BAHAN DAN METODE. Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Juli 2007 sampai bulan Juni 2008 di

Transkripsi

1 BAHAN DAN METODE : Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Juli 2007 sampai bulan Juni 2008 di 1. Laboratorium Bioteknologi Hewan dan Biomedis PPSHB IPB 2. Laboratorium Mikrobiologi Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetika Pertanian Bogor. Alat dan Bahan Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini adalah autoklaf (ISO LAB, Germany), inkubator bergoyang (GFL 3031, Germany), laminar air flow (Esco, Singapore), sentrifuge (Mikro 22R Hettich, Germany dan Himac Centrifuge CR2092 Hitachi, Japan), inkubator (Memert, Germany), analytical balance (Precisa XR 305A, Switzerland), microwave oven (National NN-5557WF, Indonesia), elektroforesis sistem (Mupid, Japan), Chemi-Doc EQ (Biorad, USA), UV-Vis spektrofotometer (SmartSpeck Biorad, USA), UV-Vis spektrofotometer (Hitachi, Japan), slow speed rotomix (Thermolyne, USA) dan pipet mikro (Gilson, France). Isolat bakteri S. costaricanus 45I-3 yang digunakan berasal dari Kalimantan koleksi Dr. Ir. Yulin Lestari, Bagian Mikrobiologi Departemen Biologi IPB, E. coli DH5 yang digunakan merupakan koleksi Laboratoium BIORIN PPSHB IPB, dan plasmid yang digunakan sebagai vektor adalah pbluescript II KS(+) (Stratagene, USA) koleksi dari Laboratorium Mikrobiologi Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetika Pertanian Bogor. Semua bahan kimia yang digunakan berspesifikasi pro-analisis (p.a.) kecuali jika disebut khusus.

2 Metode Penelitian Media Tumbuh Isolat S. costaricanus 45I-3 secara rutin ditumbuhkan pada media agaragar xilan dengan komposisi (%) : 1,0 ekstrak khamir; 10,3 sukrosa; 0,5 xilan birchwood (Sigma); 15,0 agar-agar. Untuk tujuan isolasi DNA, S. costaricanus 45I-3 dikultur pada media YM (komposisi (%) : 0,4 ekstrak khamir; 1,0 ekstrak malt; 1,5 glukosa; atau media YEME (komposisi (%) : 0,3 ekstrak khamir; 0,3 ekstrak malt; 1 glukosa; 0,3 peptone; 34 sukrosa; 0,0515 MgCl 2 ; 0,5 glycine) lalu diinkubasi dan diagitasi pada inkubator bergoyang pada kecepatan 130 rpm pada suhu ruang selama 5 hari. E. coli DH5 ditumbuhkan pada media Luria Betani (LB) pada suhu 37 o C selama jam dengan penambahan antibiotika ampisilin (150 g/ml) jika diperlukan. Isolasi DNA Genom S. costaricanus 45I-3 Untuk isolasi DNA genom digunakan lisozim dan SDS 10% dan CTAB sebagai pelisis sel serta fenol kloroform untuk pemurniannya (Tripathi dan Rawal, 1998). Sebanyak 50 ml biakan S. costaricanus 45I-3 disentrifugasi pada kecepatan 8000 rpm pada 4 o C selama 10 menit, supernatannya dibuang dan pelet yang terbentuk dicuci dengan bufer STE (komposisi: 0,3M sukrosa; 25,0mM Tris-HCl; 25,0mM EDTA.2Na ph 8), kemudian disentrifugasi pada kecepatan 8000 rpm 4 o C selama 10 menit. Supernatannya dibuang dan terhadap pelet yang diperoleh ditambahkan 8,55 ml bufer STE dan 950 l lisozim ( 20 mg/ml dalam bufer STE), dibolak-balik secara halus lalu diinkubasi pada 30 o C selama menit hingga terbentuk protoplas. Sebanyak 500 l SDS 10% dan 50 l proteinase-k (20mg/ml) ditambahkan pada campuran tersebut dan diinkubasi pada suhu 37 o C selama 60 menit. Setelah itu ke dalam campuran ditambahkan 1,8 ml 5M NaCl dan dibolak-balik secara halus, dan ditambahkan 1,5 ml 10% CTAB dalam larutan 0,7M NaCl lalu diinkubasi pada suhu 65 o C selama 20 menit. Kemudian ke dalam larutan ditambahkan 1 kali volume fenol:kloroform (25:24) dan disentrifugasi dengan kecepatan rpm pada 16 o C selama 10 menit. Fase bening dipindahkan ke tabung baru dan ditambahkan 0,6 kali volume isopropanol,

