KONSTRUKSI GEN KITINASE UNTUK KETAHANAN TERHADAP GANODERMA PADA VEKTOR EKSPRESI pcambia 1303 DWI NOVIANTHY

Transkripsi

1 KONSTRUKSI GEN KITINASE UNTUK KETAHANAN TERHADAP GANODERMA PADA VEKTOR EKSPRESI pcambia 1303 DWI NOVIANTHY DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2009

2 KONSTRUKSI GEN KITINASE UNTUK KETAHANAN TERHADAP GANODERMA PADA VEKTOR EKSPRESI pcambia 1303 DWI NOVIANTHY DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2009

3 ABSTRAK DWI NOVIANTHY. Konstruksi Gen Kitinase untuk Ketahanan terhadap Ganoderma pada Vektor Ekspresi pcambia Dibimbing oleh MARIA BINTANG dan TETTY CHAIDAMSARI. Usaha peningkatan produksi perkebunan kelapa sawit tidak terlepas dari masalah hama dan penyakit, yang antara lain disebabkan oleh cendawan patogen Ganoderma spp. Pendekatan baru untuk memperoleh kelapa sawit transgenik adalah dengan menyisipkan gen penghasil zat yang berfungsi sebagai anti jamur. Salah satunya adalah gen kitinase yang berasal dari Trichoderma. Tujuan dari penelitian adalah konstruksi gen kitinase pada vektor ekspresi pcambia 1303 diantara promotor 35S Cauliflower Mosaic Virus (CaMV) dan promotor spesifik akar. Gen kitinase diklon terlebih dahulu ke dalam vektor ekspresi pcambia 1303, kemudian ditransformasi ke Escherichia coli XL-1 Blue selanjutnya ditransfer ke dalam Agrobacterium tumefaciens. Hasil penelitian menunjukkan bahwa gen kitinase berhasil disisipkan ke dalam pcambia Restriksi DNA rekombinan dengan enzim restriksi NcoI dan SpeI menghasilkan 2 pita, yaitu bp adalah pcambia 1303 dan 1500 bp adalah gen kitinase. Transformasi DNA rekombinan ke dalam Agrobacterium tumefaciens telah berhasil dilakukan dengan menggunakan sel kompeten strain AGLO. Keberhasilan transformasi diuji melalui restriksi plasmid yang diisolasi dari sel transforman menggunakan enzim restriksi NcoI dan SpeI.

4 ii ABSTRACT DWI NOVIANTHY. Construction of Chitinase Gene for Resistant to Ganoderma on Expression Vector pcambia Under the direction of MARIA BINTANG and TETTY CHAIDAMSARI. Efforts to increase palm oil production face problems associated with pest and diseases caused by pathogenic fungus such as Ganoderma spp. A new approach to obtain palm oil transgenic is by inserting a gene encoding antifungi compound. One of genes is chitinase gene derived from Trichoderma. The research targets are to insert chitinase gene into expression vector pcambia 1303 between the 35S Cauliflower Mosaic Virus (CaMV) promoter and the root specific promoter. The Chitinase gene was cloned into pcambia 1303 expression vector followed by transformation of recombinant plasmid into Escherichia coli XL-1 Blue and transferred into Agrobacterium tumefaciens. Results showed that the chitinase gene was successfully inserted into pcambia Restriction of the recombinant DNA using restriction enzymes Nco1 and Spe1 resulted in two bands of 1200 bp which is pcambia 1303 and of 1500 bp which is the chi gene. The recombinant DNA was successfully transformed into Agrobacterium tumefaciens using competent cell of AGLO strain. The success of transformation was analyzed by restricting recombinant DNA isolated from transformant colonies using NcoI and SpeI restriction enzymes.

5 iii KONSTRUKSI GEN KITINASE UNTUK KETAHANAN TERHADAP GANODERMA PADA VEKTOR EKSPRESI pcambia 1303 DWI NOVIANTHY Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Biokimia DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2009

6 4 Judul Skripsi : Konstruksi Gen Kitinase untuk Ketahanan terhadap Ganoderma pada Vektor Ekspresi pcambia 1303 Nama : Dwi Novianthy NIM : G Disetujui Komisi Pembimbing Prof. Dr. drh Maria Bintang, MS Ketua Dr. Tetty Chaidamsari, M.Si Anggota Diketahui Dr. Ir. I Made Artika, M.App.Sc Ketua Departemen Tanggal lulus:

7 5 PRAKATA Alhamdulillah, puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karunianya, shalawat dan salam semoga selalu tercurah kepada Nabi Muhammad SAW, keluarga, sahabat, dan para pengikutnya sampai akhir zaman sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian ini. Penelitian ini berjudul Konstruksi Gen Kitinase untuk Ketahanan terhadap Ganoderma pada Vektor Ekspresi pcambia Kegiatan penelitian ini dilakukan dari bulan Februari hingga Juli 2009, bertempat di Laboratorium Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia, Jalan Taman Kencana, Bogor. Penulis mengucapkan terima kasih kepada semua pihak yang telah membantu dalam penyelesaian penelitian ini, antara lain kepada Prof. Dr. drh Maria Bintang, MS selaku pembimbing utama dan Dr. Tetty Chaidamsari, M.Si selaku pembimbing lapangan yang telah memberikan saran, kritik, dan bimbingannya serta Mba Herti dan Mba Nina di Laboratorium Biologi Molekuler dan Rekayasa Genetika, Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia atas peran dan kerjasamanya yang telah banyak membantu dalam menyelesaikan penelitian ini. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada orang tua, kakak dan adik penulis untuk semua doa, dukungan dan bimbingan yang sangat berarti bagi penulis. Serta kepada rekan selama penelitian Yoanita, Embi, Ratna atas saran dan motivasi yang diberikan. Penulis berharap semoga penelitian ini dapat memberikan manfaat bagi semua orang yang membacanya. Bogor, Oktober 2009 Dwi Novianthy

8 6 RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 5 Januari 1987 dari Ayah Sutarno Wiryomikarto dan Ibu Atikah Azhari. Penulis merupakan anak kedua dari tiga bersaudara. Tahun 2005 penulis lulus dari SMUN 62 Jakarta dan pada tahun yang sama lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI). Penulis memilih mayor Departemen Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam dengan minor Departemen Ilmu Gizi dan Kesehatan Masyarakat. Selama mengikuti perkuliahan penulis aktif dalam kegiatan-kegiatan organisasi kemahasiswaan selama beberapa periode (CREBs periode 2007/2008). Penulis juga aktif mengikuti beberapa acara kepanitiaan di IPB seperti masa pengenalan departemen Biokimia 2007/2008 dan 2008/2009. Penulis melakukan Praktik Lapang di Laboratorium Pusat Riset Obat dan Makanan, Badan Pengawas Obat dan Makanan (BPOM), Jalan Percetakan Negara No.23, Jakarta Pusat dengan judul Uji Antioksidan Metode DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazil) terhadap 15 Tanaman Obat.

9 7 DAFTAR ISI DAFTAR GAMBAR... DAFTAR LAMPIRAN... Halaman PENDAHULUAN... 1 TINJAUAN PUSTAKA... 1 Kelapa Sawit... 1 Gen Kitinase sebagai Gen Ketahanan terhadap Penyakit Busuk Akar... 2 Plasmid pcambia Pengklonan... 3 Polymerase Chain Reaction (PCR)... 4 Agrobacterium tumefaciens... 4 BAHAN DAN METODE... 4 Bahan dan Alat... 4 Metode Penelitian... 5 HASIL DAN PEMBAHASAN... 8 Pemurnian Gen Kitinase Produk PCR... 8 Cloning Gen Kitinase Hasil PCR pada pgemt-easy... 8 Transformasi Gen Kitinase ke Escherichia coli (XL-1 Blue)... 8 Konfirmasi Koloni Transforman yang Membawa Fragmen Sisipan... 9 Restriksi Gen Kitinase dan pcambia 1303 dengan Enzim Restriksi Ligasi Gen Kitinase dengan pcambia Isolasi DNA Plasmid Rekombinan Transformasi Menggunakan Sel Kompeten Kimia ke Agrobacterium tumefaciens Strain AGLO SIMPULAN DAN SARAN DAFTAR PUSTAKA LAMPIRAN x xi

10 8 DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Tanaman kelapa sawit Tanaman muda kelapa sawit yang terserang Ganoderma Pemurnian PCR produk gen kitinase Vektor klon pgemt-easy dan peta restriksi yang dimiliki Contoh duplikat dari koloni hasil transformasi Hasil PCR koloni kitinase Hasil analisis BLASTX fragmen gen kitinase Hasil elektroforesis restriksi pcambia 1303 dengan enzim NcoI dan SpeI Hasil pemurnian plasmid pcambia Hasil elektroforesis restriksi gen kitinase dari pgemt-easy Peta restriksi pcambia 1303 dengan enzim restriksi Skema ligasi gen kitinase dengan plasmid pcambia Contoh transformasi koloni gen kitinase dengan pcambia ke dalam sel kompeten (XL1-Blue) Hasil elektroforesis isolasi DNA plasmid gen kitinase dengan pcambia Hasil pemotongan plasmid pcambia 1303-gen kitinase dengan NcoI dan SpeI Contoh duplikat koloni hasil transformasi pcambia 1303 yang mengandung gen kitinase melalui Agrobacterium Orientasi konstruksi gen kitinase dengan pcambia

11 9 DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1 Tahapan penelitian Prosedur elektroforesis gel agarosa Komposisi larutan sediaan Prosedur kerja transformasi plasmid ke dalam sel kompeten Elektroforegraf urutan basa gen kitinase Hasil analisis BLASTX fragmen gen kitinase Vektor pcambia

