1301 (Gambar 1). Gen GUS (β-glucuronidase) dapat langsung digantikan oleh gen target untuk diekspresikan secara konstitutif di bawah kendali promoter 35S, akan tetapi penggantian gen GUS mengakibatkan komponen penting dari plasmid ini yaitu intron dan 6 kali histidin menjadi hilang. Gambar 1 Struktur dasar T-DNA plasmid pcambia 1301 Keberadaan intron dapat digunakan untuk memastikan ekspresi gen tidak berasal dari Agrobacterium melainkan dari tanaman. Beberapa intron yang telah digunakan antara lain adalah intron hsp70 dari jagung (Pang et al. 1996), intron dari gen katalase cat1 dari Ricinus communis (Ohta et al. 1990), dan intron gen ST-LS1 dari kentang (Vancanneyt et al. 1990). Intron gen katalase cat1 dipilih karena ukurannya yang relatif kecil (190 pb) dan dapat digabungkan dengan gen penanda GUS pada ujung 5 - (Ohta et al. 1990) atau diletakkan di tengah gen hphii (Wang et al. 1997). Sehingga, kemungkinan besar intron ini dapat juga ditambahkan pada ujung 5 - gen yang lain. Keberadaan 6 kali histidin sebagai penanda penting untuk keperluan purifikasi protein yang diekspresikan gen target. Di samping itu, keberadaan 6 kali histidin sebagai penanda dapat digunakan untuk verifikasi ekspresi gen target pada level protein. Pada protein dengan antibodi yang belum tersedia deteksi akan dapat dilakukan dengan menggunakan antibodi untuk 6 kali histidin. Gen enhanced green fluorescent protein (egfp) digunakan untuk memverifikasi proses intron splicing. Berbeda dengan gen GUS dan LUC (Luciferase), GFP memiliki keunggulan yaitu tidak memerlukan substrat sehingga deteksinya cukup menggunakan sinar biru dan tidak bersifat toksik terhadap sel hidup serta stabil. Gen ini telah ditransformasi pada beberapa tanaman seperti padi (Vain et al. 1997), tebu (Elliot et al. 1999), gandum (Jordan 2000) dan barley (Holme et al. 2006).
8 2 Perumusan Masalah Dalam penyisipan cassette gen target ke dalam kromoson tanaman salah satu hal yang paling esensial adalah konstruksi plasmid yang membawa cassette gen target tersebut. Namun, konstruksi plasmid membutuhkan waktu yang tidak sebentar. Sehingga untuk mempermudah dan mempersingkat waktu dalam konstruksi plasmid dibutuhkan plasmid fleksibel yang komponen-komponen pada cassette tersebut dapat diubah-ubah secara mudah. Oleh karena itu, perlu dikonstruksi plasmid biner fleksibel yang memiliki situs restriksi yang terbatas pada daerah promoter, situs kloning tunggal untuk menyisipkan gen target serta dilengkapi intron pada ujung 5 dan 6 kali histidin pada ujung karboksil (Gambar 2). Adanya plasmid biner fleksibel ini diharapkan dapat mempersingkat waktu dalam mengkonstruksi plasmid dan tidak perlu mengkonstruksi plasmid baru apabila ingin mengganti daerah promoter atau gen target. Gambar 2 Struktur T-DNA plasmid biner fleksibel Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan untuk mengkonstruksi plasmid biner fleksibel yang dapat mengekspresikan gen target secara konstitutif yang dilengkapi dengan 6 kali histidin sebagai penanda dan intron untuk memastikan bahwa ekspresi gen target tidak berasal dari bakteri. Manfaat Penelitian Vektor biner fleksibel pc13-35s-intron-sma yang dikonstruksi dalam penelitian ini merupakan vektor dasar yang dapat digunakan untuk mengekspresikan gen target yang bersifat fungsional pada tanaman secara konstitutif di bawah kendali promoter 35S atau promoter konstitutif lainnya seperti OsAct2 dan OsGOS2 dengan menganti promoter 35S pada situs restriksi tertentu. Ruang Lingkup Penelitian Ruang lingkup dalam penelitian ini meliputi amplifikasi fragmen promoter 35S-Intron-Sma, subkloning fragmen 35S-Intron-Sma ke pgem-t Easy (Promega), konstruksi pc13-35s-intron-sma menggunakan pcambia 1301 sebagai dasar dan verifikasi aktivitas promoter 35S dengan transformasi kalus padi Nipponbare.
9 3 2 TINJAUAN PUSTAKA Transfer gen melalui perantaraan Agrobacterium tumefaciens Teknik transformasi gen ke dalam tanaman didasari oleh penemuan bakteri tanah Agrobacterium tumefaciens yang merupakan patogen penyebab penyakit crown gall di dalam jaringan luka pada berbagai tanaman dikotil. Bagian DNA A. tumefaciens yang ditransfer ke dalam kromosom tanaman berupa T-DNA yang berada dalam plasmid Ti yang berukuran besar ( kb) (Rossi et al. 1998). Di dalam nukleus T-DNA diintegrasikan ke dalam kromosom tanaman dengan cara illegitimate recombination yaitu suatu mekanisme bergabungnya dua molekul DNA yang tidak mempunyai homologi secara luas (Offringa et al. 1990). Pada dasarnya A. tumefaciens memberikan respon kemotaksis terhadap senyawa fenol yang dilepaskan oleh jaringan tanaman yang terluka dan bergerak menurut gradien konsentrasi menuju sel yang terluka. Respon kemotaksis merupakan ekspresi konstitutif dari gen-gen kromosomal A. tumefaciens yaitu chva, chvb, psca dan att (Ziemienowicz 2000). Kontak A. tumefaciens dengan senyawa acetosyringone yang dilepaskan oleh tanaman yang terluka menginduksi transkripsi daerah vir pada plasmid Ti. Acetosiryngone kemudian berinteraksi dengan vira dan menghasilkan sinyal intraseluler oleh aktivasi virg. Gen virg yang teraktivasi kemudian mengaktifkan gen virulen lainnya (virb, virc, vird dan vire). Induksi gen vir diikuti dengan pengenalan sekuen pembatas 25 pb sebagai imperfect direct repeat/border sequences yang mengapit T-DNA. Pembatas T-DNA kemudian dipotong oleh dua protein yang dihasilkan oleh operon vird yaitu vird1 dan vird2 (Filichkin dan Gelvin 1993), sehingga diperoleh daerah T-DNA yang akan ditransfer ke dalam kromosom tanaman (Gambar 3). Gambar 3 Mekanisme transfer daerah T-DNA dari plasmid Ti Agrobacterium tumefaciens ke dalam kromosom tanaman (Filchkin dan Gelvin 1993)
10 4 Sistem ekspresi vektor biner Transfer daerah T-DNA A. tumefaciens ke dalam kromosom tanaman dilakukan dengan menggunakan vektor biner yang diperkenalkan oleh Hoekema (1983). Gen-gen vir dan daerah T-DNA berada dalam plasmid yang berbeda (Gambar 4). Selama kedua plasmid tersebut berada dalam Agrobacterium tumefaciens yang sama, protein yang dihasilkan oleh gen vir dapat membantu proses transfer daerah T-DNA ke dalam kromosom tanaman. Plasmid yang mengandung daerah T-DNA disebut dengan vektor biner sedangkan plasmid yang mengandung gen-gen vir disebut dengan vir helper. Pada proses transfer gen, vektor biner lebih efisien karena memiliki ukuran yang lebih kecil, memiliki gen penanda seleksi tanaman, situs pengenalan enzim retriksi, ori E. coli dan A. tumefaciens serta gen resisten antibiotik (Lee et al 2007). Gambar 4 Sistem ekspresi vektor biner. (A) Gen target berada terletak di daerah T-DNA pada vektor biner; (B) Gen vir berada pada vir helper (Lee et al. 2007) Secara umum daerah T-DNA pada plasmid biner dikonstruksi sehingga mengandung promoter yang mengendalikan ekspresi gen target di tanaman, terminator sebagai daerah pengenalan RNA polimerase dalam menghentikan proses transkripsi dan gen penanda seleksi tanaman (Gambar 5). Gambar 5 Konstruksi umum daerah T-DNA pada plasmid biner Promoter 35S-Intron-Sma Promoter 35S merupakan promoter konstitutif yang bertanggung jawab dalam mengendalikan transkripsi genom virus CaMV (Cauliflower Mozaic Virus) yang menginfeksi kembang kol. Promoter 35S telah umum digunakan untuk mengekspresikan gen target secara konstitutif pada tanaman karena tidak dipengaruhi oleh kondisi lingkungan dan jenis jaringan tanaman. Penggunaan promoter 35S telah diaplikasikan dalam mengendalikan ekspresi gen sgfp secara
11 konstitutif pada Arabidopsis sp. (Niwa et al. 1999). Pada penelitian ini sekuen promoter 35S didesain mengandung intron (intron cat1), situs kloning gen target (SmaI) dan 6 kali histidin sebagai penanda. Ciri khas struktur genom eukariotik adalah gen struktural yang tersusun dari intron dan ekson. Ekson merupakan urutan DNA yang akan ditranskripsi menjadi mrna kemudian ditranslasi membentuk polipeptida sedangkan intron (intragenic regions) merupakan urutan DNA yang tidak ikut ditranslasi dan akan dibuang pada tahap pasca transkripsi (Bergman 2001). Walaupun intron merupakan bagian yang tidak ditranslasi namun intron berperan dalam pengaturan sintesis protein. Intron yang tidak terpotong pada mrna mengakibatkan penyimpangan dalam ekspresi gen. Setiap intron pada gen eukariotik memiliki situs pengenalan yakni kedua basa pertama dari intron mengandung GU dan dua basa terakhir dari intron adalah AG serta kotak TACTAAC. Keseluruhan urutan basa tersebut sangat penting sebagai pengenalan enzim spliceosome untuk memotong intron dan menyambung ekson secara tepat (Deutsch dan Long 1999). Penambahan intron dapat mencegah ekspresi gen target di Agrobacterium. Green Fluoresence Protein (GFP) Protein GFP yang berasal dari Aequorea victoria merupakan salah satu jenis gen reporter yang umum digunakan sebagai penanda dalam transformasi tanaman (Cinelli et al. 2000). GFP adalah protein yang merupakan polimer dari 238 asam amino dengan berat molekul sekitar 27 kd. GFP mengandung gugus yang disebut chomophore yang berperan penting dalam menghasilkan pendaran hijau. Chromophore ini adalah kelompok tiga residu asam amino di posisi 65 (Serin), 66 (Tirosin) dan 67 (Glisin). Ketika dipaparkan pada cahaya biru (395 nm) maka pada gugus ini akan terjadi oksidasi sehingga energi yang diserap menyebabkan elektron-elektron di dalam gugus ini tereksitasi dan menghasilkan pendaran berwarna hijau (Heim et al. 1995). Dalam upaya meningkatkan ekspresi dari GFP maka dilakukan mutasi pada asam amino penyusun protein tersebut. Mutasi residu asam amino nomor 64 dari Fenilalanin menjadi Leusin dan residu asam amino nomor 65 dari Serin menjadi Tirosin membentuk enhanced GFP (egfp). Gen egfp memiliki pendaran lebih terang daripada GFP wildtype (Cormarck et al. 1996). Hal ini menyebabkan egfp banyak digunakan sebagai gen penanda dalam transformasi. 5 3 METODE Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan mulai September 2014 sampai Juni 2015 di Laboratorium Biotechnology Research and Development (R&D) PT Wilmar Benih Indonesia Cikarang, Bekasi, Jawa Barat.