3 inkubasikan pada suhu -20 o C selama 30 menit. DNA yang terbentuk diangkat dengan menggunakan ujung pipet lalu DNA dikeringkan hingga berwarna transparan dan dilarutkan dengan 50 l ddh 2 O steril. Larutan DNA disimpan pada suhu 4 o C atau -20 o C untuk pemakaian dalam jangka panjang. Isolasi pbluescript II KS (+) dari E. coli E. coli (pbluescript II KS(+)) ditumbuhkan pada media LB yang mengandung 150 g/ml ampisilin lalu diinkubasi dan diagitasi pada inkubator bergoyang dengan kecepatan 180 rpm pada suhu 37 o C selama jam. Sebanyak 1500 l biakan E. coli dipindahkan ke tabung mikro lalu disentrifugasi dengan kecepatan 8000 rpm selama 5 menit. Supernatannya dibuang dan pelet sel diresuspensi dalam 150 l larutan A (50mM glukosa, 25mM tris HCl ph 8, 10mM EDTA ph 8) dingin selama 10 menit. Setelah itu sebanyak 200 l larutan B (0,2N NaOH, 1% w/v SDS) ditambahkan dan dibolak-balik secara halus lalu ditambahkan 150 l larutan C (5M Na-asetat, 11,5% asam asetat glasial) dan dibiarkan selama 5 menit. Larutan kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 8000 rpm selama 5 menit lalu supernatan dipindahkan ke tabung mikro yang baru dan ditambahkan 500 l fenol:kloroform (25:24) dan divortek selama 1 menit. Campuran kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 8000 rpm selama 5 menit dan fase cair pada bagian atas dipindahkan ke tabung mikro yang baru. Sebanyak 2 kali volum isopropanol ditambahkan ke fase cair yang diperoleh lalu dibolakbalik secara halus dan diinkubasi pada suhu -20 o C selama 30 menit dan disentrifugasi dengan kecepatan 8000 rpm selama 5 menit. Supernatan dibuang dan terhadap pelet yang diperoleh ditambahkan 300 l 70% etanol dan disentrifugasi dengan kecepatan 8000 rpm selama 5 menit. Supernatan dibuang dan pelet dikeringkan hingga berwarna transparan dan dilarutkan dalam 50 l ddh 2 O steril. Larutan DNA disimpan pada suhu 4 o C atau -20 o C untuk pemakaian dalam jangka panjang.