12 PENDAHULUAN Usaha peningkatan produksi perkebunan kelapa sawit secara rutin tidak terlepas dari masalah hama dan penyakit yang antara lain disebabkan oleh cendawan patogen Ganoderma spp. Cendawan ini menyebabkan busuk pangkal batang yang merupakan penyakit pada tanaman kelapa sawit yang penting dan sulit untuk ditanggulangi (Santoso et al. 2001). Penyakit ini menyerang sistem perakaran dan gejala penyakit yang ditimbulkannya hanya terlihat pada akhir infeksi sehingga tanaman yang sakit tidak mungkin lagi dapat diselamatkan. Kerugian serius terjadi pada generasi tanaman lanjut seperti pada generasi tanaman ketiga, yang kematian dari tanaman tersebut akibat serangan penyakit ini dapat mencapai 60% (Singh 1991). Pendekatan yang umum dilakukan dalam pengendalian penyakit tersebut adalah dengan cara mekanis, kimia, atau hayati. Cara mekanis dilakukan dengan membersihkan sumber infeksi sebelum tanam dan menghindari perlukaan pada batang atau akar, namun ternyata pendekatan ini dianggap kurang ekonomis karena masih banyak generasi tanaman baru yang terkena infeksi Ganoderma spp. Pendekatan kimia menggunakan fungisida diantaranya fungisida Tridemorph atau Triadimenol 50 ppm dan Bayfidan 10 ppm dapat membunuh miselium Ganoderma in vitro. Pemberian fungisida pada kelapa sawit ternyata sulit dilakukan, karena areal kelapa sawit yang luas dan menimbulkan dampak negatif terhadap lingkungan. Cara hayati menggunakan biofungisida Trichoderma dan Tenicilium yang dilaporkan dapat menghambat pertumbuhan hifa Ganoderma spp (Lubis 1992). Tetapi cara biologis ini penerapannya pada perkebunan kelapa sawit masih kurang populer karena daya bunuh biofungisida relatif lebih lama. Adapun pengendalian penyakit ini adalah melalui program pemuliaan tanaman dengan menemukan gen-gen yang tahan terhadap Ganoderma spp baik yang berasal dari dalam atau antarspesies, namun hingga saat ini tanaman yang dimaksud belum pernah ada. Untuk memecahkan persoalan dalam rangka mendapatkan bahan tanaman kelapa sawit yang tahan Ganoderma diperlukan pendekatan baru. Salah satu upaya yang dapat dilakukan adalah dengan membuat tanaman transgenik kelapa sawit tahan Ganoderma spp. Kendala yang dihadapi dalam upaya penanggulangan penyakit tersebut adalah siklus pemuliaan kelapa sawit memerlukan waktu yang cukup lama (10-13 tahun) dan sumber gen yang resisten terhadap Ganoderma tidak tersedia diantara plasma nutfah kelapa sawit. Oleh karena itu, salah satu strategi untuk mendapatkan tanaman kelapa sawit tahan Ganoderma adalah dengan jalan menyisipkan gen-gen (transgenik) yang menghasilkan zat-zat yang berfungsi sebagai anti jamur, seperti enzim kitinase maupun glukanase yang dapat melisis dinding sel hifa jamur patogen. Dalam rekayasa genetik tanaman kelapa sawit, gen-gen yang akan disisipkan diharapkan dapat diekspresikan secara terus-menerus sepanjang hidup tanaman kelapa sawit terutama pada bagian perakaran, untuk itu pemilihan promotor yang bersifat konstitutif dan cocok untuk kelapa sawit berperan penting dalam pengendalian Ganoderma spp. Upaya untuk mendapatkan gen penghasil zat anti jamur dititikberatkan pada sumber yaitu yang berasal dari jamur Trichoderma khususnya untuk mengisolasi gen kitinase dan glukanase. Jamur Trichoderma telah terbukti memiliki agen pengendali biologis terhadap jamur patogen tanaman dengan melisis dinding sel jamur patogen tanaman dengan enzim yang dihasilkannya terutama kitinase dan glukanase (Schirmbock et al. 1994; Lorito et al. 1996). Tujuan utama dari penelitian adalah konstruksi gen kitinase pada vektor ekspresi pcambia 1303 diantara promotor 35S Cauliflower Mosaic Virus (CaMV) dan promotor spesifik akar. Hasil dari penelitian ini berupa fragmen gen kitinase dalam pcambia 1303 yang akan digunakan ke tahap selanjutnya melalui Agrobacterium tumefaciens untuk ditransformasikan pada eksplan tanaman kelapa sawit. TINJAUAN PUSTAKA Kelapa Sawit Kelapa sawit (Elaeis guineensis, Jacq) berasal dari Afrika. Tanaman ini dikenal di Indonesia sejak tahun 1848, namun baru ditanam secara komersial pada tahun Elaeis berasal dari kata Elaion (bahasa Yunani) yang berarti minyak sedangkan guineensis berasal dari Guinea yaitu nama pantai barat Afrika yaitu Jacquis (Lubis 1992). Pada umumnya perkebunan kelapa sawit sering dihadapi masalah hama maupun

13 2 penyakit (Lubis 1992). Terdapat berbagai cara untuk mengklasifikasikan hama dan penyakit pada tanaman kelapa sawit. Berdasarkan bagian tanaman yang diserang dikenal dengan hama perusak (pemakan) daun, perusak bunga dan buah, perusak akar dan batang. Apabila ditinjau dari jenis hama yang menyerang maka dapat dibedakan hama serangga, mamalia, nematoda dan lain-lain. Teknis pencegahan dan pemberantasannya dikenal dengan cara manual, kimia dan biologis. Menurut Lubis (1992), penyebab penyakit busuk pangkal batang atau akar pada kelapa sawit adalah cendawan Ganoderma spp, yang sampai sekarang ini penyakit tersebut belum dapat dikendalikan dengan baik. Gejala awal dimulai dari pelepah daun berwarna pucat seperti kekurangan hara tetapi terbatas hanya pada beberapa pelepah yang terdapat di pucuk. Selanjutnya daun mengalami nekrosis dimulai dari daun tua kemudian ke daun yang lebih muda. Pelepah daun akan patah dan menggantung. Daun pupus (pelepah muda) tidak membuka dan terkumpul lebih banyak dari biasa. Umumnya 6-12 bulan setelah gejala terakhir tanaman akan mati. Infeksi yang terjadi disebabkan karena kontak akar yang sakit. Gambar 1 Tanaman kelapa sawit. Gambar 2 Tanaman muda kelapa sawit yang terserang Ganoderma. Gen Kitinase sebagai Gen Ketahanan terhadap Penyakit Busuk Akar Gen dapat didefinisikan sebagai bagian genom yang berperan dalam proses ekspresi gen. Peranan tersebut yaitu sebagai ruas model atau ruas penyandi dalam proses transkipsi. Dari keseluruhan genom organisme tidak seluruhnya menjadi ruas penyandi, hanya bagian yang diapit oleh promotor dan terminator. Daerah promotor merupakan tempat dimulainya perpanjangan asam ribonukleat (RNA). Sedangkan sisi terminator berfungsi sebagai tempat titik akhir dari proses perpanjangan RNA (akhir transkipsi) (Jusuf 2001). Kitinase adalah enzim yang mempunyai kemampuan mendegradasi kitin, sebagai komponen utama dinding sel jamur (Datta et al. 2000). Selain memiliki kemampuan menempel pada dinding sel jamur secara langsung, kitinase juga melepaskan oligo-nasetil-glukosamin yang berfungsi sebagai elisitor, yang telah terbukti berperan penting dalam mengaktifkan respon ketahanan (Ren & West 1992). Beberapa publikasi hasil penelitian melaporkan bahwa tanaman yang mengekspresikan gen kitinase terbukti mempunyai ketahanan terhadap berbagai cendawan tertentu, seperti tanaman tembakau yang tahan terhadap cendawan Rhizoctonia solani (Jach et al. 1992) dan Sclerotinia sclerotiorum (Terekawa et al. 1997), tanaman mentimun yang tahan terhadap serangan Botrytis cinerea (Tabei et al. 1998) dan tanaman padi yang tahan terhadap Rhizoctonia solani (Lin et al.1995; Datta et al. 2000). Protein kitinase diduga dapat digunakan sebagai perlindungan terhadap jamur patogen. Dugaan ini didukung pada pengamatan tumbuhan tingkat tinggi yang tidak mempunyai kitinase, namun setelah diberi kitinase tumbuhan tersebut menunjukkan adanya aktivitas anti jamur secara in vitro. Aktivitas kitinase akan meningkat setelah tanaman terinfeksi bakteri dan virus patogen atau dengan induksi dengan etilen, sinar UV atau asam salisilat (Lin et al. 1995). Plasmid pcambia 1303 DNA vektor adalah molekul DNA yang diperlukan untuk membawa dan memperbanyak fragmen DNA yang dibawanya. DNA yang sering digunakan adalah plasmid bakteri. Sedangkan plasmid adalah bahan genetik ekstra kromosom yang diwariskan secara tetap. Ciri-ciri plasmid antara lain berukuran kecil dan hanya mengandung beberapa gen, membawa informasi genetika, terlepas dari DNA kromosom atau kadang-kadang dapat berintegrasi dengan DNA kromosom serta dapat diisolasi dengan mudah dari sel bakteri.

14 3 Ciri lain plasmid adalah mempuyai situs untuk memulai replikasi yang disebut ORI (Origin of Replication) (Jusuf 2001). Selain itu menurut Sambrook & Russel (2001), plasmid yang sering digunakan sebagai vektor haruslah berukuran kecil. Plasmid pcambia dikonstruksi sebagai vektor DNA dalam metode transformasi langsung dan menggunakan Agrobacterium. Plasmid pcambia mempunyai rentang yang luas sehingga bersifat stabil jika ditransformasikan baik ke tanaman dikotil maupun pada tanaman monokotil. Vektor ini didasarkan pada pcambia 1301 yang memiliki mgfp5 versi Aequoria victoria hijau. pcambia 1302 di fusi dengan gusa (N358Q) dan pcambia 1303 memiliki gusa, mgfp5, His6 fusion sedangkan pcambia 1304 memiliki mgfp5, gusa, His6 fusion. Plasmid pcambia 1301 dapat diuji dengan seleksi biru putih karena membawa gen Lac Z penyandi enzim -galaktosidase. Gen Lac Z ini akan berwarna biru jika ditambah dengan isopropil D-thiogalaktopiranosida (IPTG) dan 5 bromo 4 kloro 3 indiol galaktopiranosida (X-Gal). Gen yang tidak berekspresi ini mengakibatkan koloni menjadi berwarna putih (Sambrook & Russel 2001). Plasmid pcambia 1303 mengandung promotor CaMV35S (Cauliflower Mosaic Virus). Promotor ini berhubungan dengan urutan yang terpoliadenilasi pada T-DNA plasmid. Hal ini memungkinkan pembuatan klon langsung ke dalam T-DNA plasmid. T- DNA merupakan untaian DNA yang akan ditransfer ke sel tanaman. Gen gus-a (betaglucuronidase) dalam plasmid pcambia 1303 berfungsi sebagai gen reporter untuk memonitor proses transformasi dan introduksi gen yang direkayasa (Widyasari & Suhandono 2007). Gen gus-a digunakan sebagai penyeleksi untuk mengetahui telah terintegrasinya T- DNA dari Agrobacterium ke dalam genom tanaman sehingga hanya tanaman transgenik yang dapat hidup di media tumbuh yang mengandung antibiotik higromisin. Gen gus-a menyandikan enzim -glucuronidase yang digunakan sebagai penanda pada sistem transformasi pada tanaman. Gen gus-a disisipi intron lalu disekuen sandinya sehingga ekspresi gen hanya mungkin terjadi bila sudah terintegrasi pada tanaman. Jika masih berada di dalam bakteri maka intron tidak terpotong sehingga ekspresi tidak terjadi (Nasution 1999). Pengklonan Cloning adalah suatu teknik isolasi dan pemurnian fragmen DNA tunggal dari DNA genom yang kemudian digabung dengan suatu vektor untuk membentuk DNA rekombinan yang dapat bereplikasi dalam inang bakteri (Kendrew & Lawrence 1994). Tahapan cloning diawali dengan isolasi fragmen DNA dan DNA vektor, masing-masing DNA dapat diisolasi dari bakteri. Setelah isolasi, fragmen DNA dan DNA vektor dipotong dengan enzim restriksi yang sama. Tahap selanjutnya adalah penggabungan fragmen DNA dengan DNA vektor. Tahap ini biasanya disebut tahap ligasi. Penggabungan DNA ini biasanya dibantu oleh enzim ligase. Hasil tahap ligasi yaitu terbentuknya DNA rekombinan (fragmen DNA dengan DNA vektor) (Nasution 1999). Tahap ketiga adalah transformasi DNA rekombinan ke bakteri. Transformasi adalah suatu cara memasukkan DNA asing ke dalam sel inang sehingga saat ini telah dikembangkan beberapa teknik transformasi yaitu diantaranya (1) induksi senyawa kimia, yaitu DNA asing masuk akibat perbesaran pori membran sel oleh pengaruh senyawa kimia, (2) inokulasi dengan virus, yaitu masuknya DNA asing ke dalam sel dibantu oleh virus yang menjembataninya dengan membran sel inang, (3) fusi protoplas, yaitu dua protoplas atau lebih dilebur sehingga terbentuk sel baru yang mempunyai sifat tertentu, (4) biolistik, yaitu pemasukan DNA dilakukan dengan membungkus partikel emas dengan makromolekul DNA lalu ditembakkan ke sel inang, (5) elektroporasi, yaitu transfer DNA dilakukan dengan bantuan penerapan medan listrik. Teknik yang terakhir adalah teknik tri-parental mating (Sain et al.1999). Menurut Nasution (1999), tahap keempat adalah seleksi sel inang yang telah mengalami transformasi dan telah mengandung DNA rekombinan. Inang yang telah mengalami transformasi dan telah mengandung DNA rekombinan dapat diseleksi berdasarkan gen penanda (selectable marker) yang dibawa oleh plasmid. Gen penanda yang biasa digunakan adalah gen ketahanan terhadap suatu antibiotik tertentu. Tahap kelima adalah transformasi ke sel target. Sel target yang digunakan dapat berupa sel tanaman tingkat tinggi, ragi, jamur dan selsel mamalia. Tahap yang terakhir adalah meneliti gen yang diklon. Kegiatan ini ditekankan pada cara mendapatkan informasi mengenai lokasi gen, struktur gen, cara gen