12 konstitutif pada Arabidopsis sp. (Niwa et al. 1999). Pada penelitian ini sekuen promoter 35S didesain mengandung intron (intron cat1), situs kloning gen target (SmaI) dan 6 kali histidin sebagai penanda. Ciri khas struktur genom eukariotik adalah gen struktural yang tersusun dari intron dan ekson. Ekson merupakan urutan DNA yang akan ditranskripsi menjadi mrna kemudian ditranslasi membentuk polipeptida sedangkan intron (intragenic regions) merupakan urutan DNA yang tidak ikut ditranslasi dan akan dibuang pada tahap pasca transkripsi (Bergman 2001). Walaupun intron merupakan bagian yang tidak ditranslasi namun intron berperan dalam pengaturan sintesis protein. Intron yang tidak terpotong pada mrna mengakibatkan penyimpangan dalam ekspresi gen. Setiap intron pada gen eukariotik memiliki situs pengenalan yakni kedua basa pertama dari intron mengandung GU dan dua basa terakhir dari intron adalah AG serta kotak TACTAAC. Keseluruhan urutan basa tersebut sangat penting sebagai pengenalan enzim spliceosome untuk memotong intron dan menyambung ekson secara tepat (Deutsch dan Long 1999). Penambahan intron dapat mencegah ekspresi gen target di Agrobacterium. Green Fluoresence Protein (GFP) Protein GFP yang berasal dari Aequorea victoria merupakan salah satu jenis gen reporter yang umum digunakan sebagai penanda dalam transformasi tanaman (Cinelli et al. 2000). GFP adalah protein yang merupakan polimer dari 238 asam amino dengan berat molekul sekitar 27 kd. GFP mengandung gugus yang disebut chomophore yang berperan penting dalam menghasilkan pendaran hijau. Chromophore ini adalah kelompok tiga residu asam amino di posisi 65 (Serin), 66 (Tirosin) dan 67 (Glisin). Ketika dipaparkan pada cahaya biru (395 nm) maka pada gugus ini akan terjadi oksidasi sehingga energi yang diserap menyebabkan elektron-elektron di dalam gugus ini tereksitasi dan menghasilkan pendaran berwarna hijau (Heim et al. 1995). Dalam upaya meningkatkan ekspresi dari GFP maka dilakukan mutasi pada asam amino penyusun protein tersebut. Mutasi residu asam amino nomor 64 dari Fenilalanin menjadi Leusin dan residu asam amino nomor 65 dari Serin menjadi Tirosin membentuk enhanced GFP (egfp). Gen egfp memiliki pendaran lebih terang daripada GFP wildtype (Cormarck et al. 1996). Hal ini menyebabkan egfp banyak digunakan sebagai gen penanda dalam transformasi. 5 3 METODE Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan mulai September 2014 sampai Juni 2015 di Laboratorium Biotechnology Research and Development (R&D) PT Wilmar Benih Indonesia Cikarang, Bekasi, Jawa Barat.
13 6 Bahan Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah media pertumbuhan bakteri Luria Agar (tripton 1 g, ekstrak khamir 0.5 g, NaCl 1g dan agar bakteriologi 1.5 g) media Luria Bertani (tripton 1 g, yeast ekstrak 0.5 g dan NaCl 1g), agarosa 1% (Choice care), bufer TAE [Tris-Acetate-EDTA] (242 g Tris, 57.1 ml asam asetat glasial, 100 ml EDTA 0.5 M) ethidium bromide, antibiotik ampisilin (100 mg ml -1 ), kanamisin (25 mg ml -1 ), sefotaksim (100 mg ml -1 ), higromisin (15 mg ml -1 ), rifampisin (15 mg ml -1 ), kloramfenikol (25 mg ml -1 ), QIAPrep Purification Plasmid kit (Qiagen), QIAquick PCR purification gel kit (Qiagen), ddh2o, marker molekuler 1000 pb DNA ladder (Vivantis), VC 100 pb (Vivantis), 6x loading dye (Promega), Escherichia coli TOP10 (Invitrogen), PCR Go Taq Green Master Mix (Promega), enzim T4 ligase (New England Biolabs), bufer T4 DNA ligase 10x (New England Biolabs), enzim restriksi (New England Biolabs), vektor kloning pgem-t Easy (Promega), vektor ekspresi pcambia 1301, primer, polybag, tanah berpasir, kalus padi varietas Nipponbare, media N6D, acetosyringone (20 mg L -1 ), 2,4-D (2 mg L -1 ), etanol 70%, natrium hipoklorit dan air steril. Alat Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah mesin thermocycler, spektrofotometer, Geldoc UV Transilluminator (Biorad), NanoDrop 2000 (Invitrogen), sentrifus, microwave, inkubator bergoyang, autoklaf, vorteks, waterbath, laminar air flow, oven, Genetic Analyzer ABI 3130, Tissue lyser (Qiagen), cawan Petri, Erlenmeyer, tabung 1.5 ml, mikropipet dan tip. Prosedur Penelitian Amplifikasi fragmen DNA Amplifikasi fragmen DNA menggunakan metode PCR dengan denaturasi awal dilakukan selama 5 menit pada suhu 98 o C, dilanjutkan dengan siklus PCR yang terdiri dari denaturasi (30 detik 98 o C), annealing (55 o C selama 30 detik dan pemanjangan primer (72 o C dengan perhitungan 1 kb/menit) sebanyak 40 siklus). Daftar primer yang digunakan untuk amplifikasi fragmen terlampir pada tabel 1. Visualisasi produk PCR dilakukan dengan elektroforesis pada gel agarosa 1% (b/v) dilanjutkan dengan pengamatan di bawah sinar UV. Tabel 1 Daftar primer yang digunakan dalam konstruksi vektor pc-35s-intron-sma No Primer Situs restriksi Nama Diamplifikasi dari Nama plasmid Ukuran (pb) 1 35S-SE-EcoRI-F EcoRI 2 Intron-extraAA-SmaI-R BstEII 3 egfp-smai-ecorv_f SmaI 4 egfp- SmaI-EcoRV _R SmaI 5 Ujung Intron_F 6 6xHis-TGA-BstEII-R 35S-Intron-Sma pc1301 pgem-35s-intron-sma 1020 egfp egfp-smai pst2 pgem-egfp 741 Verifikasi Agrobacterium transforman yang mengandung T-DNA pc13-35-intron-egfp 787
14 7 Kloning fragmen DNA ke pgem-t Easy Purifikasi fragmen Fragmen DNA hasil PCR terlebih dahulu dikloning pada vektor pgem-t Easy (Promega). Fragmen hasil amplifikasi dipurifikasi menggunakan QIAquick PCR purification gel kit (Qiagen). Gel agarosa yang mengandung fragmen DNA yang diingiinkan dipotong dan dimasukkan ke dalam tabung 1.5 ml dan ditimbang. Ditambahkan bufer QG sebanyak 3 kali berat gel kemudian diinkubasi 60 o C, 10 menit. Sebanyak 500 µl campuran dimasukkan ke dalam spin column, disentrifugasi rpm, 1 menit. Berturut-turut dimasukkan 750 µl bufer PE dan 500 µl bufer PB kemudian masing-masing disentrifugasi rpm, 1 menit. Sebanyak 30 µl bufer EB ditambahkan dan disentrifugasi rpm, 1 menit. Ligasi fragmen DNA ke pgem-t Easy Penyambungan fragmen menggunakan enzim ligase yang dilakukan mengikuti Sambrook et al. (2001). Komposisi ligasi terdiri dari bufer T4 ligase, vektor pgem-t Easy, fragmen DNA, enzim T4 ligase dan ddh2o dengan volume total 10 µl. Campuran diinkubasi pada suhu ruang semalaman. Pembuatan Eschericia coli TOP10 kompeten Pembuatan E. coli TOP10 kompeten menggunakan perlakuan CaCl2 dan MgCl2 sesuai metode Tang et al. (1994) dengan beberapa modifikasi. Koloni tunggal E. coli TOP10 dikultur di dalam 3 ml LB dan diinkubasi dalam inkubator bergoyang 200 rpm, 37 o C semalaman. Sebanyak 200 µl kultur dimasukkan ke dalam 10 ml LB yang baru kemudian diinkubasi 200 rpm, 37 o C sampai OD600=0.4. Sebanyak 1.5 ml kultur dimasukkan ke dalam tabung 1.5 ml, disentrifugasi 5000 rpm, 4 o C 1 menit dan dibuang supernatan. Pelet diresuspensi dengan 1 ml CaCl2 (20 mm CaCl2 dan 80 mm MgCl2) dan diinkubasi 20 menit dalam es. Campuran disentrifugasi 5000 rpm, 4 o C 1 menit dan dibuang supernatan. Pelet diresuspensi kembali dengan 250 µl CaCl2 0.1 M kemudian diinkubasi 10 menit dalam es. Sebanyak 100 µl gliserol 50% ditambahkan ke dalam campuran. Transformasi Eschericia coli TOP10 Transformasi E. coli TOP10 kompeten menggunakan metode kejut panas sesuai dengan Sambrook et al. (2001). Sebanyak 10 µl plasmid dimasukkan ke dalam 100 µl sel kompeten dan diinkubasi 15 menit di dalam es. Campuran diberikan perlakukan kejut panas 42 o C 90 menit kemudian diinkubasi 15 menit di dalam es. Media Luria Bertani (LB) 1 ml ditambahkan ke dalam campuran kemudian diinkubasi dalam inkubator bergoyang 200 rpm, 37 o C 1 jam. Campuran disentrifugasi rpm selama 1 menit dan supernatan dibuang. Sebanyak 25 µl campuran disebar pada media agar LB yang telah mengandung antibiotik dan diinkubasi 37 o C semalaman. Sekuensing dan analisis hasil kloning Fragmen DNA sisipan disekuensing menggunakan ABI 3130 Genetic Analyzer. Siklus sequencing dilakukan menggunakan primer yang sesuai dan hasil sequencing dianalisis dengan menggunakan perangkat lunak Chromas Lite.