4 Pembuatan Pustaka Genom DNA genom hasil isolasi dipotong secara parsial menggunakan enzim Sau3A1 (Sigma, Germany). Ke dalam tabung mikro secara berurutan ditambahkan 39 l ddh 2 O, 5 l bufer 10X, 5 l DNA, dan 1 l enzim Sau3A1. Larutan ini diinkubasi pada suhu 37 o C selama 5 menit. Reaksi dihentikan dengan menambahkan blue juice atau diinkubasi pada suhu 65 o C selama 5 menit. DNA hasil pemotongan dielektroforesis dengan menggunakan 0,8% agarosa dalam 1X TAE bufer. Fragmen DNA berukuran 4 10 kb dipotong dari gel dan dipindahkan ke tabung mikro. Selanjutnya DNA diisolasi kembali dengan menggunakan glass bead (Geneclean BIO101, USA). Sebanyak 3 kali volume 6M NaI ditambahkan ke potongan gel yang diperoleh, lalu tabung dibolak-balikkan sambil diinkubasi pada suhu 55 o C hingga seluruh gel larut. Ke dalam larutan tersebut ditambahkan 7 l suspensi glass bead dan diinkubasi pada suhu ruang sambil dibolak-balik, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 8000 rpm selama 30 detik, supernatannya dibuang dan endapannya diresuspensikan dalam 500 l larutan pencuci (larutan stok terdiri atas 20mM Tris-HCl ph 7.4, 1mM EDTA, 100mM NaCl; ketika akan digunakan 14 ml larutan stok pencuci dilarutkan dalam 140 ml dh 2 O steril dan 155 ml etanol absolut), pencucian pelet diulang sebanyak 3 kali. Tabung kembali disentrifugasi dengan kecepatan 8000 rpm selama 30 detik untuk mendapatkan endapan. Kemudian endapan dilarutkan dalam 20 l ddh 2 O steril dan diinkubasi pada suhu o C selama 30 menit. Setelah itu tabung disentrifugasi dengan kecepatan 8000 rpm selama 3 menit, supernatan yang berisi DNA dipindahkan ke tabung baru dan disimpan pada suhu 4 o C untuk penggunaan selanjutnya. Vektor pbluescript II KS (+) dipotong dengan enzim BamHI. Ke dalam tabung mikro secara berurutan ditambahkan 43 l ddh 2 O, 5 l bufer 10X, 1 l vektor, dan 1 l BamH1 lalu diinkubasi pada suhu 37 o C selama satu malam. Reaksi dihentikan dengan penambahan blue juice atau diinkubasi pada suhu 65 o C selama 10 menit.

5 Ligasi. Sebanyak 3 l ddh 2 O, 3 l (60 ng) fragmen DNA, 1 l (50 ng) vektor pbluescript II KS (+) yang telah dipotong dengan BamH1, dan 2 l bufer ligasi 5X dicampur dalam 0,5 ml tabung mikro lalu dipanaskan pada suhu 45 o C selama 5 menit. Sebanyak 1 l T4 DNA ligase (invitrogen) ditambahkan dan kemudian diinkubasikan pada suhu 16 o C selama jam. Pembuatan Bakteri Kompeten. E. coli DH5 dikulturkan dalam 20 ml media LB cair pada suhu 37 o C selama jam. Setelah itu sebanyak 0,5 ml biakan tersebut disubkultur pada 25 ml media LB cair lalu diinkubasi dan diagitasi menggunakan inkubator bergoyang dengan kecepatan 130 rpm pada suhu 37 o C sampai diperoleh kerapatan optik mendekati 0,4 pada panjang gelombang 600nm (kerapatan sel ~10 8 cfu/ml). Selanjutnya kultur bakteri diinkubasi di atas es selama 10 menit dan dipindahkan sebanyak 1500 l kedalam tabung mikro dan disentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm pada suhu 4 o C selama 10 menit. Filtrat dibuang dan pelet dikeringkan dengan membalikkan tabung di atas kertas tisu hingga semua media cair keluar. Pelet yang diperoleh diresuspensikan dalam 1 ml 0,1M CaCl 2 dingin dan dibiarkan di dalam es selama 10 menit. Setelah itu campuran disentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm pada suhu 4 o C selama 10 menit. Filtrat dibuang dan pelet dikeringkan dengan membalikkan tabung di atas kertas tisu hingga semua media cair keluar. Pelet yang diperoleh kemudian diresuspensikan dalam 100 l 0,1M CaCl 2 dingin dan selanjutnya disimpan di dalam es selama 10 menit sehingga didapatkan bakteri yang kompeten (Sambrook dan Russell 2001). Proses Transformasi. Sebanyak ng plasmid rekombinan (volumenya kurang dari 10 l) dicampurkan dengan 100 l bakteri kompeten dan diinkubasikan dalam es selama menit. Selanjutnya terhadap campuran tersebut dilakukan heat shock pada suhu 42 o C selama 90 detik dan kemudian segera diinkubasi ke dalam es selama 1-2 menit. Sebanyak 400 l media LB cair ditambahkan ke dalam bakteri trans-forman lalu diinkubasikan dengan agitasi pada suhu 37 o C selama 45 menit pada inkubator bergoyang dengan kecepatan 200 rpm untuk memulihkan kondisi sel bakteri.