15 4 ditranskipsi dan produk translasi yang dikode oleh gen (Nasution 1999). Polymerase Chain Reaction (PCR) PCR merupakan suatu reaksi in vitro untuk menggandakan jumlah molekul DNA pada target tertentu dengan cara mensintesis molekul DNA baru yang berkomplemen dengan molekul DNA target tersebut dengan bantuan enzim dan oligonukleotida sebagai primer dalam suatu thermocycler. Primer yang berada sebelum daerah target disebut sebagai primer forward dan primer yang berada setelah daerah target disebut primer reverse. Enzim yang digunakan sebagai pencetak rangkaian molekul DNA baru dikenal sebagai enzim polimerase (Muladno 2002). Reaksi PCR pada dasarnya adalah tiruan dari proses replikasi DNA, yaitu adanya pembukaan rantai DNA utas ganda, penempelan primer, dan perpanjangan rantai DNA baru oleh DNA polimerase dari arah 5 ke 3. Tetapi pada teknik PCR tidak menggunakan enzim ligase dan primer RNA. Satu siklus pada teknik PCR terdiri atas tiga tahap, yaitu denaturasi, annealing dan ekstensi. Denaturasi dilakukan pada suhu o C sehingga terjadi pemisahan utas ganda DNA menjadi dua utas tunggal DNA yang menjadi cetakan (template) tempat penempelan primer dan tempat kerja DNA polimerase. Selanjutnya pada tahap annealing, suhu diturunkan untuk penempelan primer oligonukleotida pada sekuens yang komplementer pada molekul DNA cetakan. Suhu annealing tiap sekuens DNA bersifat spesifik dan merupakan faktor penentu keberhasilan suatu reaksi PCR. Sedangkan tahap terakhir adalah ekstensi. Tahap ekstensi dilakukan pada suhu 72 o C. Suhu ini merupakan suhu optimum untuk kerja enzim Taq DNA polimerase. Pada tahap ini terjadi sintesis DNA komplemen dengan DNA cetakan. Ketiga tahap tersebut dilakukan berulang kali dalam mesin PCR, pada umumnya antara siklus bergantung dari jumlah DNA yang diinginkan (Saiki et al. 1989). Agrobacterium tumefaciens Agrobacterium tumefaciens merupakan bakteri tanah Gram negatif yang termasuk famili Rhizobiaceae dan anggota dari genus Agrobacterium. Pada awal abad 20-an A. tumefaciens diketahui merupakan penyebab crown gall diseases yang membentuk benjolan dalam tanaman dikotil yang menyerang 90 famili tumbuhan dikotil sehingga menimbulkan kerugian ekonomi yang besar. Tumor ini dihasilkan dari proses transfer, integrasi dan ekspresi dari transfered DNA (T-DNA) utas tunggal. T-DNA dihasilkan oleh plasmid Ti yang dipicu oleh molekul yang dilepaskan sel tanaman yang sedang tumbuh sehingga menginduksi virulance (vir) gene dari A. tumefaciens untuk menghasilkan T-DNA. Setelah terintegrasi, ekspresi dari T-DNA memicu biosintesis hormon pertumbuhan tanaman dan senyawa opines yang merupakan nutrisi bagi A. tumefaciens. Kemampuan T-DNA untuk mentransfer DNA ke organisme eukariotik dan gen yang berada di T-DNA dapat digantikan dengan gen apa saja, menjadikan A. tumefaciens sebagai vektor yang ideal untuk transfer gen ke suatu organisme eukariotik, seperti tanaman untuk menghasilkan suatu tanaman transgenik, fungi dan sel manusia (Tzfira & Citovsky 2003). Agrobacterium memiliki tiga komponen genetik yang digunakan untuk menginfeksi tanaman. Komponen yang pertama adalah komponen T-DNA yaitu fragmen yang ditransfer ke sel tanaman. T- DNA terletak di plasmid Ti dari Agrobacterium. Komponen kedua adalah virulance (vir) region yang mensintesis protein vir dan komponen ketiga adalah gen chromosomal virulance (chv) yang berfungsi dalam pelekatan bakteri ke dalam sel tanaman (Sheng & Citovsky 1996). BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat Bahan-bahan yang digunakan untuk pemurnian gen kitinase produk PCR adalah gen kitinase berupa isolat DNA plasmid yang sudah didapat dari Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia (BPBPI) yang dimurnikan dengan Pure Link TM Quick Gel Extraction kit (Invitrogen), dan untuk verifikasi hasil dengan gel agarosa bahan yang digunakan adalah serbuk agarosa, buffer TBE 0.5 X, etidium bromida (EtBr), loading buffer (brom fenol biru 2.5%, sukrosa 40%), dan marker 1 kb plus (Invitrogen). Teknik cloning yang dilakukan dapat dibagi menjadi tiga tahap, yaitu tahap ligasi, transformasi, dan seleksi transforman. Pada tahap ligasi bahan yang digunakan antara lain vektor pgem-t Easy (Promega), T4 DNA ligase dan buffer ligasi. Sedangkan bahan yang digunakan pada tahap transformasi dan seleksi transforman adalah sel kompeten E.coli XL1-Blue yang

16 5 diperoleh dari Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia (BPBPI), media Luria Bertani (LB) agar Low Salt (LA) yang telah ditambahkan ampisilin 100 mg/l + isopropil D Thiogalaktopiranosida (IPTG) 100mM + 5 bromo 4 kloro 3 indiol galaktopiranosida (X-Gal) 40 mg/l. Isolasi DNA plasmid dilakukan dengan High Pure Plasmid Isolation Kit (Roche). Restriksi dilakukan dengan menggunakan enzim dari Biolabs. Enzim yang digunakan adalah NcoI dan SpeI. Sedangkan transformasi dengan menggunakan sel kompeten kimia dari AGLO, bahan yang digunakan antara lain es batu, nitogen cair, media Yeast Exctract Pepton (YEP), antibiotik rifampisin 50 ppm, dan kanamisin 25 ppm. Peralatan yang digunakan untuk pemurnian gen kitinase produk PCR adalah pisau skapel, timbangan, sentrifus Eppendorf 5417R, dan penangas air. Peralatan yang digunakan untuk elektroforesis adalah sisir, cetakan agar, bak elektroforesis, adaptor 100 volt, dan perangkat gel doc. Selain itu peralatan lain yang digunakan adalah shaker incubator, ruang laminar, autoklaf, ph meter, magnetic stirer, dan peralatan-peralatan gelas seperti cawan petri, gelas piala, labu Erlenmayer, dan gelas ukur. Metode Penelitian Penelitian ini dibagi menjadi 2 tahap, yaitu tahap penemuan gen dan tahap strategi konstruksi gen. Penelitian yang dilakukan sebelumnya yaitu menemukan gen kitinase yang akan digunakan untuk tahapan selanjutnya dengan cara mencari spesifikasi gen yang diinginkan pada bank data Kemudian disain primer berdasarkan informasi yang didapatkan dari National Center for Biotechnology Information (NCBI), amplifikasi menggunakan primer spesifik, cloning pada pgemt-easy dan tahap selanjutnya adalah sekuensing. Setelah tahap I penelitian berhasil ditemukan maka dilanjutkan ke tahap II penelitian yaitu strategi konstruksi gen. Pemurnian Gen Kitinase Produk PCR Pemurnian gen kitinase produk PCR menggunakan Pure Link TM Quick Gel Extraction dari Invitrogen. Fragmen dipotong dari gel dengan menggunakan scalpel dan ditimbang bobotnya. Gel yang sudah dipotong dilarutkan dengan menggunakan buffer GS1 (gel solubilization buffer) dengan perbandingan antara sampel dan buffer yang ditambahkan adalah 1:3. Gel diinkubasi pada suhu 50 o C selama 15 menit, dan setiap 3 menit dibolak-balikan secara perlahan agar bercampur rata dan larut. Setelah larut gel tersebut diinkubasi lagi selama 5 menit pada suhu ruang. Larutan ditransfer ke dalam tabung lalu disentrifugasi dengan kecepatan rpm (15300 rcf) selama 2 menit pada suhu 25 o C. Setelah disentrifus, sebanyak 500 µl GS1 ditambahkan ke dalam tabung dan diinkubasi selama 1 menit lalu disentrifus lagi dengan kecepatan rpm (15300 rcf) selama 2 menit. Sebanyak 700 µl W9 (wash buffer) ditambahkan ke dalam tabung lalu diinkubasi selama 5 menit dan disentrifus kembali dengan kecepatan rpm selama 2 menit. Setelah itu tabung disentrifus kembali dengan kecepatan rpm (15300 rcf) selama 2 menit untuk menghilangkan sisa etanol yang ada. Lalu dielusi dengan 30 µl buffer TE (Tris-EDTA). Setelah itu diinkubasi selama 1 menit dan disentrifus kembali dengan kecepatan rpm (15300 rcf) selama 2 menit. Hasil elusi diverifikasi pada gel agarosa 1 %. Sebanyak 2 µl hasil elusi dilarutkan dengan 1µL loading buffer dan dimasukkan ke dalam sumur yang terbentuk pada gel. Gel diletakkan dalam bak elektroforesis yang telah diisi dengan buffer TBE 0.5X. Lalu dihubungkan dengan adaptor dengan potensial listrik sebesar 100 volt. Setelah selesai, gel diletakkan di bawah sinar UV (perangkat gel doc) untuk melihat ada tidaknya pita yang terbentuk. Ukuran perkiraan fragmen hasil pemurnian gen kitinase produk PCR sekitar 1500 bp (Chaidamsari 2005). Cloning Gen Kitinase ke pgemt-easy Setelah verifikasi pada gel agarosa menunjukkan hasil sesuai dengan yang diharapkan, selanjutnya cloning gen diawali dengan ligasi gen kitinase dengan pgemt- Easy menggunakan kit dari Promega. Sebanyak 3.5 µl insert (hasil elusi) ditambahkan dengan 5 µl buffer ligase, 0.5 µl vektor pgemt-easy dan 1µL T4 ligase. Sehingga total campuran sebanyak 10 µl. Tabung mikro ditutup rapat dengan parafilm kemudian diputar sebentar. Setelah itu campuran diinkubasi selama 1 jam pada suhu ruang atau semalaman pada suhu 4 o C. Selanjutnya hasil ligasi akan ditransformasi ke E.coli (XL1-Blue) (Chaidamsari 2005). Transformasi Gen Kitinase ke Escherichia coli (XL1-Blue) Transformasi gen kitinase ke E.coli (sel kompeten) menggunakan metode Doyle