15 8 Isolasi plasmid yang mengandung fragmen sisipan Isolasi plasmid dilakukan menggunakan QIAPrep Purification Plasmid kit. Koloni tunggal bakteri transforman ditumbuhkan dalam 10 ml LB dan diinkubasi dalam inkubator bergoyang 200 rpm, 37 o C semalaman. Sebanyak 1.5 ml kultur dimasukkan ke dalam tabung 1.5 ml dan disentrifugasi 6000 rpm, 1 menit. Supernatan dibuang lalu pelet diresuspensi berturut-turut dengan 250 µl bufer P1, 250 µl bufer P2 dan 300 µl bufer N3. Sebanyak 750 µl campuran dimasukkan ke dalam spin column dan disentrifugasi 6000 rpm 1 menit. Berturut-turut dimasukkan 500 bufer PB dan 750 bufer PE kemudian masing-masing disentrifugasi rpm 1 menit. Sebanyak 30 µl bufer EB ditambahkan dan disentrifugasi rpm 1 menit. Konstruksi plasmid pc13-35s-intron-sma Konstruksi plasmid yang melibatkan pemotongan utas DNA dengan enzim restriksi dan penyambungan utas DNA dengan enzim ligase dilakukan mengikuti Sambrook et al. (2001). Fragmen promoter 35S-Intron-Sma diisolasi dengan pemotongan fragmen menggunakan enzim restriksi yang sesuai. Komposisi restriksi terdiri dari bufer enzim restriksi, plasmid rekombinan, enzim restriksi dan H2O dengan volme total 20 µl. Campuran diinkubasi sesuai dengan suhu inkubasi enzim yang digunakan selama 1 jam. Hasil pemotongan divisualisaasi pada gel agarosa 1% dan dilakukan purifikasi menggunakan QIAquick PCR purification gel kit (Qiagen). Plasmid biner pcambia 1301 dipotong dengan EcoRI dan BstEII untuk menghilangkan fragmen promoter 35S, GUS dan multiple cloning site (MCS). Backbone diligasi dengan promoter 35S-Intron-Sma untuk mendapatkan plasmid pc13-35s-intron-sma. Gen egfp disisipkan pada situs SmaI yang terdapat pada plasmid pc13-35s-intron-sma sebagai gen reporter untuk mengetahui aktivitas promoter 35S. Transformasi Agrobacterium tumefaciens Sel kompeten A. tumefaciens EHA105 (Hood et al. 1993) dibuat dengan perlakuan CaCl2 dan transformasi vektor biner dilakukan menggunakan metode freeze-thaw (Weigel dan Glazebrook 2002). Koloni tunggal A. tumefaciens EHA105 digores pada LB padat yang mengandung antibiotik rifampisin 25 mg ml -1 diinkubasi 28 o C selama 3 hari. Koloni yang tumbuh discrab lalu dimasukkan ke dalam 10 ml LB yang mengandung antibiotik dan diinkubasi dalam inkubator bergoyang 200 rpm, 28 o C semalaman. Kultur dimasukkan ke dalam 10 ml LB yang mengandung antibiotik sampai OD600=0.6. Sebanyak 1.5 ml kultur dimasukkan ke dalam tabung 1.5 ml lalu disentrifugasi 4000 rpm, 4 o C 10 menit. Supernatan dibuang dan pelet diresuspensi dengan 1 ml CaCl2 20 mm kemudian disentrifugasi 4000 rpm, 4 o C 1 menit. Supernatan dibuang dan pelet diresuspensi kembali dengan 200 µl CaCl2 20 mm. Transformasi A. tumefaciens dilakukan dengan memasukkan plasmid ke dalam sel kompeten. Campuran diinkubasi berturut-turut dalam es 15 menit, nitrogen cair 5 menit, inkubator 37 o C 2 menit dan es 5 menit. Sebanyak 1 ml LB
16 ditambahkan ke dalam campuran dan diinkubasi di inkubator bergoyang 200 rpm, 28 o C 4 jam. Campuran disentrifugasi rpm 1 menit dan sebanyak 25 µl disebar pada LB padat yang mengandung antibiotik. Transformasi kalus padi Nipponbare Transformasi kalus padi dilakukan menggunakan metode Toki et al. (2006). Kulit biji padi dibuka kemudian biji padi disterilkan menggunakan air sabun sambil digoyang 200 rpm selama 15 menit. Biji padi dibilas dengan air steril sampai busa hilang. Sterilisaasi dilanjutkan dengan memasukkan biji padi berturut-turut ke dalam EtOH 70% selama 1 menit dan natrium hipoklorit 4% sambil digoyang 200 rpm selama 30 menit. Biji padi dibilas menggunakan air steril sebanyak 5 kali masing-masing selama 15 menit sambil digoyang 200 rpm. Selanjutnya biji padi dikeringkan dengan kertas saring steril dan ditanam dalam media N6D, 32 o C, 5 hari pada kondisi terang. Tahapan infeksi Agrobacterium dilakukan dengan memasukkan kalus yang berusia 5 hari ke dalam kultur Agrobacterium (OD600=0.1) yang mengandung acetosyringone lalu didiamkan 1.5 menit. Kalus dikeringkan dengan kertas saring steril dan ditanam dalam media N6D yang mengandung acetosyringone, 20 o C, 3 hari pada kondisi gelap. Kalus dibilas dengan air steril sebanyak dua kali 2 menit digoyang. Selanjutnya kalus dibilas kembali dengan air steril yang mengandung antibiotik sebanyak 5 kali masing-masing selama 15 menit. Kalus dikeringkan dengan kertas saring steril dan ditanam dalam media N6D yang mengandung antibiotik 250 mg L -1 sefotaksim dan 200 mg L -1 ampisilin, 32 o C, pada kondisi terang dan disubkultur setiap 2 minggu. Seleksi kalus putative transgenik menggunakan media yang mengandung 50 mg L -1 higromisin, 250 mg L -1 sefotaksim dan 200 mg L -1 ampisilin dan dilakukan subkultur setiap 2 minggu. Isolasi DNA genom tanaman Isolasi DNA genom tanaman dilakukan DNeasy Plant Mini Kit. Kalus transgenik dipecah dengan menggunakan Tissue lyser lalu ditambahkan 400 µl buffer AP1 dan 4 µl larutan RNAse dan disentrifugasi rpm. Campuran diinkubasi pada suhu 65 o C, 10 menit dan ditambahkan 130 µl buffer AP2 dan AP3, diresuspensi kemudian diinkubasi dalam es selama 5 menit. Campuran disentrifugasi rpm, 5 menit dan supernatan dipindahkan ke QIAshredder Mini spin column selanjutnya disentrifugasi rpm, 5 menit. Supernatan dipindahkan ke dalam DNeasy Mini spin column kemudian secara berturut-turut ditambahkan bufer AW1 sebanyak 1,5 kali volume supernatan, 500 µl Mini spin column buffer AW2 dan 30 µl lalu disentrifugasi rpm, 2 menit. Verifikasi kalus transgenik dilakukan dengan mengamplifikasi daerah egfp dari T-DNA pc13-35s-intron-egfp menggunakan primer egfp. 9
17 10 4 HASIL DAN PEMBAHASAN Konstruksi vektor biner pc13-35s-intron-sma Langkah awal yang dilakukan untuk mengkonstruksi plasmid pc13-35s-intron- Sma adalah melakukan amplifikasi fragmen promoter 35S-Intron-Sma. Pada bagian N- terminal gen target terdapat penambahan sepuluh asam amino dan diharapkan dengan penambahan tersebut intron pada pc13-35s-intron-sma akan mengalami proses splicing seperti pada pc1301. Modifikasi ini juga diharapkan tidak mengganggu fungsi gen target yang disisipkan. Fragmen promoter 35S-Intron-Sma mengandung intron yang memiliki masing-masing lima asam amino gen GUS dari pc1301 pada ujung 5 dan 3, situs kloning gen target (SmaI), 6 kali kodon histidin dan stop kodon TGA. Pada fragmen ini ditambahkan situs restriksi EcoRI pada ujung 5 dan BstEII pada ujung 3 promoter 35S (Gambar 6) Gambar 6 Peta konstruksi plasmid pc13-35s-intron-sma Fragmen promoter 35S-Intron-Sma yang diamplifikasi dengan PCR menghasilkan pita berukuran 1020 pb pada gel agarosa (Gambar 7). Fragmen ini dipurifikasi, diligasi ke pgem-t Easy dan diintroduksikan pada sel kompeten E. coli TOP10. Koloni yang membawa pgem-35s-intron-sma diseleksi pada media yang mengandung ampisilin 100 mg L -1. Verifikasi koloni yang membawa plasmid rekombinan diverifikasi dengan PCR menggunakan primer khusus 35S-Intron-Sma_F dan 35S-Intron-Sma_R dan verifikasi keberadaan fragmen promoter 35S-Intron-Sma juga dilakukan dengan restriksi plasmid rekombinan menggunakan EcoRI dan BstEII. Hasil verifikasi PCR koloni dan restriksi plasmid rekombinan menghasilkan pita berukuran 1020 pb. Gambar 7 Hasil amplifikasi fragmen promoter 35S-Intron-Sma (M= penanda 100 pb)
18 Fragmen 35S-Intron-Sma dari pgemt-35s-intron-sma disubkloning ke pc1301 yang telah dipotong dengan enzim restriksi EcoRI dan BstEII untuk menghilangkan daerah MCS, promoter 35S dan gen GUS. Plasmid pc1301 yang telah dimodifikasi disebut dengan pc13-35s-intron-sma. Plasmid pc13-35s- Intron-Sma diintrodukasi pada sel kompeten E. coli TOP10. Koloni yang membawa pc13-35s-intron-sma ditapiskan pada media yang mengandung kanamisin 50 mg L -1 dan diverifikasi dengan PCR menggunakan primer khusus dan menghasilkan pita berukuran 1020 pb (Gambar 8). 11 Gambar 8 Hasil verifikasi koloni yang membawa plasmid pc13-35s-intron- Sma. Koloni No. 4 positif membawa plasmid pc13-35s-intron-sma (M= penanda 1000 pb DNA ladder; K(-)= kontrol negatif) Konstruksi pc13-35s-intron-egfp Gen egfp diamplifikasi dengan PCR dari plasmid pst2 dan dikloning ke pgem-t Easy. Plasmid pgem-egfp diintroduksi pada sel kompeten E. coli TOP10. Koloni yang membawa plasmid ini ditapiskan pada media yang mengandung ampisilin 100 mg L -1 dan diverifikasi dengan PCR menggunakan primer egfp_f dan egfp_r. Hasil verifikasi PCR menghasilkan pita berukuran 741 pb (Gambar 9). Gambar 9 Hasil verifikasi koloni transforman yang membawa pgem-egfp (M= penanda 100 pb) Fragmen egfp disubkloning ke pc13-35s-intron-sma pada situs SmaI membentuk pc13-35s-intron-egfp. Koloni yang membawa plasmid ini ditapiskan pada media yang mengandung kanamisin 50 mg L -1. Verifikasi dengan PCR
19 12 dilakukan dengan 35S-Intron-Sma_F dan egfp_r untuk melihat orientasi dari egfp. Hasil verifikasi PCR menghasilkan pita berukuran 1761 pb (Gambar 10). Gambar 10 Hasil verifikasi koloni yang membawa plasmid pc13-35s-intron-egfp (M= penanda 1000 pb DNA ladder; K(-)= kontrol negatif) Transformasi kalus padi Nipponbare Plasmid pc13-35s-intron-egfp diintroduksi pada Agrobacterium kompeten dan diseleksi pada media yang mengandung antibiotik rifampisin 25 mg L -1, klorampenikol 35 mg L -1 dan kanamisin 200 mg L -1. Koloni Agrobacterium yang membawa pc13-35s-intron-egfp diverifikasi dengan PCR menggunakan primer ujung intron_f dan 6xHis-TGA-BstEII-R dan menghasilkan pita berukuran 787 pb (Gambar 11). Gambar 11 Hasil verifikasi koloni Agrobacterium yang membawa pc13-35s- Intron-eGFP. Koloni No.1 positif membawa pc13-35s-intron-egfp (M= penanda 1000 pb DNA ladder; K(-)= kontrol negatif) Sebelum dilakukan transformasi pada tanaman model, koloni Agrobacterium yang membawa plasmid pc13-35s-intron-egfp diamati di bawah sinar biru dengan panjang gelombang 395 nm. Pengamatan ini dilakukan untuk mengetahui ekspresi egfp di Agrobacterium. Hasil pengamatan koloni
20 Agrobacterium yang mengandung pc-35s-intron-egfp tidak menunjukkan ekspresi gen egfp (Gambar 12). 13 A B Gambar 12 Hasil pengamatan ekspresi gen egfp di bawah sinar putih (A) dan sinar biru (B) Transformasi dilakukan pada kalus padi Nipponbare. Transformasi dilakukan melalui ko-kultivasi kalus selama 3 hari. Kalus hasil ko-kultivasi diseleksi pada media seleksi menggandung antibiotik higromisin 50 mg L -1. Hasil transformasi menunjukkan bahwa terdapat empat galur kalus yang membawa sisipan T-DNA plasmid pc-35s-intron-egfp. Hal ini diketahui dari pengamatan ekspresi gen egfp pada kalus di bawah sinar biru. Ekspresi egfp diamati pada kalus padi yang berumur empat minggu setelah infeksi (Gambar 13). Gambar 13 Hasil pengamatan ekspresi gen egfp di bawah sinar putih (A) dan sinar biru (B) Verifikasi keberadaan T-DNA pc13-35s-intron-egfp pada empat galur kalus transgenik dilakukan dengan mengamplifikasi genom kalus transgenik menggunakan primer egfp_f dan egfp_r menghasilkan pita berukuran 741 pb (Gambar 14).