6 Seleksi transforman. Untuk menyeleksi keberhasilan proses transformasi ke media agar-agar LB ditambahkan 0,1 M IPTG (0,5 l / ml) dan 2% X-Gal (40 g / ml). Bakteri transforman disebar di atas media agar-agar LB dan diinkubasi selama jam pada suhu 37 o C. Kontrol positif dibuat dengan menyebar bakteri transforman pada media agar-agar LB yang diberi suplemen antibiotik ampisilin sedangkan kontrol pertumbuhan bakteri transforman pada media agaragar LB dibuat dengan menyebar bakteri pada media agar-agar LB tanpa antibiotik. Seleksi Klon Xilanase Dengan menggunakan tusuk gigi steril seluruh koloni berwarna putih dipindahkan ke media agar-agar LB yang mengandung ampisilin dan X-gal. Untuk mengujikan aktivitas xilanase koloni digoreskan ke atas media agar-agar LB yang mengandung ampisilin dan ditambahkan 0,5% (w/v) xilan birchwood (Sigma Co., USA) lalu diinkubasi selama jam pada suhu 37 o C dilanjutkan dengan inkubasi pada suhu 50 o C selama 2 jam. Larutan 1% congo red disebar di atas permukaan media dan dibiarkan selama 15 menit, kemudian ditambahkan larutan 1M NaCl dan dibiarkan selama 15 menit. Klon yang memiliki aktivitas xilanase akan membentuk zona jernih (Teather dan Wood, 1982). Pendeteksian Aktivitas -Xilosidase. Aktivitas -xilosidase diamati melalui kemampuan klon menghidrolisis senyawa 4-metilumberilferil--D-xilosida (Sigma). Klon yang ditumbuhkan pada media agar-agar LB yang mengandung ampisilin dan 0,5% xilan birchwood diinkubasi pada suhu 37 o C selama jam lalu ditetesi dengan 0,1 mm 4-metilumberilferil--D-xilosida dalam bufer sitrat-fosfat ph 5 dan diinkubasi pada suhu 50 o C selama 2 jam. Reaksi dihentikan dengan penambahan CaCO 3 jenuh beberapa tetes. Klon yang positif akan berpendar jika diamati di bawah sinar UV pada 340 nm (Kaneko et al. 2000).

7 Verifikasi DNA Plasmid Rekombinan Verifikasi DNA plasmid rekombinan yang membawa sisipan gen penyandi xilanase dilakukan dengan memotong plasmid rekombinan menggunakan enzim EcoR1. Sebanyak 15 l ddh 2 O, 2 l bufer 10X, 2 l plasmid, dan 1 l enzim dicampurkan ke dalam tabung mikro lalu diinkubasi pada suhu 37 o C selama satu malam. Reaksi dihentikan dengan penambahan blue juice atau diinkubasi pada suhu 65 o C selama 10 menit. Ekspresi Gen Penyandi Xilanase di E. coli DH5 Pengujian ekspresi gen penyandi xilanase dilakukan dengan menumbuhkan klon pada media LB cair yang mengandung xilan birchwood 0,5%, dan diinkubasi selama jam di inkubator bergoyang dengan kecepatan 150 rpm pada suhu 37 o C. Biakan disentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm selama 10 menit, filtrat yang diperoleh dipisahkan untuk dilakukan pengujian aktivitas xilanasenya. Sebagai kontrol positif digunakan pengujian aktivitas xilanase dari S. costaricanus 45I-3. Bakteri ini ditumbuhkan pada media xilan cair dengan komposisi (%) : 1,0 ekstrak khamir; 10,3 sukrosa; 0,5 xilan birchwood, lalu diinkubasi dengan agitasi ada 120 rpm selama 5 hari. Setelah itu biakan disentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm selama 10 menit, filtrat yang diperoleh dipisahkan untuk dilakukan pengujian aktivitas xilanasenya. Sebagai kontrol negatif digunakan pengujian aktivitas xilanase dari E. coli DH5. Bakteri ini ditumbuhkan pada media LB cair yang mengandung xilan birchwood 0,5%, dan diinkubasi selama jam di inkubator bergoyang dengan kecepatan 150 rpm pada suhu 37 o C. Biakan disentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm selama 10 menit, filtrat yang diperoleh dipisahkan untuk dilakukan pengujian aktivitas xilanasenya. Pengujian Aktivitas Xilanase Rekombinan. Blanko : Sebanyak 500 l substrat 0,5% birchwood xilan ditambahkan 500 l 0,02M bufer sitrat fosfat ph 5. Kemudian larutan ini ditambahkan 1000 l pereaksi DNS lalu dihomogenisasi dan dipanaskan pada suhu 100 o C selama 15 menit dan didinginkan pada suhu ruang.