17 6 (1996). Setelah disimpan semalaman pada suhu 4 o C, hasil ligasi ditempatkan di dalam freezer yang selanjutnya akan dimasukkan ke dalam sel kompeten. Sebanyak 10 µl kitinase hasil ligasi dimasukkan ke dalam 200 µl XL1-Blue (sel kompeten). Kemudian dikocok perlahan hingga tercampur rata. Lalu diinkubasi di dalam es selama 30 menit, setelah itu diinkubasi dalam penangas air pada suhu 42 o C selama 50 detik. Selanjutnya tabung tersebut segera dimasukkan ke dalam es selama 10 menit. Setelah dimasukkan ke dalam es larutan tersebut ditambahkan dengan 800 µl LB (Luria Bertani) + glukosa dan dikocok selama 1.5 jam pada suhu 37 o C dengan kecepatan 150 rpm. Setelah dikocok, larutan diambil sebanyak 100 µl dan disebar menggunakan segitiga penyebar ke dalam media LA yang mengandung ampisilin 100ppm + IPTG (isopropil D thiogalaktopiranosida) 100mM + X-Gal (5- bromo-4-kloro-3-indiol- -galaktopiranosida) 40 mg/l. Selanjutnya diinkubasi semalam pada suhu 37 o C. Seleksi transforman dilakukan dengan pengamatan terhadap koloni yang terbentuk. Koloni yang terbentuk adalah sel E.coli yang berhasil ditransformasi, sedangkan yang tidak berhasil ditransformasi akan mati akibat penambahan ampisilin. Dua jenis koloni akan terbentuk pada cawan petri. Koloni yang berwarna putih menunjukkan sel yang mengandung plasmid yang berhasil disisipi. Sedangkan koloni yang berwarna biru mengandung plasmid yang tidak berhasil disisipi. Setiap koloni putih yang terbentuk diberi nomor dan ditandai. Koloni yang berwarna putih kemudian dengan tusuk gigi steril diambil sedikit untuk PCR DNA koloni dan sedikit dipindahkan ke medium LB agar dalam cawan petri (duplikat koloni). Konfirmasi Koloni Transforman yang Membawa Fragmen Sisipan Konfirmasi koloni transforman menggunakan metode Chaidamsari (2005) dan dilakukan dengan teknik PCR DNA koloni. Proses PCR DNA koloni menggunakan mesin PCR (Biometra T- personal). Proses ini diawali oleh pemecahan sel (lisis) dengan pemanasan pada suhu 96 o C selama 5 menit kemudian suhu turun menjadi 50 o C dan berlangsung selama 90 detik, suhu naik kembali menjadi 96 o C selama 90 detik, lalu 90 detik selanjutnya pada suhu 45 o C, 1 menit pada suhu 96 o C dan 40 o C selama 1 menit. Setelah pemanasan pada proses lisis, campuran PCR (buffer lengkap, molecular water, dntps, primer M13F, M13R dan Taq polimerase) ditambahkan pada setiap sampel. Proses PCR dilanjutkan kembali dengan suhu 94 o C selama 30 detik, 55 o C selama 1 menit dan 2 menit pada 72 o C selama 30 siklus dan selanjutnya 72 o C selama 5 menit. PCR DNA koloni dilakukan menggunakan primer universal M13 F dan R serta koloni bakteri sebagai cetakan. Hasil PCR DNA koloni diverifikasi pada gel agarosa. Koloni terpilih kemudian dikultur dalam medium LB cair yang telah ditambahkan ampisilin dan diinkubasi pada shaker-incubator suhu 37 o C, 150 rpm. Dari kultur bakteri yang tumbuh, selanjutnya dilakukan isolasi DNA plasmid menggunakan High Pure Plasmid Isolation Kit (Roche). Hasil isolasi diverifikasi kembali pada gel agarosa. Tahap selanjutnya akan dilakukan sekuensing fragmen gen terklon. Pengurutan basa (sekuensing) fragmen gen terklon dilakukan di Lembaga Molekuler Eijkmen Jakarta menggunakan primer universal M13F dan M13R. Hasil sekuen selanjutnya dianalisis menggunakan program bioedit dan BLASTX untuk membandingkan sekuen nukleotida yang ditranslasi pada seluruh open reading frame (ORF) dengan sekuens protein pada basis data. Analisis menggunakan BLASTX bertujuan untuk mengetahui kesesuaian urutan basa yang didapatkan dengan urutan basa yang ada dalam bank data. Isolasi DNA Plasmid Rekombinan Isolasi DNA plasmid dilakukan berdasarkan hasil PCR DNA koloni yang diketahui mengandung plasmid terinsersi fragmen yang diinginkan. Koloni tersebut dikulturkan dalam media LB yang mengandung ampisilin kemudian diinkubasi selama 16 jam pada suhu 37 o C, 150 rpm. Plasmid diisolasi dengan menggunakan High Pure Plasmid Isolation Kit (Roche). Sebanyak 3 4 ml dipindahkan ke dalam tabung mikro lalu disentrifugasi dengan kecepatan 8000 rpm (6753 rcf) pada suhu 25 o C selama 2 menit. Selanjutnya pelet yang dihasilkan diresuspensikan kembali dengan 250 µl suspension buffer + RNAse. Setelah itu ditambahkan kedalamnya 250 µl lysis buffer dan tabung dibolak-balikan secara perlahan sebanyak 6-8 kali, kemudian diinkubasi selama 5 menit pada suhu ruang. Lalu sebanyak 350 µl binding buffer ditambahkan kedalamnya dan dibolak-balikan secara perlahan sebanyak 3-6 kali, kemudian diinkubasi selama 5 menit di dalam es. Setelah disimpan di dalam es, suspensi

18 7 tersebut disentrifugasi dengan kecepatan rpm (15300 rcf) selama 10 menit. Supernatan yang dihasilkan, dipindahkan ke dalam tube filter (kolom) dan disentrifugasi kembali dengan kecepatan rpm (15300 rcf) selama 2 menit. Selanjutnya sebanyak 500 µl wash buffer I ditambahkan kedalamnya dan disentrifugasi dengan kecepatan rpm (15300 rcf) selama 2 menit. Kemudian ditambahkan lagi dengan wash buffer II sebanyak 700 µl dan disentrifugasi dengan kecepatan rpm (15300 rcf) selama 2 menit. Tabung filter (kolom) disentrifus dalam keadaan kosong untuk menghilangkan sisa etanol yang ada. Kemudian ditransfer ke dalam tabung 1.5 ml yang baru. Lalu dilarutkan dengan elution buffer sebanyak 30 µl, larutan diinkubasi selama 1 menit untuk melarutkan DNA yang berada pada membran filter, selanjutnya disentrifugasi kembali dengan kecepatan rpm (15300 rcf) selama 2 menit. DNA plasmid diverifikasi pada gel agarosa 1 %. Restriksi Gen Kitinase dan pcambia 1303 dengan Enzim Restriksi Restriksi dilakukan dengan menggunakan enzim dari Biolabs. Plasmid yang mengandung gen kitinase dipotong menggunakan enzim Nco1 dan Spe1. Restriksi DNA plasmid dan pcambia 1303 dilakukan dengan dimasukkannya 7 µl DNA plasmid dan ditambahkan dengan 8.8 µl dh 2 O, 0.2 µl BSA, 2 µl buffer 2 (SpeI), 1 µl enzim SpeI dan 1 µl enzim NcoI sehingga volum total yang ada didalam tabung mikro tersebut sebanyak 20 µl. Campuran diinkubasi selama 3 jam pada suhu 37 o C. Selanjutnya hasil restriksi dielektroforesis dengan menggunakan gel agarosa 0.5%. Setelah itu gel ditempatkan di bawah lampu ultraviolet (UV) untuk melihat gen kitinase yang sudah terpisah sempurna dengan vektor (pgemt). Tahap selanjutnya fragmen gen kitinase dipotong dari gel menggunakan scalpel untuk elusi dan hasil elusi dicek pada gel agarosa 1 % (Chaidamsari 2005). Ligasi Gen Kitinase dengan pcambia 1303 Ligasi dilakukan dengan menggunakan T4 ligase dan buffer ligase dari Promega. Sebanyak 1 µl hasil elusi dicampurkan dalam tabung steril 500 µl dengan buffer (2x) sebanyak 5 µl, vektor pcambia sebanyak 3 µl dan T4 ligase sebanyak 1 µl sehingga volume total menjadi 10 µl. Campuran diinkubasi selama 1 jam pada suhu ruang atau semalaman pada suhu 4 o C (Chaidamsari 2005). Selanjutnya hasil ligasi gen kitinase dengan pcambia akan ditransformasi ke sel kompeten (XL-1 Blue). Sel kemudian disebarkan diatas medium LB agar yang telah ditambahkan dengan kanamisin 25 ppm. Setelah itu diinkubasi semalam pada suhu 37 o C. Seleksi transforman dilakukan dengan pengamatan terhadap koloni yang terbentuk. Koloni yang terbentuk adalah koloni berwarna putih. Koloni putih yang tumbuh dari gen kitinase diduplikat dan diisolasi DNA plasmidnya. Koloni putih tersebut mengandung DNA rekombinan. Koloni tersebut juga dibuat duplikatnya dan dikulturkan dalam media LB yang mengandung kanamisin 25 ppm. Lalu dikocok pada kecepatan 150 rpm selama semalam pada suhu 37 o C. Dari kultur bakteri yang tumbuh, selanjutnya dilakukan isolasi DNA plasmid menggunakan High Pure Plasmid Isolation Kit (Roche). Hasil isolasi diverifikasi kembali pada gel agarosa 1%. Transformasi Menggunakan Sel Kompeten Kimia ke Agrobacterium tumefaciens Strain AGLO Setelah hasil verifikasi pada agarosa sesuai dengan yang diharapkan, tahap selanjutnya adalah restriksi kembali gen kitinase dengan enzim restriksi yang sama. Tujuan dari restriksi ini adalah untuk mengecek gen kitinase tersebut sudah masuk ke dalam vektor atau tidak. Selanjutnya jika gen kitinase tersebut sudah masuk ke dalam vektor ekspresi maka tahap selanjutnya akan ditransformasikan ke dalam Agrobacterium. Transformasi ke Agrobacterium menggunakan metode Chaidamsari (2005), dengan cara sebanyak 5-10 L DNA plasmid dimasukkan ke dalam 500 L sel kompeten, diamkan di dalam es selama 15 menit. Setelah itu, diinkubasi di dalam es, diinkubasi kembali selama 5 menit di dalam nitrogen cair dengan suhu 260 o C dan setelahnya 5 menit pada suhu 37 o C. Kemudian sebanyak 1 ml YEP (Yeast Exctract Pepton) ditambahkan kedalamnya dan dikocok selama 3 jam pada suhu 28 o C dengan kecepatan 150 rpm. Setelah dikocok, larutan tersebut disentrifugasi dengan kecepatan 6000 rpm (3800 rcf) selama 3 menit. Supernatan yang dihasilkan sebagian dibuang dan sebanyak 200 L supernatan yang tersisa diresuspensikan dengan pelet yang terbentuk. Setelah itu sebanyak 200 L larutan tersebut dipipet dan dimasukkan ke dalam media LA yang telah berisi antibiotik kanamisin 25 ppm dan rifampisin 50 ppm.