21 14 Gambar 14 Hasil verifikasi keberadaan T-DNA pc13-35s-intron-sma pada empat galur kalus transgenik (M= penanda 100 pb) Pembahasan Penyisipan gen ke dalam kromoson tanaman melalui perantaraan Agrobacterium merupakan suatu metode transformasi yang telah berlangsung lama di alam. Hal ini disebabkan karena A. tumefaciens merupakan bakteri tanah yang secara alami mampu melakukan transfer DNA ke dalam kromoson tanaman. Bakteri ini mampu menyisipkan daerah T-DNA yang merupakan bagian dari Ti-plasmid. Di dalam T-DNA terdapat gen onkogenik penyandi fitohormon dan gen penyandi opin. Secara alami gen-gen yang berada di dalam T-DNA tersebut tidak dapat diekspresikan oleh Agrobacterium karena enzim RNA polimerase Agrobacterium tidak mengenali daerah promoter gen-gen tersebut. Oleh karena itu, Agrobacterium menyisipkan daerah T-DNA tersebut ke dalam kromoson tanaman sehingga gen-gen tersebut diekspresikan oleh tanaman karena RNA polimerase tanaman dapat mengenali daerah promoter gen-gen tersebut. Salah satu komponen yang penting dalam transformasi tanaman adalah vektor yang membawa daerah T-DNA yang akan disisipkan ke kromosom tanaman. Transformasi tanaman dengan A. tumefaciens memiliki beberapa jenis sistem vektor yaitu vektor biner dan cointegrate vector. Vektor biner merupakan sistem yang paling banyak digunakan karena plasmid yang mengandung T-DNA menjadi lebih kecil dan mudah dimanipulasi (Rachmawati 2006). Daerah T-DNA pada plasmid biner dapat dimanipulasi sesuai dengan tujuan penelitian. Salah satu contoh vektor biner adalah pcambia Plasmid pcambia 1301 memiliki daerah T- DNA yang terdiri dari kaset gen penanda seleksi untuk tanaman transgenik dan kaset gen reporter GUS (Jefferson 1987). Kedua gen tersebut dikendalikan secara konstitutif oleh promoter 35S. Beberapa kekurangan pc1301 sebagai vektor biner adalah penyisipan kaset gen target yang dilakukan pada daerah MCS karena pada plasmid tersebut tidak disediakan situs khusus untuk penyisipan gen target. Penyisipan gen target pada daerah gen GUS merupakan hal yang tidak efisien karena akan menghilangkan komponen penting yaitu intron yang berada di tengah gen GUS dan 6 kali histidin sebagai penanda. Pengembangan vektor biner yang sederhana dan fleksibel untuk transformasi melalui Agrobacterium perlu dilakukan agar kosntruksi kaset ekspresi dapat lebih efisien. Modifikasi pengembangan kaset ekspresi pada T-DNA sebaiknya menyediakan situs pengenalan enzim restriksi yang mengapit promoter, intron, situs kloning gen target dan penanda (Tag) sehingga komponen tersebut dapat diganti sesuai dengan kebutuhan penelitian.
22 Oleh karena itu untuk mempermudah proses konstruksi daerah T-DNA tersebut dilakukan modifikasi pada plasmid pcambia Plasmid hasil modifikasi pcambia 1301 disebut dengan pc13-35s-intron- Sma. Plasmid ini didesain agar memiliki struktur yang lebih sederhana dan fleksibel sehingga akan mempermudah proses konstruksi kaset ekspresi. Daerah T-DNA pc13-35s-intron-sma tersusun dari kaset ekspresi gen target yang terdiri dari promoter 35S yang memiliki situs restriksi yang terbatas. Situs pengenalan enzim restriksi EcoRI dan BstXI terdapat pada daerah upstream promoter 35S serta NcoI dan BglII pada daerah downstream promoter 35S. Selain itu, terdapat intron pertama dari gen katalase (cat1), situs restriksi tunggal sebagai tempat penyisipan gen target (SmaI) dan 6 kali kodon histidin sebagai penanda. Promoter 35S merupakan promoter kuat yang dapat mengendalikan ekspresi gen target secara konstitutif. Manipilasi promoter tersebut relatif lebih mudah karena memiliki ukuran sekuen yang pendek (343 pb), tidak memiliki situs pengenalan enzim restriksi dan aktif pada tanaman monokotil maupun dikotil (Benfey et al. 1989). Promoter 35S merupakan promoter yang sangat kuat dan merupakan promoter yang mengendalikan ekspresi gen patogen yang menyerang tanaman sehingga promoter tersebut aktif di Agrobacterium. Vancanneyt et al. (1990) menyebutkan bahwa beberapa promoter yang mengendalikan ekspresi gen patogen tanaman dapat dikenali oleh sistem transkripsi Agrobacterium. Hal ini akan mengakibatkan gen target dapat terekspresi dibawah kendali promoter 35S pada Agrobacterium sehingga menimbulkan bias pada saat transformasi. Subkloning gen target pada pc13-35s-intron-sma dilakukan dengan metode kloning konvensional yang melibatkan PCR, enzim restriksi dan ligase. Proses insersi pada situs SmaI yang menghasilkan ujung tumpul memang lebih sulit dibanding dengan situs restriksi yang sticky-end dan membutuhkan verifikasi lanjutan dengan PCR untuk mengetahui posisi orientasi gen target. Akan tetapi teknik konvensional ini relatif feasible untuk dilakukan pada banyak laboratorium karena hanya membutuhkan satu jenis inang E. coli seperti DH5 atau TOP10. Teknik kloning dengan metode gateway mungkin menjadi menarik karena verifikasi orientasi tidak perlu dilakukan seperti pada seri vektor biner pgwb (Nakagawa et al. 2007). Menariknya, jenis vektor yang memanfaatkan intron cat1 tidak ada dalam daftar seri pgwb. Di samping itu, aplikasi metode gateway lebih kompleks daripada teknik kloning konvensional. Walaupun demikian, ada kemungkinan untuk mengubah pc13-35s-intron-sma untuk menjadi vektor destinasi dengan sistem gateway. Keberadaan intron pada konstruksi ini merupakan hal yang penting karena mampu meningkatkan ekspresi gen target dan intron juga dapat digunakan untuk memastikan bahwa ekspresi gen target tidak berasal dari Agrobacterium melainkan dari tanaman. Pada ujung 5 dan 3 intron cat1 terdapat penambahan lima asam amino yang berasal dari gen GUS pada plasmid pc1301. Penambahan ekstra asam amino ini bertujuan untuk mempermudah proses intron splicing. Situs kloning tunggal gen target (SmaI) merupakan keunikan lain dari pc13-35s-intron-sma. Penyisipan gen target pada situs tersebut memungkin gen target akan langsung mendapatkan promoter dan terminator. Enzim restriksi SmaI merupakan enzim yang memotong situs pengenalan dengan ujung tumpul. Situs kloning seperti ini memungkinkan penyisipan gen target yang memiliki situs pengenalan enzim restriksi yang memotong tumpul pada kedua ujungnya (selain SmaI) atau 15
23 16 penyisipan gen target yang diamplifikasi dengan menggunakan enzim DNA polimerase yang tidak menambahkan basa nitrogen A pada bagian ujung, misalnya menggunakan DNA polimerase Pfu yang diikuti dengan seleksi bakteri transforman yang mengandung plasmid rekombinan dengan arah orientasi gen target yang sesuai. Promoter 35S pada pc13-35s-intron-sma dapat diganti dengan promoter konstitutif lain pada situs EcoRI dan BstXI pada ujung 5 serta NcoI dan BglII pada ujung 3. Intron dapat dihilangkan dengan menyisipkan gen target pada situs NcoI atau BglII dan SmaI. Komponen tambahan 6 kali histidin pada pc13-35s-intron- Sma secara langsung akan ditambahkan jika gen target disisipkan pada situs tersebut. Komponen 6 kali histidin tidak akan diekspresikan apabila fragmen gen target mengandung stop kodon. Vektor pc13-35s-intron-sma telah didesain mengandung stop kodon TGA setelah 6 kali kodon histidin sehingga fragmen gen target diamplifikasi tanpa mengandung stop kodon. Komponen 6 kali histidin dapat digunakan sebagai penanda untuk purifikasi di tingkat protein serta dapat digunakan untuk purifikasi protein yang belum memiliki antibodi. Kemungkinan lain yang digunakan apabila tidak menginginkan penambahan intron dan 6 kali histidin pada gen target adalah menyisipkan gen target pada situs EcoRI atau BstXI dan BstEII. Gen egfp merupakan gen reporter yang digunakan untuk mengetahui aktivitas promoter, pengaruh penambahan asam amino dan proses splicing intron cat1 pada pc13-35s-intron-sma. Gen egfp diamplifikasi dari plasmid pst2 mulai dari start kodon tetapi tidak mengikutsertakan stop kodon dengan menambahkan situs enzim restriksi SmaI dan EcoRV pada bagian forward dan reverse. Gen egfp merupakan gen repoter yang digunakan untuk seleksi positif kalus trasngenik yang telah tersisipi gen target karena ekspresi gen egfp tidak menyebabkan kematian pada kalus transgenik. Pengujian ekspresi intron-egfp dengan transformasi kalus padi Nipponbare melalui Agrobacterium Transformasi plasmid pc-35s-intron-egfp pada kalus padi Nipponbare dilakukan dengan menggunakan A. tumefaciens karena secara alami mampu mentransfer T-DNA dari Ti-plasmid ke dalam genom tanaman sehingga transformasi dengan perantara A. tumefaciens relatif lebih efisien dibandingkan dengan metode artificial (Sahoo et al. 2011). Di samping itu, keuntungan transformasi melalui perantaraan A. tumefaciens adalah dapat menyisipkan T-DNA yang berukuran besar, salinan T-DNA di dalam kromoson tanaman sedikit dan ekspresi gen target di tanaman stabil (Lopez et al. 2004). Strain A. tumefaciens yang digunakan adalah strain EHA105 (Hood 1993) yang menghasilkan yang bersifat supervirulensi sehingga lebih efisien dalam menginfeksi kalus padi Nipponbare. Padi Nipponbare merupakan varietas japonica yang umum digunakan sebagai tanaman model dalam transformasi tanaman karena memiliki masa pertumbuhan singkat yaitu sekitar tiga bulan, mudah ditransformasi karena memiliki ukuran genom yang relatif kecil (430 Mpb) dan genom padi ini sudah dipetakan dengan lengkap sehingga mudah dimanipulasi (Nishimura et al. 2006). Intron merupakan komponen yang sangat penting dalam konstruksi vektor untuk transformasi tanaman. Keberadaan intron pada gen egfp membantu proses seleksi kalus transforman karena egfp hanya akan terekspresi pada kalus. Sistem
24 intron splicing tidak terjadi pada Agrobacterium dapat meyakinkan bahwa ekspresi yang terjadi adalah berasal dari sel tanaman. Apabila terdapat intron pada gen target maka Agrobacterium tidak mampu melakukan intron splicing sehingga mengakibatkan gen target tidak terekspresi pada Agrobacterium (Tanaka et al. 1990). Proses kokultivasi kalus dan Agrobacterium yang mengandung plasmid pc13-35s-intron-egfp dilakukan pada media yang mengandung Acetosyringone. Penambahan senyawa fenolik ini bertujuan untuk meningkatkan efisiensi transfer T-DNA oleh Agrobacterium (Amoah et al. 2001). Setelah proses kokultivasi kemudian dilanjutkan dengan proses kultivasi yang menggunakan media dengan penambahan antibiotik ampisilin, sefotaksim dan higromisin. Kombinasi antibiotik ampisilin dan sefotaksim efektif untuk membunuh Agrobacterium sehingga tidak terjadi overgrowth sedangkan higromisin digunakan untuk menyeleksi kalus yang telah mengandung T-DNA. Jumlah kalus yang tahan dengan sistem seleksi berjenjang ini akan terus menurun sampai pada tahap regerasi karena hanya kalus yang benar-benar mengandung gen ketahanan terhadap higromisin yang dapat tumbuh pada media seleksi (Chakrabarty et al. 2002). Keberadaan plasmid biner pc13-35s-intron-sma diharapkan dapat digunakan untuk mempermudah ekspresi gen secara konstitutif. Walaupun plasmid ini tidak ditujukan untuk mengkloning promoter, plasmid ini juga memiliki kemungkinan untuk mengubah promoter konstitutif 35S dengan promoter lain menggunakan enzim restriksi yang tersedia SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Vektor biner pc35s-intron-sma yang mengandung gen egfp intron untuk transformasi tanaman telah berhasil dikonstruksi. Signal pada kalus padi Nipponbare yang diamati di bawah sinar biru menunjukkan bahwa gen egfp yang mengandung intron terekspresi di bawah kendali promoter 35S. Ekspresi gen egfp tidak tampak pada A. tumefaciens yang diamati di bawah sinar biru sehingga dapat disimpulkan gen egfp hanya terekspresi pada kalus transgenik dan terdapat proses intron splicing pada konstruksi gen egfp. Saran Perlu dilakukan penelitian tentang optimasi promoter dari vektor biner fleksibel pc13-35s-intron-sma dengan mengganti promoter 35S dengan promoter konstitutif lain dan penyisipan gen target lain yang lebih fungsional pada tanaman. Selain itu tanaman model yang digunakan untuk transformasi dapat divariasikan sehingga diketahui tingkat fleksibilitas dari plasmid tersebut.