8 Kontrol : Sebanyak 500 l substrat 0,5% xilan birchwood ditambahkan 450 l 0,02M bufer sitrat fosfat ph 5 lalu diinkubasi pada suhu 50 o C selama 30 menit. Kemudian larutan ini ditambahkan 1000 l pereaksi DNS dan 50 l ekstrak kasar xilanase dihomogenisasi dan segera dipanaskan pada suhu 100 o C selama 15 menit dan didinginkan pada suhu ruang. Sampel : Sebanyak 500 l substrat 0,5% xilan birchwood ditambahkan 450 l 0,02M bufer sitrat fosfat ph 5. Kemudian larutan ini ditambahkan 50 l ekstrak kasar xilanase dihomogenisasi lalu diinkubasi pada suhu 50 o C selama 30 menit lalu ditambahkan 1000 l pereaksi DNS dan segera dipanaskan pada 100 o C selama 15 menit dan didinginkan pada suhu ruang. Pengukuran absorbansi masing-masing larutan dilakukan pada 540 nm (Miller 1959). Konsentrasi gula pereduksi diperoleh dengan menggunakan kurva standar xilosa pada konsentrasi 0,00-0,35 mg/ml. Satu unit aktivitas xilanase didefinisikan sebagai jumlah mol xilosa yang dihasilkan permenit untuk setiap ml enzim pada kondisi optimumnya. Pengujian Aktivitas Spesifik Xilanase Rekombinan. Untuk mengetahui jenis xilanase yang ada dilakukan pengujian aktivitas dengan substrat spesifik menurut metode Saha (2001) menggunakan senyawa turunan p-nitrofenil masing-masing : p-nitrofenil--d-xilanopiranosida untuk -xylosidase p-nitrofenil--l-arabinofuranosida untuk -L-arabinofuranosidase p-nitrofenil--d-galaktopiranosida untuk -D-galaktopiranosidase p-nitrofenil--d-glukoropiranosida untuk -D-glukoropiranosidase p-nitrofenil-asetat untuk asetil xilan esterase

9 Sebanyak 450 l substrat turunan p-nitrofenil dengan konsentrasi 1 mm dan 400 l 0,02M bufer sitrat fosfat ph 5 diinkubasi bersama 100 l ekstrak kasar xilanase pada suhu 50 o C selama 30 menit. Reaksi dihentikan dengan penambahan 50 l 0,4M Na 2 CO 3. Pengukuran absorbansi dilakukan pada 405 nm. Kadar p-nitrofenol yang terbentuk diperoleh dengan menggunakan kurva standar p-nitrofenol dengan konsentrasi 0,00-0,50mM. Sebanyak 950 l masingmasing konsentrasi p-nitrofenol diinkubasi pada suhu 50 o C selama 30 menit kemudian ditambahkan 50 l 0,4 M Na 2 CO 3. Aktivitas xilanase diperoleh dengan menghitung jumlah p-nitrofenol yang terbentuk dengan menggunakan kurva standar yang diperoleh. Satu unit aktivitas enzim xilanase didefinisikan sebagai jumlah enzim yang menyebabkan perubahan 1 mol berbagai substrat turunan p-nitrofenil menjadi p-nitrofenol permenit pada keadaan optimumnya.