19 8 Inkubasi selama 2 hari pada suhu 28 o C dalam kondisi gelap dengan kecepatan 150 rpm. Setelah diinkubasi selama 2 hari, hasilnya adalah terbentuknya koloni berwarna putih. Koloni yang terbentuk kemudian diambil dengan tusuk gigi steril dan diberi nomor lalu dimasukkan ke dalam media agar untuk dibuat duplikatnya dan dikulturkan dalam media LB yang mengandung kanamisin 25 ppm dan rifampisin 50 ppm. Selanjutnya dikocok selama 2 malam dengan kecepatan 150 rpm dan dilakukan isolasi DNA plasmid. Setelah itu, dilakukan restriksi kembali dengan menggunakan enzim NcoI dan SpeI. Keberhasilan tahap ini dapat dilihat berdasarkan hasil restriksi dengan enzim NcoI dan SpeI. Tahap selanjutnya dari penelitian ini, akan dilanjutkan oleh peneliti yang lain dari hasil yang didapatkan akan ditransformasikan melalui Agrobacterium ke eksplan tanaman kelapa sawit. HASIL DAN PEMBAHASAN Pemurnian Gen Kitinase Produk PCR Strategi dalam konstruksi gen harus mempertimbangkan dua hal yaitu urutan nukleotida gen yang akan dikonstruksi dan vektor ekspresi yang akan digunakan. Gen kitinase (chi) telah diamplifikasi oleh peneliti sebelumnya. Hasil PCR produk yang didapat dari tahap penelitian sebelumnya, dimurnikan terlebih dahulu untuk menghilangkan komponen-komponen yang dapat menghambat proses kloning selanjutnya. Hasil pemurnian PCR produk gen chi ditunjukkan pada Gambar 3. Berdasarkan hasil yang didapat, terlihat bahwa pada sumur 2 terdapat pita yang cukup tebal dengan ukuran yang sesuai dengan pita marka 1500 bp. Hasil dari gambar ini menunjukkan bahwa produk PCR yang telah murni adalah benar gen chi yang diinginkan bp 1000 bp M bp M 1 2 Gambar 3 Pemurnian PCR produk gen chi. (M) marker, (1&2) gen chi. Cloning Gen Kitinase Hasil PCR pada pgemt-easy Fragmen hasil amplifikasi (PCR) yang diverifikasi pada gel agarosa (Gambar 3), dipotong dari gel dan dimurnikan untuk digunakan pada tahap cloning. Cloning dibagi menjadi tahap ligasi, transformasi ke dalam sel kompeten, dan seleksi transforman. Vektor cloning yang digunakan pada penelitian adalah pgemt-easy dari Promega. Seperti terlihat pada Gambar 4, plasmid yang digunakan memiliki basa timin pada bagian ujungnya (3 T-overhang). Basa T dari vektor dapat berikatan dengan fragmen gen hasil PCR yang memiliki kelebihan basa adenin, tanpa memerlukan tahapan restriksi terlebih dahulu. Proses ligasi terjadi dengan adanya bantuan enzim T4 DNA ligase, yaitu enzim yang membentuk ikatan fosfodiester diantara fragmen gen (insert) dan basa dari plasmid yang digunakan. Proses tersebut dapat dilakukan pada suhu ruang selama satu jam atau diinkubasi pada suhu 4 o C selama semalam. Proses ligasi antara gen kitinase dan vektor cloning dalam hal ini telah berhasil dilakukan. Gambar 4 Vektor klon pgemt-easy dan peta restriksi yang dimiliki (Promega 1999). Transformasi Gen Kitinase ke Escherichia coli (XL-1 Blue) Produk ligasi yang telah berhasil, kemudian ditransformasi ke dalam sel E. coli XL1- Blue kompeten. Berdasarkan koloni yang terbentuk pada media (Gambar 5), menunjukkan bahwa hasil kloning gen kitinase ke dalam pgemt-easy telah berhasil dilakukan. Transformasi dilakukan dengan pemberian kejut panas (heat shock) pada suhu 42 o C selama 50 detik. Prinsip utama dari proses tersebut adalah terjadi lonjakan suhu dari 0 o C ke 42 o C terhadap sel yang telah diberi perlakuan dengan CaCl 2. Garam CaCl 2

20 9 ( B) (B) Hal ini mengakibatkan koloni menjadi berwarna putih. Pada seleksi biru putih, IPTG berfungsi sebagai penginduksi ekspresi gen sedangkan X-Gal berfungsi sebagai substrat. (A) Gambar 5 Contoh duplikat dari koloni hasil transformasi. (A) koloni berwarna putih, (B) koloni berwarna biru. akan mempengaruhi struktur dan muatan dari membran sel. Sehingga pada saat terjadi lonjakan suhu membran menjadi tidak selektif terhadap molekul asing dan produk ligasi dapat masuk ke dalam sel. Sel kemudian dikultur dalam media tumbuh (LB + glukosa) selama 1.5 jam untuk memperbanyak jumlah sel. Setelah itu sel disebar pada medium seleksi (LA + ampisilin 100 ppm + isopropil- -D-thiogalaktopiranosida (IPTG) 100mM + 5-bromo-4-kloro-3-indiol- -galaktopiranosida (X-Gal) 40 mg/l), dan diinkubasi semalaman pada suhu 37 o C. Tahap terakhir dari proses cloning adalah seleksi transforman. Seleksi transforman dapat dilakukan dengan pengamatan warna koloni putih dan biru yang tumbuh pada media seleksi. Keberhasilan pada tahap cloning ini dilihat dari hasil koloni yang terbentuk pada media. Secara teoritis koloni berwarna putih merupakan koloni yang membawa fragmen gen sisipan (insert) dan sebaliknya koloni berwarna biru membawa plasmid yang tidak tersisipi oleh fragmen gen yang diinginkan. Adanya koloni biru putih berhubungan dengan terekspresinya enzim -galaktosidase. Fragmen gen sisipan yang terdapat pada plasmid akan menghambat sintesis -peptida yang berperan sebagai aktivator terhadap kerja enzim -galaktosidase (Reece 2004). Dalam keadaan aktif, yaitu ketika berada pada bentuk tetramernya, enzim galaktosidase akan menghidrolisis X-Gal (5 bromo 4 kloro 3 indol D galaktopiranosida) menjadi galaktosida dan senyawa turunan 5-bromo-4- kloro indoksil yang berwarna biru. Penyisipan fragmen DNA ke MCS (Multiple Cloning Site) akan merusak susunan basa gen Lac Z sehingga ekspresi gen yang menghasilkan enzim fungsional tidak terjadi. Konfirmasi Koloni Transforman yang Membawa Fragmen Sisipan Hasil dari PCR DNA koloni disajikan pada Gambar 6. Koloni positif atau koloni yang membawa fragmen gen chi ditunjukkan dengan terbentuknya pita berukuran sekitar 1700 bp. Apabila dicermati lebih lanjut, terjadi penambahan ukuran sekitar 200 bp dari fragmen asli chi yaitu 1500 bp. Penambahan tersebut berasal dari primer universal yang digunakan (M13). Primer universal yang berada dalam pgemt akan menambah ukuran insert karena sebagian basa pgemt- Easy turut diamplifikasi pada saat proses PCR DNA koloni. Dari gambar terlihat bahwa koloni nomor 14 merupakan koloni positif. Koloni yang positif, kemudian dikultur dalam media yang telah ditambahkan antibiotik. Selanjutnya dilakukan isolasi DNA plasmid dari setiap kultur yang diperoleh menggunakan High Pure Plasmid Isolation Kit (Roche). Hasil isolasi plasmid diverifikasi pada gel agarosa. Kemudian, plasmid dari tiap koloni chi dianalisis urutan basanya menggunakan primer universal M13 F dan M13 R. Adapun tujuan utama dari PCR DNA koloni adalah untuk mengkonfirmasi koloni transforman yang membawa fragmen gen sisipan (Nurhaimi 2006) dan menghindari kesalahan dari pengamatan warna koloni. Hasil isolasi DNA plasmid yang positif selanjutnya disekuensing. Sekuensing diperlukan untuk menganalisis fragmen gen kitinase yang berhasil diisolasi. Sekuensing dapat dilakukan dengan menggunakan produk PCR langsung atau melalui hasil cloning M Gambar 6 Hasil PCR DNA koloni chi 14. (M) marker 1 kb plus DNA ladder, (No 1-20) nomor koloni yang digunakan sebagai cetakan.