25 intron splicing tidak terjadi pada Agrobacterium dapat meyakinkan bahwa ekspresi yang terjadi adalah berasal dari sel tanaman. Apabila terdapat intron pada gen target maka Agrobacterium tidak mampu melakukan intron splicing sehingga mengakibatkan gen target tidak terekspresi pada Agrobacterium (Tanaka et al. 1990). Proses kokultivasi kalus dan Agrobacterium yang mengandung plasmid pc13-35s-intron-egfp dilakukan pada media yang mengandung Acetosyringone. Penambahan senyawa fenolik ini bertujuan untuk meningkatkan efisiensi transfer T-DNA oleh Agrobacterium (Amoah et al. 2001). Setelah proses kokultivasi kemudian dilanjutkan dengan proses kultivasi yang menggunakan media dengan penambahan antibiotik ampisilin, sefotaksim dan higromisin. Kombinasi antibiotik ampisilin dan sefotaksim efektif untuk membunuh Agrobacterium sehingga tidak terjadi overgrowth sedangkan higromisin digunakan untuk menyeleksi kalus yang telah mengandung T-DNA. Jumlah kalus yang tahan dengan sistem seleksi berjenjang ini akan terus menurun sampai pada tahap regerasi karena hanya kalus yang benar-benar mengandung gen ketahanan terhadap higromisin yang dapat tumbuh pada media seleksi (Chakrabarty et al. 2002). Keberadaan plasmid biner pc13-35s-intron-sma diharapkan dapat digunakan untuk mempermudah ekspresi gen secara konstitutif. Walaupun plasmid ini tidak ditujukan untuk mengkloning promoter, plasmid ini juga memiliki kemungkinan untuk mengubah promoter konstitutif 35S dengan promoter lain menggunakan enzim restriksi yang tersedia SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Vektor biner pc35s-intron-sma yang mengandung gen egfp intron untuk transformasi tanaman telah berhasil dikonstruksi. Signal pada kalus padi Nipponbare yang diamati di bawah sinar biru menunjukkan bahwa gen egfp yang mengandung intron terekspresi di bawah kendali promoter 35S. Ekspresi gen egfp tidak tampak pada A. tumefaciens yang diamati di bawah sinar biru sehingga dapat disimpulkan gen egfp hanya terekspresi pada kalus transgenik dan terdapat proses intron splicing pada konstruksi gen egfp. Saran Perlu dilakukan penelitian tentang optimasi promoter dari vektor biner fleksibel pc13-35s-intron-sma dengan mengganti promoter 35S dengan promoter konstitutif lain dan penyisipan gen target lain yang lebih fungsional pada tanaman. Selain itu tanaman model yang digunakan untuk transformasi dapat divariasikan sehingga diketahui tingkat fleksibilitas dari plasmid tersebut.
26 18 DAFTAR PUSTAKA Amoah BK, Wu H, Sparks C, Jones HD Factors influencing Agrobacteriummediated transient expression of uida in wheat inflorescence tissue. J. Exp. Bot. 52: Benfey PN, Ren L, Chua NH The CaMV 35S enhancer contains at least two domains which can confer different developmental and tissue-specific expression patterns. EMBO J. 8(8): Bergman CM, Kreitman M Analysis of conserved noncoding DNA in drosophila reveals similar constraints in intergenic and intronic sequences cases. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 11: Chakrabarty R, Viswakarma N, Bhat SR, Kirti PB, Singh BD, Chopra VL Agrobacterium-mediated transformation of cauliflower: optimization of protocol and development of Bt-transgenic cauliflower. J. Biosci. 27: Cormarck PB, Valdivia RH, Falkow S FACS optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP). Gene. 173: Deutsch M, Long M Intron-exon structures of eukaryotic model organisms. Nucleid Acids Research. 27(15): Elliot AR, Campbell JA, Dugdale B, Brettell RIS, Grof CPL Greenfluorescent protein facilitates rapid in vivo detection of genetically transformed plant cells. Plant Cell Rep. 18: Filchkin SA, Gelvin SB Formation a putative relaxation intermediate during T-DNA processing directed by the Agrobacterium tumefaciens vird1, vird2 endonuclease. Mol. Microbiol 8: Heim RA, Cubitt B, Tsien RY Improved greenfluorescence. Nature. 373: Hoekema A, Hirsch PR, Hooykaas PJJ, Schilperoort RA A binary plant vector strategy based on separation of vir- and T-region of the Agrobacterium tumefaciens Ti-plasmid. Nature. 303: Holme IB, Pedersen HB, Lange M, Holm PB Transformation of barley (Hordeum vulgare L.) by Agrobacterium tumefaciens infection of in vitro cultured ovules. Plant Cell Rep. 25: Hood EE, Gelvin SB, Melchers LS, Hoekema A New Agrobacterium helper plasmids for gene transfer to plants. Transgenic Res. 2: Jefferson RA Assaying chimeric genes in plants: the GUS gene fusion gene. Plant Mol Biol Rep. 4(5): Jordan MC Green fluorescent protein as a visual marker for wheat transformation. Plant Cell. 19: Lee LY, Kononov ME, Bassuner B, Frame BR, Wang K, Gelvin SB Novel plant transformation vectors containing the superpromoter. Plant Physiol 145:
pc13-35s-intron-sma: VEKTOR BINER FLEKSIBEL UNTUK EKSPRESI GEN TARGET SECARA KONSTITUTIF PADA TRANSFORMASI TANAMAN MELALUI AGROBACTERIUM
pc13-35s-intron-sma: VEKTOR BINER FLEKSIBEL UNTUK EKSPRESI GEN TARGET SECARA KONSTITUTIF PADA TRANSFORMASI TANAMAN MELALUI AGROBACTERIUM NATALIA LUSIANNGSIH SUMANTO SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN
Lebih terperinciHASIL DAN PEMBAHASAN 1. Konstruksi vektor over-ekspresi gen OsWRKY 1.1 Amplifikasi dan purifikasi fragmen gen OsWRKY76
HASIL DAN PEMBAHASAN Kegiatan rekayasa genetik tanaman keberhasilannya tergantung pada beberapa hal, diantaranya adalah gen yang akan diintroduksikan, metode transformasi, sistem regenerasi tanaman dan
Lebih terperinciBAHAN DAN METODE. 1. Waktu dan Tempat penelitian
BAHAN DAN METODE 1. Waktu dan Tempat penelitian Penelitian dilakukan di Laboratorium Biologi Molekuler dan Rumah Kaca Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian
Lebih terperinciPembuatan Media Kultur Bakteri Pemanenan sel bakteri. Isolasi DNA kromosom bakteri. Kloning DNA
LAMPIRAN 15 15 Lampiran 1 Tahapan penelitian Pembuatan Media Kultur Bakteri Pemanenan sel bakteri Isolasi DNA kromosom bakteri Pemotongan DNA dengan enzim restriksi Kloning DNA Isolasi DNA plasmid hasil
Lebih terperinciGENETIKA DASAR Rekayasa Genetika Tanaman. Definisi. Definisi. Definisi. Rekayasa Genetika atau Teknik DNA Rekombinan atau Manipulasi genetik
Definisi GENETIKA DASAR Rekayasa Genetika Tanaman Oleh: Dr. Ir. Dirvamena Boer, M.Sc.Agr. HP: 081 385 065 359 e-mail: dirvamenaboer@yahoo.com Fakultas Pertanian, Universitas Haluoleo, Kendari Dipublikasi
Lebih terperinciHASIL DAN PEMBAHASAN bp bp bp
HASIL DAN PEBAHASAN Purifikasi dan Pengujian Produk PCR (Stilbena Sintase) Purifikasi ini menggunakan high pure plasmid isolation kit dari Invitrogen. Percobaan dilakukan sesuai dengan prosedur yang terdapat
Lebih terperinciBAB III METODE PENELITIAN. Jenis penelitian yang dilakukan termasuk dalam penelitian dasar yang. dilakukan dengan metode deskriptif (Nazir, 1998).
BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis Penelitian Jenis penelitian yang dilakukan termasuk dalam penelitian dasar yang dilakukan dengan metode deskriptif (Nazir, 1998). B. Populasi dan Sampel 1. Populasi yang
Lebih terperinciBAB 3 PERCOBAAN. Alat elektroforesis agarosa (Biorad), autoklaf, cawan Petri, GeneAid High Speed Plasmid
BAB 3 PERCOBAAN 3.1 Alat Alat elektroforesis agarosa (Biorad), autoklaf, cawan Petri, GeneAid High Speed Plasmid Mini kit, inkubator goyang (GSL), jarum Ose bundar, kit GFX (GE Healthcare), kompor listrik
Lebih terperinci4 HASIL DAN PEMBAHASAN
17 4 HASIL DAN PEMBAHASAN Konstruksi plasmid biner pmsh1-lisozim Konstruksi plasmid biner dilakukan dengan meligasi gen lisozim ayam dan pmsh1. Plasmid hasil ligasi berukuran 13.449 pb (Gambar 5A kolom
Lebih terperinciBAB 4 HASIL PERCOBAAN DAN BAHASAN. Oligonukleotida sintetis daerah pengkode IFNα2b sintetis dirancang menggunakan
BAB 4 HASIL PERCOBAAN DAN BAHASAN Oligonukleotida sintetis daerah pengkode IFNα2b sintetis dirancang menggunakan program komputer berdasarkan metode sintesis dua arah TBIO, dimana proses sintesis daerah
Lebih terperincidiregenerasikan menjadi tanaman utuh. Regenerasi tanaman dapat dilakukan baik secara orgnogenesis ataupun embriogenesis (Sticklen 1991; Zhong et al.
PENDAHULUAN Perbaikan suatu sifat tanaman dapat dilakukan melalui modifikasi genetik baik dengan pemuliaan secara konvensional maupun dengan bioteknologi khususnya teknologi rekayasa genetik (Herman 2002).
Lebih terperinciBAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN. A. SINTESIS DAN AMPLIFIKASI FRAGMEN GEN tat HIV-1 MELALUI
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN A. SINTESIS DAN AMPLIFIKASI FRAGMEN GEN tat HIV-1 MELALUI TEKNIK PCR OVERLAPPING 1. Sintesis dan amplifikasi fragmen ekson 1 dan 2 gen tat HIV-1 Visualisasi gel elektroforesis
Lebih terperinciHASIL DAN PEMBAHASAN Isolasi DNA Genomik Sengon
HASIL DAN PEMBAHASAN Isolasi DNA Genomik Sengon DNA genomik sengon diisolasi dari daun muda pohon sengon. Hasil uji integritas DNA metode 1, metode 2 dan metode 3 pada gel agarose dapat dilihat pada Gambar
Lebih terperinciBAHAN DAN METODE. ditranskipsi dan produk translasi yang dikode oleh gen (Nasution 1999).
4 ditranskipsi dan produk translasi yang dikode oleh gen (Nasution 1999). Polymerase Chain Reaction (PCR) PCR merupakan suatu reaksi in vitro untuk menggandakan jumlah molekul DNA pada target tertentu
Lebih terperinciIII. METODE PENELITIAN
III. METODE PENELITIAN 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan November 2007 hingga Juli 2009, bertempat di Laboratorium Reproduksi dan Genetika Organisme Akuatik Departemen
Lebih terperinciGambar 1. Struktur organisasi promoter pada organisme prokariot [Sumber: University of Miami 2008: 1.]
Gambar 1. Struktur organisasi promoter pada organisme prokariot [Sumber: University of Miami 2008: 1.] Gambar 2. Struktur organisasi promoter pada organisme eukariot [Sumber: Gilbert 1997: 1.] Gambar 3.
Lebih terperinciBAB 4 HASIL PERCOBAAN DAN PEMBAHASAN
BAB 4 HASIL PERCOBAAN DAN PEMBAHASAN Sebelum melakukan PCR, terlebih dahulu dilakukan perancangan primer menggunakan program DNA Star. Pemilihan primer dilakukan dengan mempertimbangkan parameter spesifisitas,
Lebih terperinciBAB III METODE PENELITIAN
BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis Penelitian Jenis penelitian yang digunakan adalah penelitian dasar dengan metode deskriptif (Nazir, 1983). B. Populasi dan Sampel Populasi dalam penelitian ini adalah
Lebih terperinciKEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAAN DIREKTORAT JENDERAL PENDIDIKAN MENENGAH DIREKTORAT PEMBINAAN SEKOLAH MENENGAH ATAS
KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAAN DIREKTORAT JENDERAL PENDIDIKAN MENENGAH DIREKTORAT PEMBINAAN SEKOLAH MENENGAH ATAS Test Seleksi Calon Peserta International Biology Olympiad (IBO) 2014 2 8 September
Lebih terperinciKloning Domain KS dan Domain A ke dalam Sel E. coli DH5α. Analisis Bioinformatika. HASIL Penapisan Bakteri Penghasil Senyawa Antibakteri
3 selama 1 menit, dan elongasi pada suhu 72 0 C selama 1 menit. Tahap terakhir dilakukan pada suhu 72 0 C selama 10 menit. Produk PCR dielektroforesis pada gel agarosa 1 % (b/v) menggunakan tegangan 70
Lebih terperinciFAKULTAS BIOLOGI LABORATORIUM GENETIKA & PEMULIAAN INSTRUKSI KERJA UJI
ISOLASI TOTAL DNA TUMBUHAN DENGAN KIT EKSTRAKSI DNA PHYTOPURE Halaman : 1 dari 5 1. RUANG LINGKUP Metode ini digunakan untuk mengisolasi DNA dari sampel jaringan tumbuhan, dapat dari daun, akar, batang,
Lebih terperinciI. PENDAHULUAN. genom sel tanaman adalah kloning gen. Proses ini dilakukan dengan
I. PENDAHULUAN A. LATAR BELAKANG Salah satu proses umum dalam manipulasi gen yang akan ditransfer ke genom sel tanaman adalah kloning gen. Proses ini dilakukan dengan menyisipkan gen target ke dalam vektor
Lebih terperinciFAKULTAS BIOLOGI LABORATORIUM GENETIKA & PEMULIAAN INSTRUKSI KERJA UJI
Halaman : 1 dari 5 ISOLASI TOTAL DNA HEWAN DENGAN KIT EKSTRAKSI DNA 1. RUANG LINGKUP Metode ini digunakan untuk mengisolasi DNA dari sampel jaringan hewan, dapat dari insang, otot, darah atau jaringan
Lebih terperinciBAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN. A. ISOLASI DNA GENOM PADI (Oryza sativa L.) KULTIVAR ROJOLELE,
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN A. ISOLASI DNA GENOM PADI (Oryza sativa L.) KULTIVAR ROJOLELE, NIPPONBARE, DAN BATUTEGI Isolasi DNA genom padi dari organ daun padi (Oryza sativa L.) kultivar Rojolele, Nipponbare,
Lebih terperinciBAB III METODOLOGI PENELITIAN. Penelitian akan diawali dengan preparasi alat dan bahan untuk sampling
16 BAB III METODOLOGI PENELITIAN Penelitian akan diawali dengan preparasi alat dan bahan untuk sampling sel folikel akar rambut. Sampel kemudian dilisis, diamplifikasi dan disekuensing dengan metode dideoksi
Lebih terperinciBAB 4 HASIL PERCOBAAN DAN BAHASAN
14 BAB 4 HASIL PERCOBAAN DAN BAHASAN Konfirmasi bakteri C. violaceum dan B. cereus dilakukan dengan pewarnaan Gram, identifikasi morfologi sel bakteri, sekuensing PCR 16s rdna dan uji kualitatif aktivitas
Lebih terperinciBAB 3 PERCOBAAN 3.1 Bahan 3.2 Alat
BAB 3 PERCOBAAN 3.1 Bahan Bahan yang digunakan memiliki kualitas pro analisis atau pro biologi molekular, yaitu : primer M. tuberculosis forward: 5 GGATCCGATGAGCAAGCTGATCGAA3 (Proligo) dan primer M. tuberculosis
Lebih terperinci4 HASIL DAN PEMBAHASAN. 4.1 Transformasi genetik Oryza sativa L. dengan gen MaMt2
27 4 HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Transformasi genetik Oryza sativa L. dengan gen MaMt2 Transformasi genetik Oryza sativa L. kultivar Kasalath dan Nipponbare dilakukan menggunakan eksplan yang berupa kalus
Lebih terperinciBAB III METODE PENELITIAN
BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis Penelitian deskriptif. Jenis penelitian yang digunakan adalah penelitian dasar dengan metode B. Objek Penelitian Objek penelitian ini adalah sampel DNA koleksi hasil
Lebih terperinciIII. BAHAN DAN METODE
III. BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian dilakukan di Laboratorium BIORIN (Biotechnology Research Indonesian - The Netherlands) Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi IPB. Penelitian
Lebih terperinciIV. HASIL DAN PEMBAHASAN
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Isolasi Fragmen DNA Penyandi CcGH Mature Plasmid pgem-t Easy yang mengandung cdna GH ikan mas telah berhasil diisolasi. Hal ini ditunjukkan dengan adanya pita DNA pada ukuran
Lebih terperinciDASAR REKAYASA GENETIKA
DASAR REKAYASA GENETIKA Rekayasa = manipulasi = modifikasi = perubahan bahan genetik (perubahan & pemindahan gen) Cara: 1. Persilangan seksual (perkawinan) 2. Hibridisasi somatik 3. Mutasi 4. Teknologi
Lebih terperinciREKAYASA GENETIKA ( VEKTOR PLASMID )
MAKALAH REKAYASA GENETIKA ( VEKTOR PLASMID ) Disusun oleh: NAMA : LASINRANG ADITIA NIM : 60300112034 KELAS : BIOLOGI A TUGAS : REKAYASA GENETIKA JURUSAN BIOLOGI FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI UNIVERSITAS
Lebih terperinciBAHAN DAN METODE. Tempat dan Waktu Penelitian
BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian dilakukan di Laboratorium Kerjasama Bioteknologi Indonesia- Belanda (BIORIN) dan Laboratorium Biologi Molekuler dan Seluler Tanaman (BMST), Pusat
Lebih terperinciHASIL DAN PEMBAHASAN Transformasi, Kokultivasi, dan Regenerasi
26 HASIL DAN PEMBAHASAN Transformasi, Kokultivasi, dan Regenerasi Konstruksi vektor ekspresi yang digunakan pada penelitian ini adalah p35scamv::tclfy. Promoter p35s CaMV digunakan dalam penelitian ini
Lebih terperinciI. PENDAHULUAN. protein dalam jumlah besar (Reece dkk., 2011). kompeten biasanya dibuat dari inokulum awal dengan konsentrasi 2% ( v / v )
I. PENDAHULUAN A. Latar Belakang Penelitian Plasmid merupakan molekul DNA berukuran relatif kecil, melingkar, dan beruntai ganda. Plasmid membawa gen-gen yang terpisah dari kromosom bakteri. Plasmid digunakan
Lebih terperinci3 BAHAN DAN METODE. Waktu dan Tempat
13 3 BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian ini dilakukan pada bulan April 2012 hingga Januari 2013, bertempat di Laboratorium Kultur Jaringan serta Laboratorium BIORIN (Biotechnology Research Indonesia-the
Lebih terperinciGambar 2 Vektor pengklonan pgem T Easy
BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan dari bulan September 2007 sampai dengan bulan April 2008. Penelitian dilakukan di Laboratorium Biologi Molekuler Seluler Tanaman, dan Laboratorium
Lebih terperincio C 1 menit, penempelan 50 o C 1 menit, polimerisasi 72 o C 1 menit (tiga tahap ini
13 BAB IV PERCOBAAN IV.1 Bahan Air miliq, deoksinukleotida trifosfat (dntp), MgCl 2, (Promega), enzim Pfu DNA polymerase, dapar Pfu (Stratagene), oligonukleotida SR1, SR2, SR3, SR4, SR5, AR6, AR7, AR8,
Lebih terperinciBAB III METODE PENELITIAN. Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental dengan 7 sampel dari 7
BAB III METODE PENELITIAN 3.1 Rancangan Penelitian Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental dengan 7 sampel dari 7 individu udang Jari yang diambil dari Segara Anakan Kabupaten Cilacap Jawa Tengah.