21 10 Urutan basa yang diperoleh kemudian dianalisis menggunakan program BLASTX. Berdasarkan analisis BLASTX dengan melihat parameter skor (bits) lebih dari 150 dan E value yang kurang dari 10-4, maka tingkat homologi yang dihasilkan cukup baik (Claveri & Notredam 2003). Semakin tinggi skor (bits) maka tingkat homologinya semakin baik, semakin rendah E value maka semakin baik pula tingkat homologinya. Selain nilai skor dan E value, tingkat homologi juga dapat dilihat dari garis berwarna merah pada grafik hasil BLASTX. Analisis ini diperlukan untuk mengetahui apakah gen yang berhasil diisolasi sesuai dengan yang diharapkan. Hasil analisis BLASTX (Gambar 7) menunjukkan bahwa fragmen gen kitinase. (chi) yang diperoleh menyandi enzim endochitinase. Chi memiliki homologi yang tinggi dengan enzim chitinase yang lain. Hal tersebut teramati melalui skor (bits) yang lebih besar dari 150. Homologi chi dengan protein lain yang bersesuaian disajikan pada Tabel 1. Selanjutnya hasil sekuen dengan M13 F dan reverse complement M13 R disejajarkan menggunakan pairwaise aligment (Bioedit). Tujuan utama dari pairwaise aligment adalah untuk mengetahui urutan basa yang sama (overlap) dari hasil sekuen menggunakan primer M13 F dan M13 R. Data hasil sekuensing berupa elektroforegraf yang menggambarkan urutan basa fragmen gen chi berukuran 1500 bp (Lampiran 5). Ukuran fragmen yang didapat sesuai dengan hasil amplifikasi fragmen gen chi sebelumnya, yaitu sekitar 1500 bp. Hasil yang didapat merupakan gambaran bahwa proses cloning dan sekuensing telah berhasil dilakukan. Tabel 1 Hasil analisis BLASTX fragmen gen chi * Protein yang Score E value bersesuaian endochitinase 322 1e-86 [Trichoderma... endochitinase 322 1e-86 [Hypocrea... endochitinase 320 4e-86 [Hypocrea... endochitinase [Trichoderma... endochitinase [Trichoderma e-83 3e-82 *hanya ditampilkan sebagian, secara lebih lengkap dapat dilihat pada lampiran 6. Restriksi Gen Kitinase dan pcambia 1303 dengan Enzim Restriksi Hasil sekuensing yang telah didapat, digunakan untuk memulai tahap awal dalam konstruksi gen chi. Tahap awal untuk mengkonstruksi gen ini adalah restriksi gen chi dan pcambia itu sendiri. Supaya gen chi dapat disambungkan pada vektor ekspresi (pcambia 1303), maka terlebih dahulu pcambia 1303 dipotong dengan enzim NcoI dan SpeI. Hasil restriksi pcambia 1303 disajikan pada Gambar 8. Setelah dipotong dengan enzim NcoI dan SpeI, hasil elektroforesis pada Gambar 8 menunjukkan pita dengan ukuran sekitar bp. Pita dengan ukuran bp tersebut merupakan ukuran pcambia 1303 yang berhasil dipotong dengan enzim NcoI dan SpeI. Setelah itu, fragmen pcambia 1303 tersebut dipotong dari gel untuk dielusi dengan Pure Link TM Quick Gel Extraction (Invitrogen). Hasil pemurnian dari plasmid pcambia 1303 disajikan pada Gambar 9. Hasil pemurnian tersebut bp bp M 1 Gambar 7 Hasil analisis BLASTX fragmen gen chi. Gambar 8 Hasil elektroforesis restriksi pcambia 1303 dengan enzim NcoI dan SpeI (M) marker, (1) pcambia 1303.

22 bp bp 1 2 M Gambar 9 Hasil pemurnian plasmid pcambia (1&2) pcambia 1303, (M) marker. menunjukkan bahwa pada sumur satu dan dua terlihat adanya pita yang cukup tebal dengan ukuran bp. Hal ini menggambarkan bahwa pemurnian plasmid pcambia 1303 hasil restriksi telah murni. Begitu pula sebaliknya, gen chi dipotong dengan enzim NcoI dan SpeI dari vektor cloning (pgemt-easy) untuk disambungkan pada vektor ekspresi pcambia Hasil elektroforesis gen chi dari pgemt-easy disajikan pada Gambar 10. Setelah dipotong dengan enzim NcoI dan SpeI, hasil elektroforesis pada Gambar 10 menunjukkan adanya 2 pita dengan ukuran 3000 bp dan 1500 bp. Dua pita DNA ini disebabkan adanya dua sisi restriksi yang dikenali oleh enzim restriksi dalam urutan nukleotida plasmid. Pita dengan ukuran 3000 bp merupakan ukuran dari vektor cloning (pgemt-easy) sedangkan pita dengan ukuran M bp 1500 bp Gambar 10 Hasil elektroforesis restriksi gen chi dari pgemt-easy. (M) marker, (1) pgemt-easy (3000 bp) dan gen chi (1500 bp) bp merupakan ukuran dari gen chi. Dengan demikian disimpulkan bahwa gen chi sudah terpisah sempurna dari vektor cloning (pgemt-easy). Selanjutnya fragmen dari gen chi dipotong dari gel lalu dielusi dengan Pure Link TM Quick Gel Extraction (Invitrogen) untuk diligasi dengan pcambia Vektor pcambia 1303 yang digunakan pada penelitian berfungsi sebagai vektor ekspresi. Plasmid pcambia 1303 mempunyai rentang yang luas sehingga bersifat stabil jika ditransformasikan baik ke tanaman dikotil maupun pada tanaman monokotil. Vektor ini didasarkan pada pcambia pcambia 1303 mengandung gusa, mgfp5, dan His6 fusion. Selain itu, plasmid pcambia 1303 juga mengandung promotor CaMV35S (Cauliflower Mosaic Virus). Promotor ini berhubungan dengan urutan yang terpoliadenilasi pada T-DNA plasmid. Hal ini memungkinkan pembuatan klon langsung ke dalam T-DNA plasmid. Sedangkan T-DNA sendiri merupakan untaian DNA yang akan ditransfer ke sel tanaman. Gen gusa (betaglucuronidase) dalam plasmid pcambia 1303 yang berfungsi sebagai gen reporter untuk memonitor proses transformasi dan introduksi gen yang direkayasa. Selain itu, enzim restriksi NcoI dan SpeI yang digunakan untuk memotong gen kitinase dan pcambia 1303 tergolong dalam enzim endonuklease restriksi yang hanya memotong DNA utas ganda pada sekuen tertentu yang disebut sekuen pengenalan atau situs pengenalan (recognition site). Enzim SpeI berasal dari strain E. coli yang diisolasi dari Sphaerotilus dengan situs restriksi 5 A CTAGT3. Sedangkan enzim NcoI berasal dari strain E.coli yang diisolasi dari Nocardia corallina dengan situs restriksi 5 C CATGG 3. Alasan enzim NcoI dan SpeI digunakan pada penelitian ini karena, gen chi akan dimasukkan ke dalam vektor ekspresi (pcambia 1303). Untuk dapat memotong, hal pertama yang harus dilihat adalah restriction map dari pcambia 1303 dan pgemt-easy. Enzim-enzim yang ada pada pcambia disesuaikan terlebih dahulu dengan enzim yang ada pada pgemt-easy. Pada peta restriksi pcambia 1303, terdapat NcoI dan SpeI tepat dibelakang promotor CaMV35S yang mengekspresikan gen gusa dan gene flourescent protein (gfp) (Gambar 11). Sedangkan pada peta restriksi pgemt-easy juga terdapat enzim NcoI dan SpeI (Gambar 4). Jika enzim yang akan digunakan tersebut

23 12 sesuai dengan terdapat pada vektor kloning maupun vektor ekspresi maka enzim tersebut dapat digunakan untuk memotong gen yang diinginkan. Dalam proses restriksi ini juga menggunakan BSA (Bouvine Serum Albumin) yang berfungsi untuk menstabilkan enzim pada restriksi pcambia 1303 dan gen kitinase itu sendiri. Gambar 12 Skema ligasi gen chi dengan plasmid pcambia Gambar 11 Peta restriksi pcambia 1303 dengan enzim restriksi. Ligasi Gen Kitinase dengan pcambia 1303 Gen kitinase dan pcambia 1303 yang telah dipotong dengan enzim NcoI dan SpeI, kemudian diligasi. Enzim DNA ligase berfungsi menempelkan rantai tunggal pada ujung molekul DNA utas ganda, yang memiliki ujung 5 dengan gugus fosfat dan yang memiliki ujung 3 dengan gugus hidroksil. Sifat komplementer hasil restriksi dari enzim restriksi yang sama (atau enzim berbeda yang menghasilkan ujung lancip yang sama) sangat penting untuk menempelkan DNA dari sumber yang berbeda. Enzim ligase memiliki efisiensi lebih tinggi untuk menempelkan ikatan fosfodiester yang putus pada pasangan ujung lancip daripada ujung tumpul (Turner et al. 2000). Skema ligasi gen chi dengan plasmid pcambia 1303 disajikan pada Gambar 12. Hasil ligasi antara pcambia 1303 dan gen chi kemudian ditransformasi ke E. coli strain XL1-Blue. Transformasi merupakan proses memasukkan DNA asing biasanya plasmid, ke dalam suatu organisme. Metode transformasi dilakukan antara lain dengan metode fisika, (injeksi partikel, bombardment, pulsa medan listrik),metode kimia (melarutkan DNA dalam larutan PEG dan penggunaan kejut panas), atau secara biologis (menggunakan vektor E. coli atau Agrobacterium) (Endress 1994). Transformasi ke sel bakteri biasanya dilakukan dengan perlakuan Ca 2+ sehingga membuat bakteri tersebut kompeten untuk dimasuki DNA plasmid. (Turner et al. 2000). Transformasi ke E. coli dilakukan untuk memperbanyak jumlah DNA plasmid rekombinan. Sel kemudian disebarkan diatas medium LB agar yang telah ditambahkan dengan kanamisin 25 ppm. Setelah itu diinkubasi semalam pada suhu 37 o C. Dalam hal transformasi koloni, seleksi transforman antara gen chi dengan pcambia 1303 melalui warna koloni yang terbentuk berbeda dengan seleksi transforman antara gen chi pada pgemt-easy. Warna koloni yang terbentuk pada hasil transformasi gen chi dengan pcambia ke dalam sel kompeten hanya menghasilkan satu warna koloni saja, yaitu koloni berwarna putih (Gambar 13). Setelah hasil transformasi menghasilkan warna koloni putih yang mengandung plasmid rekombinan, maka dari koloni yang terbentuk tersebut diduplikat dan dikultur untuk memperbanyak jumlah plasmid rekombinan. Gambar 13 Contoh transformasi koloni gen chi dengan pcambia ke dalam sel kompeten (XL1-Blue). Isolasi DNA Plasmid Rekombinan Hasil isolasi DNA plasmid dielektroforesis pada gel agarosa sehingga menghasilkan pita-