Lebih terperinciANALISA HASIL TRANSFORMASI DENGAN MENGGUNAKAN PCR KOLONI DAN RESTRIKSI
1 ANALISA HASIL TRANSFORMASI DENGAN MENGGUNAKAN PCR KOLONI DAN RESTRIKSI PENDAHULUAN Polimerase Chain Reaction (PCR) PCR adalah suatu reaksi invitro untuk menggandakan jumlah molekul DNA pada target tertentu
Lebih terperinciHASIL DAN PEMBAHASAN
HASIL DAN PEMBAHASAN Pemotongan Parsial dan Penyisipan Nukleotida pada Ujung Fragmen DNA Konstruksi pustaka genom membutuhkan potongan DNA yang besar. Untuk mendapatkan fragmen-fragmen dengan ukuran relatif
Lebih terperinciBAHAN DAN METODE. Produksi Protein Rekombinan Hormon Pertumbuhan (rgh)
11 BAHAN DAN METODE Penelitian ini terdiri atas 2 tahapan utama, yaitu produksi protein rekombinan hormon pertumbuhan (rgh) dari ikan kerapu kertang, ikan gurame, dan ikan mas, dan uji bioaktivitas protein
Lebih terperinciTUGAS TERSTRUKTUR BIOTEKNOLOGI PERTANIAN VEKTOR DNA
TUGAS TERSTRUKTUR BIOTEKNOLOGI PERTANIAN VEKTOR DNA Oleh: Gregorius Widodo Adhi Prasetyo A2A015009 KEMENTERIAN RISET TEKNOLOGI DAN PENDIDIKAN TINGGI UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN FAKULTAS PERTANIAN PROGRAM
Lebih terperinciBAB III METODE PENELITIAN
BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis penelitian Jenis penelitian yang dilakukan adalah penelitian dasar dengan metode deskriptif (Nazir, 1988). B. Populasi dan sampel Populasi pada penelitian ini adalah
Lebih terperinciBAB in. METODE PENELITIAN
BAB in. METODE PENELITIAN Waktu Dan Tempat Penelitian Penelitian ini telah dilakukan dari April sampai November 2009 di laboratorium Biologi Molekular dan Rekayasa Genetika, Balai Penelitian Bioteknologi
Lebih terperinciBAB III METODE PENELITIAN
BAB III METODE PENELITIAN 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Januari 2012 sampai bulan Juli 2012, yang bertempat di Laboratorium Genetika dan Biologi Molekuler Jurusan Biologi
Lebih terperinciBAB III BAHAN DAN CARA KERJA. Penelitian dilakukan di Laboratorium Biologi Molekuler, Pusat
BAB III BAHAN DAN CARA KERJA A. LOKASI DAN WAKTU PENELITIAN Penelitian dilakukan di Laboratorium Biologi Molekuler, Pusat Penelitian Bioteknologi, LIPI, Cibinong selama 9 bulan (Maret 2008-- November 2008).
Lebih terperinciPengertian TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN. Cloning DNA. Proses rekayasa genetik pada prokariot. Pemuliaan tanaman konvensional: TeknologiDNA rekombinan:
Materi Kuliah Bioteknologi Pertanian Prodi Agroteknologi Pertemuan Ke 9-10 TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN Ir. Sri Sumarsih, MP. Email: Sumarsih_03@yahoo.com Weblog: Sumarsih07.wordpress.com Website: agriculture.upnyk.ac.id
Lebih terperinciVII. UJI EKSPRESI GEN TcAP1 (APETALA1 KAKAO) PADA TANAMAN MODEL. Abstrak
VII. UJI EKSPRESI GEN TcAP1 (APETALA1 KAKAO) PADA TANAMAN MODEL Abstrak Pada berbagai spesies termasuk kakao, gen AP1 (APETALA1) diketahui sebagai gen penanda pembungaan yang mengendalikan terbentuknya
Lebih terperinciBAB III METODE PENELITIAN
39 BAB III METODE PENELITIAN A. Desain Penelitian Penelitian yang dilakukan merupakan penelitian deskriptif. Penelitian membuat deskripsi secara sistematis, faktual dan akurat mengenai fakta-fakta dan
Lebih terperinciBAB III METODE PENELITIAN Bagan Alir Penelitian ini secara umum dapat digambarkan pada skema berikut:
BAB III METODE PENELITIAN Tahapan-tahapan yang dilakukan dalam penelitian ini adalah: pengumpulan sampel, lisis terhadap sampel mtdna yang telah diperoleh, amplifikasi daerah HVI mtdna sampel dengan menggunakan
Lebih terperinciBAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian Bahan dan Alat
12 BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian Survei penyakit klorosis dan koleksi sampel tanaman tomat sakit dilakukan di sentra produksi tomat di daerah Cianjur, Cipanas, Lembang, dan Garut. Deteksi
Lebih terperinciMETODE PENELITIAN Waktu dan Tempat Penelitian Bahan Metode penelitian Isolasi RNA total
METODE PENELITIAN Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilakukan mulai bulan Februari 2005 hingga bulan Maret 2008 di Laboratorium Biologi Molekuler dan Seluler Tanaman dan Laboratorium BIORIN (Biotechnology
Lebih terperinciAsam Asetat Glacial = 5,7 ml EDTA 0,5 M ph 8.0 = 10 ml Aquades ditambahkan hingga volume larutan 100 ml
36 Lampiran 1. Pembuatan Larutan Stok dan Buffer A. Pembuatan Larutan Stok Tris HCL 1 M ph 8.0 (100 ml) : Timbang Tris sebanyak 12,114 g. Masukkan Tris ke dalam Erlenmeyer dan ditambahkan 80 ml aquades.
Lebih terperinciSINTESIS DAN PENGKLONAAN FRAGMEN GEN tat (TRANSAKTIVATOR) HIV-1 KE DALAM VEKTOR EKSPRESI PROKARIOT pqe-80l EKAWATI BETTY PRATIWI
SINTESIS DAN PENGKLONAAN FRAGMEN GEN tat (TRANSAKTIVATOR) HIV-1 KE DALAM VEKTOR EKSPRESI PROKARIOT pqe-80l EKAWATI BETTY PRATIWI 0304040257 UNIVERSITAS INDONESIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN
Lebih terperinciBAB 3 PERCOBAAN Mikroba C. violaceum, Bacillus cereus dan E. coli JM 109
9 BAB 3 PERCOBAAN 3.1 Alat, Bahan dan Miroba 3.1.1 Alat Bunsen, inkubator 37 o C, sentrifuga (Mikro 200R Hettich), Eppendorf 100 ul, 500 ul, 1,5 ml, tabung mikrosentrifuga (Eppendorf), neraca timbang (Mettler
Lebih terperinciLAPORAN PRAKTIKUM REKAYASA GENETIKA
LAPORAN PRAKTIKUM REKAYASA GENETIKA LAPORAN IV (ISOLASI RNA DARI TANAMAN) KHAIRUL ANAM P051090031/BTK BIOTEKNOLOGI SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2010 0 ISOLASI RNA DARI TANAMAN TUJUAN Tujuan
Lebih terperinciKLONING DAN OVEREKSPRESI GEN celd DARI Clostridium thermocellum ATCC DALAM pet-blue VECTOR 1
PROPOSAL METODOLOGI PENELITIAN (BM-3001) KLONING DAN OVEREKSPRESI GEN celd DARI Clostridium thermocellum ATCC 27405 DALAM pet-blue VECTOR 1 Penyusun: Chandra 10406014 Dosen Narasumber: Dra. Maelita Ramdani
Lebih terperinciBAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Bahan dan Alat
12 BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian ini dilakukan dari bulan April 2006 sampai dengan bulan April 2007. Penelitian dilakukan di rumah kaca, laboratorium Biologi Molekuler Seluler Tanaman, dan
Lebih terperinciHASIL DAN PEMBAHASAN
HASIL DAN PEMBAHASAN Isolasi DNA Total Tumbuhan Isolasi DNA total merupakan tahap awal dari pembuatan pustaka genom. DNA dipisahkan dari bahan-bahan lain yang ada dalam sel. DNA total yang diperlukan untuk
Lebih terperinciBab IV Hasil dan Pembahasan
32 Bab IV Hasil dan Pembahasan Penggunaan α-amilase dalam beberapa sektor industri mengalami peningkatan dan sekarang ini banyak diperlukan α-amilase dengan sifat yang khas dan mempunyai kemampuan untuk
Lebih terperinciBAB III METODE PENELITIAN. Dalam penelitian ini dilakukan lima tahap utama yang meliputi tahap
BAB III METODE PENELITIAN Dalam penelitian ini dilakukan lima tahap utama yang meliputi tahap penyiapan templat mtdna, amplifikasi fragmen mtdna pada daerah D-loop mtdna manusia dengan teknik PCR, deteksi
Lebih terperinciIV. HASIL DAN PEMBAHASAN
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1. Isolasi Promoter -Aktin Ikan Mas Promoter -Aktin dari ikan mas diisolasi dengan menggunakan metode PCR dengan primer yang dibuat berdasarkan data yang ada di Bank Gen. Panjang
Lebih terperinciKONSTRUKSI DNA REKOMBINAN pcambia STILBENA SINTASE PENCEGAH BUSUK AKAR KELAPA SAWIT EMBI LILIS
KONSTRUKSI DNA REKOMBINAN pcambia 1303- STILBENA SINTASE PENCEGAH BUSUK AKAR KELAPA SAWIT EMBI LILIS DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2009
Lebih terperinciKonstruksi dan Kloning Plasmid pcambia1301 dengan Gen Cry1Ab
Konstruksi dan Kloning Plasmid pcambia1301 dengan Gen Cry1Ab Edy Listanto, Habib Rizjaani, Liberty, Tri J. Santoso, Saptowo J. Pardal, Ida H. Somantri, I. Altosar, dan M. Herman ABSTRAK Penelitian konstruksi
Lebih terperinciHASIL DAN PEMBAHASAN. Hasil konfirmasi dicek dengan elektroforesis gel agarosa 1%.
reaction mix pada tabung mikro, kemudian program PCR dilanjutkan kembali dengan program PCR biasa: 94 o C selama 30 detik, 55 o C selama 1 menit, dan 72 o C selama 2 menit. Hasil konfirmasi dicek dengan
Lebih terperinciBAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN. Isolasi DNA genom tanaman padi T0 telah dilakukan pada 118
45 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN A. HASIL Isolasi DNA genom tanaman padi T0 telah dilakukan pada 118 sampel. Berdasarkan hasil digesti DNA dengan enzim EcoRI, diperoleh sebanyak 74 sampel tanaman dari 118
Lebih terperinciHASIL DAN PEMBAHASAN
19 HASIL DAN PEMBAHASAN Vektor Kloning Protein rgh Isolasi Plasmid cdna GH. Plasmid pgem-t Easy yang mengandung cdna; El-mGH, Og-mGH dan Cc-mGH berhasil diisolasi dari bakteri konstruksi E. coli DH5α dengan
Lebih terperinciBAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Bahan Metode Isolasi C. gloeosporioides dari Buah Avokad
15 BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Balai Besar Karantina Pertanian (BBKP) Tanjung Priok Wilayah Kerja Bogor, mulai bulan Oktober 2011 sampai Februari 2012. Bahan
Lebih terperinciII. TINJAUAN PUSTAKA...
DAFTAR ISI Halaman SAMPUL DALAM... i PERNYATAAN KEASLIAN KARYA SKRIPSI... ii ABSTRAK... iii ABSTRACT... iv RINGKASAN... v HALAMAN PERSETUJUAN... vi TIM PENGUJI... vii RIWAYAT HIDUP... viii KATA PENGANTAR...
Lebih terperinciBAB III METODE PENELITIAN
25 BAB III METODE PENELITIAN 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian telah berlangsung sejak bulan Januari 2012 - Juli 2012 di Laboratorium Mikrobiologi, Lab. Optik, Lab. Genetika dan Lab. Biologi Molekuler Jurusan
Lebih terperinciHASIL DAN PEMBAHASAN. Gambar 4 Vektor klon pgemt-easy dan peta restriksi yang dimiliki (Promega 1999).
8 Inkubasi selama 2 hari pada suhu 28 o C dalam kondisi gelap dengan kecepatan 150 rpm. Setelah diinkubasi selama 2 hari, hasilnya adalah terbentuknya koloni berwarna putih. Koloni yang terbentuk kemudian
Lebih terperinciREKAYASA GENETIKA. Genetika. Rekayasa. Sukarti Moeljopawiro. Laboratorium Biokimia Fakultas Biologi Universitas Gadjah Mada
REKAYASA GENETIKA Sukarti Moeljopawiro Laboratorium Biokimia Fakultas Biologi Universitas Gadjah Mada Rekayasa Genetika REKAYASA GENETIKA Teknik untuk menghasilkan molekul DNA yang berisi gen baru yang
Lebih terperinciBAB III METODE PENELITIAN. Jenis penelitian yang digunakan dalam penelitian ini adalah deskriptif.
BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis Penelitian Jenis penelitian yang digunakan dalam penelitian ini adalah deskriptif. Penelitian deskriptif adalah metode penelitian yang bertujuan untuk membuat gambaran
Lebih terperinciHASIL DAN PEMBAHASAN. Hasil
11 secara perlahan beberapa kali kemudian segera ditambah dengan 400 μl larutan buffer netralisasi (1.32 M natrium asetat ph 4.8), divorteks dan disentrifugasi pada suhu 4 0 C dengan kecepatan 10 000 rpm
Lebih terperinciBAB III BAHAN DAN CARA KERJA. Penelitian dilakukan di Laboratorium Institute of Human Virology and
23 BAB III BAHAN DAN CARA KERJA A. LOKASI DAN WAKTU PENELITIAN Penelitian dilakukan di Laboratorium Institute of Human Virology and Cancer Biology of the University of Indonesia (IHVCB-UI), Jl. Salemba
Lebih terperinciBAB III METODE PENELITIAN
BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis Penelitian Penelitian ini merupakan penelitian murni yang dilakukan dengan metode deskriptif, yaitu suatu metode penelitian untuk membuat deskripsi, gambaran atau lukisan
Lebih terperinciBAB III. METODOLOGI PENELITIAN. Pengambilan sampel. Penyiapan templat mtdna dengan metode lisis sel
16 BAB III. METODOLOGI PENELITIAN Bab ini menggambarkan tahapan penelitian yang terdiri dari pengambilan sampel, penyiapan templat mtdna dengan metode lisis sel, amplifikasi D-loop mtdna dengan teknik
Lebih terperinciBIO306. Prinsip Bioteknologi
BIO306 Prinsip Bioteknologi KULIAH 6. TEKNIK DASAR KLONING Percobaan pertama penggabungan fragmen DNA secara in vitro dilakukan sekitar 30 tahun yang lalu oleh Jackson et al. (1972). Melakukan penyisipan
Lebih terperinciRekombinasi Gen Penyandi -xilosidase asal Geobacillus Thermoleovorans IT-08 dalam Plasmid Phis1525
Rekombinasi Gen Penyandi -xilosidase asal Geobacillus Thermoleovorans IT-08 dalam Plasmid Phis1525 (Recombinant Gen of Encoding -Xylosidase from Geobacillus Thermoleovorans IT-08 in phis1525 Plasmid) Sri
Lebih terperinciABSTRAK. ISOLASI, OPTIMASI AMPLIFIKASI DAN KLONING GEN phoq PADA Salmonella typhi
ABSTRAK ISOLASI, OPTIMASI AMPLIFIKASI DAN KLONING GEN phoq PADA Salmonella typhi Patrisia Puspapriyanti, 2008. Pembimbing I : Ernawati A.Girirachman, Ph.D. Pembimbing II : Johan Lucianus, dr., M.Si. Salmonella
Lebih terperinciBAB III METODE PENELITIAN. amplifikasi daerah HVI mtdna sampel dengan menggunakan teknik PCR;
BAB III METODE PENELITIAN Secara garis besar, langkah-langkah yang dilakukan dalam penelitian ini adalah: pengumpulan sampel; lisis terhadap sampel mtdna yang telah diperoleh; amplifikasi daerah HVI mtdna
Lebih terperinciDi dalam bab ini akan dibicarakan pengertian teknologi DNA rekombinan. beserta tahapan-tahapan kloning gen, yang secara garis besar meliputi
Di dalam bab ini akan dibicarakan pengertian teknologi DNA rekombinan beserta tahapan-tahapan kloning gen, yang secara garis besar meliputi isolasi DNA kromosom dan DNA vektor, pemotongan DNA menggunakan
Lebih terperinciMETODOLOGI PENELITIAN. Tempat dan Waktu Penelitian. Bahan dan Alat Penelitian
14 METODOLOGI PENELITIAN Tempat dan Waktu Penelitian Tempat penelitian dilakukan di Laboratorium Unit Pelayanan Mikrobiologi Terpadu, Bagian Mikrobiologi Kesehatan, Departemen Ilmu Penyakit Hewan dan Kesehatan
Lebih terperinciBAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN Amplifikasi PCR Pada penelitian konstruksi gen harus mempertimbangkan dua hal yaitu urutan nukleotida gen yang akan dikonstruksi dan vektor ekspresi yang akan digunakan. Pada
Lebih terperinciREKAYASA GENETIKA. By: Ace Baehaki, S.Pi, M.Si
REKAYASA GENETIKA By: Ace Baehaki, S.Pi, M.Si Dalam rekayasa genetika DNA dan RNA DNA (deoxyribonucleic Acid) : penyimpan informasi genetika Informasi melambangkan suatu keteraturan kebalikan dari entropi
Lebih terperinciHASIL DAN PEMBAHASAN. Uji Kualitatif dan Kuantitatif Hasil Isolasi RNA
6 konsentrasinya. Untuk isolasi kulit buah kakao (outer pod wall dan inner pod wall) metode sama seperti isolasi RNA dari biji kakao. Uji Kualitatif dan Kuantitatif Hasil Isolasi RNA Larutan RNA hasil
Lebih terperinciVI. PEMBAHASAN UMUM Rhizobium Sebagai Agen Tranformasi Genetika Alternatif
VI. PEMBAHASAN UMUM Rhizobium Sebagai Agen Tranformasi Genetika Alternatif Transformasi genetika merupakan teknik yang rutin digunakan saat ini untuk mentransfer berbagai sifat penting pada tanaman dan
Lebih terperinciURAIAN MATERI 1. Pengertian dan prinsip kloning DNA Dalam genom sel eukariotik, gen hanya menempati sebagian kecil DNA kromosom, selain itu merupakan
URAIAN MATERI 1. Pengertian dan prinsip kloning DNA Dalam genom sel eukariotik, gen hanya menempati sebagian kecil DNA kromosom, selain itu merupakan sekuen non kode (sekuen yang tidak mengalami sintesis
Lebih terperinci4 Hasil dan Pembahasan
4 Hasil dan Pembahasan Dalam bab ini akan dipaparkan hasil dari tahap-tahap penelitian yang telah dilakukan. Melalui tahapan tersebut diperoleh urutan nukleotida sampel yang positif diabetes dan sampel
Lebih terperinciBAB IX. DASAR-DASAR TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN
BAB IX. DASAR-DASAR TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN Di dalam bab ini akan dibicarakan pengertian teknologi DNA rekombinan beserta tahapan-tahapan kloning gen, yang secara garis besar meliputi isolasi DNA kromosom
Lebih terperinciRNA (Ribonucleic acid)
RNA (Ribonucleic acid) Seperti yang telah dikemukakan bahwa, beberapa organisme prokaryot, tidak memiliki DNA, hanya memiliki RNA, sehingga RNA-lah yang berfungsi sebagai molekul genetik dan bertanggung
Lebih terperinciPETUNJUK PRAKTIKUM BIOLOGI SEL DAN MOLEKULER Oleh: Ixora Sartika M ISOLASI DNA PLASMID
PETUNJUK PRAKTIKUM BIOLOGI SEL DAN MOLEKULER Oleh: Ixora Sartika M ixomerc@uny.ac.id ISOLASI DNA PLASMID Plasmid adalah DNA ekstrakromosom yang berbentuk sirkuler dan berukuran kecil (1 200 kb). Sebagian
Lebih terperinciABSTRAK. OPTIMASI AMPLIFIKASI DAN KLONING GEN Chaperonin 60.1 PADA Mycobacterium tuberculosis
ABSTRAK OPTIMASI AMPLIFIKASI DAN KLONING GEN Chaperonin 60.1 PADA Mycobacterium tuberculosis Nia Oktriviany, 2009 Pembimbing I : Ernawati Arifin Giri Rachman, Ph.D Pembimbing serta I : Debbie Sofie Retnoningrum,
Lebih terperinciBAHAN DAN METODE. Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Juli 2007 sampai bulan Juni 2008 di
BAHAN DAN METODE : Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Juli 2007 sampai bulan Juni 2008 di 1. Laboratorium Bioteknologi Hewan dan Biomedis PPSHB IPB 2. Laboratorium Mikrobiologi
Lebih terperinciBAB III METODE PENELITIAN. Penelitian ini merupakan penelitian yang dilakukan dengan metode
16 BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis Penelitian Penelitian ini merupakan penelitian yang dilakukan dengan metode deskriptif. Penelitian deskriptif adalah suatu metode penelitian untuk membuat deskripsi,
Lebih terperinciKONSTRUKSI GEN KITINASE UNTUK KETAHANAN TERHADAP GANODERMA PADA VEKTOR EKSPRESI pcambia 1303 DWI NOVIANTHY
KONSTRUKSI GEN KITINASE UNTUK KETAHANAN TERHADAP GANODERMA PADA VEKTOR EKSPRESI pcambia 1303 DWI NOVIANTHY DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR
Lebih terperinciLAPORAN PRAKTIKUM REKAYASA GENETIKA
LAPORAN PRAKTIKUM REKAYASA GENETIKA LAPORAN II (ISOLASI DNA GENOM) KHAIRUL ANAM P051090031/BTK BIOTEKNOLOGI SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2010 0 ISOLASI DAN IDENTIFIKASI DNA SEL MUKOSA
Lebih terperinciBAB I PENDAHULUAN. Mycobacterium tuberculosis adalah bakteri patogen penyebab tuberkulosis.
BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Mycobacterium tuberculosis adalah bakteri patogen penyebab tuberkulosis. Secara umum penyebaran bakteri ini melalui inhalasi, yaitu udara yang tercemar oleh penderita
Lebih terperinci