24 13 pita DNA yang berbeda ukurannya dapat terpisah. Elektroforesis DNA plasmid yang mengandung sisipan gen chi disajikan pada Gambar 14. Berdasarkan hasil isolasi DNA plasmid gen chi yang ditransformasi ke dalam sel E.coli menghasilkan satu ukuran yaitu ± bp. Ukuran ini didapat dari penggabungan ukuran pcambia yaitu bp dan gen chi itu sendiri yang mempunyai ukuran sekitar 1500 bp. Tahap selanjutnya, DNA plasmid hasil isolasi dipotong kembali dengan enzim NcoI dan SpeI untuk memeriksa bahwa plasmid tersebut adalah benar pcambia 1303 yang mengandung gen chi. Hasil pemotongan DNA kemudian dielektroforesis pada gel agarosa dan disajikan pada Gambar 15. Hasil pemotongan menunjukkan bahwa pita yang terbentuk merupakan plasmid klon pcambia 1303 yang telah disisipi gen chi. Hal ini diperlihatkan dari ukuran pita DNA berukuran bp yang merupakan ukuran rantai DNA pcambia 1303 setelah dipotong dengan NcoI dan SpeI dan pita DNA 1500 bp yang merupakan ukuran dari gen chi bp M 1 Gambar 14 Hasil elektroforesis isolasi DNA plasmid gen chi dengan pcambia (M) marker, (1) DNA plasmid pcambia 1303 yang mengandung gen chi bp 1000 bp bp bp 1500 bp M 1 Gambar 15 Hasil pemotongan plasmid pcambia1303-gen chi dengan NcoI dan SpeI. Timbulnya beberapa pita DNA hasil isolasi disebabkan oleh adanya perbedaan konformasi dari plasmid-plasmid tersebut. Pergerakan fragmen DNA pada gel agarosa proporsional terhadap logaritma berat molekul fragmen tersebut. Plasmid yang memiliki putaran (koil) lebih banyak memiliki bentuk yang lebih kompak sehingga lebih mudah melalui pori-pori dalam gel agarosa daripada plasmid yang putarannya lebih sedikit. Sehingga, plasmid yang memiliki putaran lebih banyak lebih cepat jalannya di dalam gel dibanding dengan plasmid yang memiliki putaran lebih sedikit. Faktor penting lain yang berpengaruh adalah kehadiran interkalator. Interkalator yang paling terkenal adalah etidium bromida. Etidium bromida merupakan senyawa polisiklik aromatik bermuatan positif yang akan berikatan dengan DNA yang bermuatan negatif dengan menginsersikan dirinya diantara pasangan basa (interkalasi). Interkalasi menyebabkan DNA heliks melonggar sekitar 26 o C. Proses isolasi, elektroforesis dan pewarnaan DNA dengan etidium bromida juga mempengaruhi putaran DNA heliks (Turner et al. 2000). Isolasi DNA plasmid pada penelitian ini menggunakan High Pure Plasmid Isolation Kit (Roche). Isolasi DNA plasmid dengan menggunakan kit ini, pada prinsipnya sama dengan pemisahan plasmid berdasarkan ukuran. Proses pemisahan plasmid berdasarkan ukurannya dimulai dengan pembuatan ekstrak sel. Jika sel dipecah secara perlahan pada kondisi terkendali hanya sebagian kecil DNA kromosom yang putus, sehingga fragmen DNA kromosom berukuran jauh lebih besar dari ukuran plasmid dapat dipisahkan dari plasmid dengan cara mengendapkan DNA kromosom bersama serpihan sel melalui sentrifugasi. Cara ini dapat meminimalkan kerusakan DNA kromosom dan selanjutnya dari proses sentrifugasi akan menghasilkan larutan jernih yang mengandung DNA yang hampir seluruhnya berupa DNA plasmid. Prinsip dari elektroforesis gel agarosa yaitu dapat memisahkan DNA linear berdasarkan perbedaan ukuran, melalui migrasi DNA pada sebuah matriks dalam pengaruh medan listrik karena setiap nukleotida dalam sebuah molekul asam nukleat membawa sebuah muatan negatif. Elektroforesis juga bisa digunakan untuk mendeterminasi organisasi molekul plasmid (Turner et al. 2000). Jika gel ditempatkan dalam tangki elektroforesis yang mengandung larutan buffer dan tangki tersebut dialiri arus

25 14 listrik, maka molekul DNA yang bermuatan negatif pada ph netral akan bergerak ke arah positif (anode). Kecepatan migrasi DNA dapat ditentukan oleh beberapa faktor, diantaranya ukuran molekul DNA, konsentrasi agarosa, konformasi DNA, voltase yang digunakan, adanya etidium bromida di dalam gel dan komposisi larutan buffer (Muladno 2002). Transformasi Menggunakan Sel Kompeten Kimia ke Agrobacterium tumefaciens Strain AGLO Berdasarkan hasil pemotongan pcambia 1303 dan gen chi yang diverifikasi pada agarosa sesuai dengan yang diharapkan, maka tahap selanjutnya adalah transformasi pcambia 1303 yang mengandung gen chi ke Agrobacterium tumefaciens dengan menggunakan sel kompeten kimia strain AGLO. Transformasi ini telah berhasil dilakukan berdasarkan hasil terbentuknya koloni yang ditunjukkan pada Gambar 16. Transformasi gen kitinase ke dalam Agrobacterium tumefaciens dilakukan dengan pemberian kejut panas (heat shock). Prinsip utama dari proses tersebut adalah terjadi lonjakan suhu dari 0 o C ke 37 o C terhadap sel. Sehingga pada saat terjadi lonjakan suhu membran menjadi tidak selektif terhadap molekul asing dan produk dapat masuk ke dalam sel. Sel yang telah ditransformasi selanjutnya diinkubasikan dalam medium YEP (yeast ekstrak pepton) dan dikocok selama 3 jam dengan kecepatan 150 rpm, pada suhu 28 o C. Pengocokan ini berfungsi memberikan kesempatan bagi sel untuk mengekspresikan gen marka pada plasmid. Setelah itu, sel disebarkan dalam medium selektif yang telah ditambahkan dengan kanamisin 25 ppm dan rifampisin 50 ppm. Gambar 16 Contoh duplikat koloni hasil transformasi pcambia1303 yang mengandung gen chi melalui Agrobacterium. Seleksi transforman umumnya berdasarkan oleh adanya marka seleksi yang diselipkan pada plasmid. Marka seleksi itu sendiri merupakan gen yang memberi karakteristik baru pada sel transforman yang tidak dimiliki oleh sel bukan transforman. Dalam transformasi melalui Agrobacterium ini, antibiotik yang digunakan adalah kanamisin dan rifampisin. Kedua antibiotik ini digunakan karena plasmid pcambia 1303 membawa marka seleksi berupa gen resistensi terhadap antibiotik kanamisin sedangkan antibiotik rifampisin digunakan dalam transformasi melalui Agrobacterium ini berfungsi untuk membunuh E. coli agar plasmid rekombinan yang terdapat di dalam E. coli dapat dimasukkan ke dalam Agrobacterium. Dengan demikian, sel yang mengalami transformasi (membawa plasmid pcambia 1303) bersifat resisten terhadap kanamisin maupun rifampisin, sedangkan sel yang tidak mengalami transformasi akan sensitif terhadap kedua antibiotik tersebut. Oleh karena itu, seleksi transforman dapat dilakukan dengan cara menumbuhkan sel yang ditransformasi dalam medium yang mengandung kanamisin dan rifampisin. Sel transforman akan mampu tumbuh dan membentuk koloni sedangkan sel yang bukan transforman akan mati. Sel perlu waktu cukup untuk menghasilkan enzim dalam jumlah yang cukup untuk menangkal pengaruh antibiotik. Oleh karena itu, setelah proses transformasi sel tidak langsung ditumbuhkan ke dalam medium selektif (mengandung antibiotika) tetapi terlebih dahulu ditumbuhkan dalam medium cair tanpa antibiotika dalam jangka waktu pendek agar replikasi plasmid dan pembentukan enzim dapat berlangsung. Dalam transformasi melalui Agrobacterium ini, setelah disebarkan dalam medium selektif, plasmid pcambia yang mengandung gen chi diinkubasi selama 2 hari dalam keadaan kondisi gelap. Hal ini bertujuan untuk menyamakan kondisi tempat tinggal Agrobacterium yang hidup di dalam tanah yaitu dalam keadaan gelap. Sehingga sel transforman dapat bertahan hidup saat ditumbuhkan dalam medium selektif. Koloni yang positif, kemudian dikultur dalam media yang telah ditambahkan antibiotik. Selanjutnya dilakukan isolasi DNA plasmid dari setiap kultur yang diperoleh. Hasil isolasi plasmid diverifikasi pada gel agarosa (Gambar 14). Untuk mengkonfirmasi kebenaran konstruksi gen chi ke pcambia 1303 melalui Agrobacterium ini, maka perlu

26 15 dilakukan pemotongan dengan menggunakan enzim restriksi yang sama yaitu NcoI dan SpeI (Gambar 15) agar dapat diketahui bahwa plasmid pcambia 1303 yang mengandung gen chi telah masuk ke dalam Agrobacterium. Hasil transformasi plasmid pcambia 1303 yang mengandung gen chi selanjutnya akan ditransfer pada tanaman kelapa sawit (kalus sawit) melalui sistem Agrobacterium tumefaciens. Dengan demikian, konstruksi gen chi pada vektor ekspresi (pcambia 1303) dapat dimanfaatkan untuk menanggulangi busuk akar pada tanaman kelapa sawit yang disebabkan oleh Ganoderma spp. Sehingga dengan orientasi konstruksi gen ini, gen-gen yang akan disisipkan diharapkan dapat diekspresikan secara terus-menerus sepanjang hidup tanaman kelapa sawit terutama pada bagian perakaran. Saran DNA rekombinan yang telah berhasil ditransformasikan ke dalam sel Agrobacterium tumefaciens strain AGLO sebaiknya dilanjutkan dengan mengintegrasikan ke dalam sel tanaman. Selanjutnya, untuk mengetahui efektivitas gen kitinase pada Ganoderma sebaiknya dilakukan bioassay ditingkat E. coli. DAFTAR PUSTAKA Chaidamsari Biotechnology for cocoa pod borer resistance in cocoa [disertasi]. Netherlands: Plant Research International, Wageningen University. Claveri JM, Notredame C Bioinformatics for Dummies. Ed ke- 2. New York: Wiley Publishing. Datta K, Nicola ZK, Baisakh N, Oliva N, Datta K Agrobacterium mediated engineering for sheath blight resistance of indica rice cultivars from different ecosystems. Theor Appl Genet 100: Gambar 17 Orientasi konstruksi gen chi dengan pcambia SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Konstruksi gen kitinase (chi) telah berhasil disisipkan ke dalam pcambia DNA rekombinan yang terkonstruksi dapat dibuktikan dengan isolasi plasmid. Restriksi DNA rekombinan dengan enzim NcoI dan SpeI menghasilkan 2 pita, yaitu pita dengan ukuran bp yang merupakan ukuran dari pcambia 1303 dan pita dengan ukuran 1500 bp yang merupakan ukuran dari gen chi. Transformasi DNA rekombinan ke dalam Agrobacterium tumefaciens telah berhasil dilakukan dengan menggunakan sel kompeten kimia strain AGLO dengan prinsip kejut panas (heat shock) yang dapat dilihat keberhasilannya dari hasil restriksi dengan enzim NcoI dan SpeI. Doyle K Promega Protocol and Application Guide. Tird Edition. USA: Promega Corporation. hlm Endress R Plant Cell Biotechnology. Berlin: Spriner-Verlag. Jach G et al Enhanced quantitative resistance against fungal disease by combinatorial expression on different barley anti fungal proteins in transgenic tobacco. The Plant J 8: Jusuf M Genetika I Struktur dan Ekspresi Gen. Jakarta: Infomedika. Kendrew SJ, Lawrence E The Encyclopedia of Molecular Biology. Cambridge: Blackwell Science. Lin W, Anuartha CS, Datta K, Potrykus L, Muthukrishnan Genetic engineering of rice for resistace to sheath blight. Biotechnology 13:

27 16 Lorito M et al Synergistic interaction between cell wall degrading enzymes and membrane affecting compound. Mol. Plant-Microbe Interact 9: Lubis Kelapa Sawit di Indonesia. Sumatera Utara: Marihat. Muladno Teknologi Rekayasa Genetik. Edisi ke-1. Bogor: Pustaka Wirausaha Mura. Nasution H Konstruksi plasmid rekombinan untuk menghasilkan padi tahan hama penggerek batang (steam borer) [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Nurhaimi Ekspresi gen-gen responsive terhadap Corynespora cassiicola pada tanaman karet (Hevea brasiliensis Muell. Arg.) [disertasi]. Bogor: Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. [Promega] pgem-t and pgem-t Easy Vector System (Technical Manual No. 042). Wisconsin: Promega Corporation. Reece RJ Analyses of Genes and Genomes. England: John Willey & Sons. Ren Y, CA West Elicitation of diterpene biosyntesis in rice (Oryza sativa L.) by chitin. Plant Physiol 99: Saiki RK et al The Design and Optimization of the PCR. Di dalam: Erlich HA, editor. PCR Technology Principles and Applications for DNA Amplification. New York: M Stockton Press. Sain SL, Oduro KK, Furtek DB Genetic tranformation of cocoa leaf cells using Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 37: Sambrook J, Russel DW Molecular Cloning a Laboratory Manual. Third Edition. New York: Cold Spring Harbor Laboratory. Santoso D, Chaidamsari T, Budiani A, Minarsih H, Siswanto Over ekspresi gen kitinase dengan enhancher sintesis kaya GC pada tanaman tembakau (Nicotiana tabacum L.) [Laporan Penelitian]. Bogor: Unit Penelitian Bioteknologi Perkebunan. Schirmbock et al Parallel formation and synergism of hydrolytic enzymes and peptabiol antibiotics: molecular mechanism involved in the antagonistic action of Trichoderma harzianum against phytopathogenic fungi. Appl Environ Microbiol 60: Sheng J, Citovsky Agrobacterium plant cell DNA transport have virulance protein will trave. The Plant Cell 8: Singh G Ganoderma the scourge of oil palm in the coastal areas. Planter 67: Tabei Y et al Transgenic cucumber plants harbouring a rice chitinase gene exhibit enhanced resistance to gray mold (Botrytis cinerea). Plant Cell Rep 17: Terekawa N, Takaya N, Horiuchi H, Koike M A fungal chitinase gene from Rhizopus oligosporus confers antifungal activity to transgenic tobacco. Plant Cell Rep 16: Turner PC, Mclennan AG, Bates AD, White MRH Instant Notes in Molecular Biology. Singapore: Springer- Verlag. Tzfira T, Citovsky V The Agrobacterium plant cell interaction. taking biology lessons from a bug. Plant Physiol 133: Widyasari, Suhandono Konstruksi vektor biner untuk ekspresi gen dip 22 (diisolasi dari tebu varietas M ) pada tanaman. Berk Penel Hayati 13:

28 LAMPIRAN 17

29 18 Lampiran 1 Tahapan penelitian Tahap 1 NCBI Disain primer berdasarkan informasi yang didapatkan dari NCBI Amplifikasi menggunakan primer spesifik. Tahapan yang dikerjakan Pemurnian produk PCR Cloning pada pgemt-easy Sekuensing Tahap 2 Strategi konstruksi gen Isolasi DNA plasmid Restriksi gen kitinase dan pcambia 1303 dengan enzim SpeI dan NcoI Ligasi potongan fragmen gen kitinase dengan pcambia 1303 Transformasi hasil ligasi kitinase ke Escherichia coli (XL1-Blue) Konfirmasi koloni transforman dengan enzim SpeI dan NcoI Heat Shock Transformation Escherichia coli ke Agrobacterium tumefaciens

30 19 Lampiran 2 Prosedur elektroforesis gel agarosa (Sambrook et al 1989) 0.3 gram agarosa ditimbang dan dilarutkan dalam 30 ml buffer TBE 0.5X dengan bantuan oven microvave selama satu menit 110 o C Setelah larut, larutan dibiarkan pada suhu kamar sebentar hingga cukup hangat dan segera ditambahkan etidium bromida sebanyak 1.5 L dan dipindahkan ke dalam cetakan gel yang telah disusun bersama sisirnya. Gel ditunggu hingga memadat dan sisirnya diangkat. DNA dilarutkan dengan loading buffer dengan perbandingan 1:5 dan dimasukkan ke dalam sumur yang terbentuk pada gel. Gel diletakkan dalam bak elektroforesis yang telah diisi dengan buffer TBE 0.5X. Kemudian dihubungkan dengan adaptor dengan potensial listrik sebesar 100 volt. Setelah loading buffer berada ± 1 cm dari dasar gel, adaptor dimatikan dan gel diangkat. Gel diletakkan di bawah sinar UV untuk melihat ada tidaknya pita yang menunjukkan adanya DNA.

31 20 Lampiran 3 Komposisi larutan sediaan 1. Bufer TBE 0.5X (500 ml) Bufer TBE 5X dibuat dengan komposisi: Tris-Base 27 gram Asam borat gram EDTA 0.5 M ph ml dan ditepatkan dengan ddh 2 O hingga 500 ml. Saat pemakaian dalam pembuatan gel agarosa, bufer TBE 5X ini diencerkan menjadi 0.5X. 2. Media padat LA Media padat LA dibuat dengan komposisi: LB agar Low Salt 30 gr (1 L) Komposisi (g/l) Tripton 10 Yeast exctract 5 NaCl 5 Micro agar 10 dan ditepatkan dengan ddh 2 O sesuai dengan volume yang diinginkan. Kemudian di stirer dan ph disesuaikan hingga 7.2. Setelah tercampur rata, lalu larutan tersebut ditera dan di simpan di dalam autoklaf untuk sterilisasi.

32 21 Lampiran 3 Lanjutan 3. Media LB (Luria Bertani) Media LB dibuat dengan komposisi: Komposisi (per 1 liter) Tripton 10 Yeast exctract 5 NaCl 5 Kemudian dilarutkan dengan ddh 2 O sesuai dengan volume yang diinginkan. Selanjutnya diaduk dengan menggunakan stirer dan ph disesuaikan hingga 7.2 lalu disterilisasi menggunakan autoklaf. 4. Kit isolasi DNA plasmid Buffer suspensi : 50mM Tris-HCl dan 10mM EDTA ph = 8 (25 o C) RNAse : 2.5 mg (8 mg) Bubuk kering untuk menghancurkan dalam buffer suspensi. Lysis buffer : 25 ml (80 ml) 0.2 M NaOH dan 1% SDS Binding buffer : 25 ml (80 ml) 4 ml guanidine hydrocloride dan 0.5 M pottasium acetate ph 4.2 Wash buffer I : 33 ml ditambahkan dalam 20 ml etanol absolut 5M guanidin hydrocloride, 20 mm Tris-HCl, ph 0.6 (25 o C) Wash buffer II : 10mL, ditambahkan dalam 40 ml etanol absolute 20 Mm NaCl, 2M Tris-HCl ph 7.5 (25 o C) Elution buffer : 40 ml 10 mm Tris HCl ph 8.5 (25 o C).

33 22 Lampiran 4 Prosedur kerja transformasi plasmid ke dalam sel kompeten 1. Sebanyak 10 L DNA plasmid hasil ligasi dimasukkan ke dalam 200 L kompeten sel. Perlahan dicampurkan kemudian disimpan di es selama 30 menit. 2. Selama 50 detik tepat diberikan kejut panas (heat shock) 42 o C. Didinginkan segera di es selama 10 menit. 3. Kemudian ditambahkan 800 L medium LB + glukosa 20 mm tanpa antibiotik. Campuran diinkubasi pada suhu 37 o C sambil digoyang selama 90 menit L suspensi sel transforman ditransfer (1/10) pada medium LA + antibiotik di cawan petri dan diratakan. Sisanya disentrifus 3000 rpm 5 menit, supernatan dibuang dan disisakan sedikit, dilarutkan lalu diratakan pada medium (9/10). 5. Medium kemudian diinkubasi pada 37 o C selama semalam hingga terbentuk koloni putih biru. Koloni putih dicek dengan PCR DNA koloni atau dikultur cair untuk diisolasi plasmidnya dan diurutkan.

34 Lampiran 5 Elektroforegraf urutan basa gen kitinase 23

35 24 Lampiran 6 Hasil analisis BLASTX fragmen gen kitinase Sequences producing significant alignments: Score EValue (Bits) dbj BAD kda chitinase [Hypocrea jecorina] >tpg DAA e-89 gb ACD endochitinase 42 [Trichoderma longibrachiatum] 322 1e-86 gb ACD endochitinase 42 [Trichoderma longibrachiatum] 322 1e-86 gb ACD endochitinase 42 [Trichoderma longibrachiatum] 322 1e-86 gb ACD endochitinase 42 [Trichoderma sp. PPRC J11] 322 1e-86 gb ACD endochitinase 42 [Trichoderma longibrachiatum] 322 1e-86 gb ACD endochitinase 42 [Trichoderma longibrachiatum] 322 1e-86 gb ACD endochitinase 42 [Trichoderma longibrachiatum] 322 1e-86 gb ACD endochitinase 42 [Trichoderma longibrachiatum] 322 1e-86 gb ACD endochitinase 42 [Trichoderma longibrachiatum] 322 1e-86 gb ACD endochitinase 42 [Trichoderma longibrachiatum] 322 1e-86 gb ACD endochitinase 42 [Trichoderma longibrachiatum] 322 1e-86 gb ACD endochitinase 42 [Hypocrea orientalis] 320 4e-86 gb ACD endochitinase 42 [Hypocrea orientalis] 320 4e-86 gb ACD endochitinase 42 [Hypocrea orientalis] 320 4e-86 gb ACD endochitinase 42 [Hypocrea orientalis] 320 4e-86 gb ACD endochitinase 42 [Hypocrea orientalis] 320 4e-86 gb ACD endochitinase 42 [Hypocrea orientalis] 320 4e-86 gb ACD endochitinase 42 [Hypocrea orientalis] 320 4e-86 gb ACD endochitinase 42 [Hypocrea orientalis] 320 4e-86 gb ACD endochitinase 42 [Hypocrea orientalis] 319 5e-86