REKAYASA GENETIKA ( VEKTOR PLASMID )

Transkripsi

1 MAKALAH REKAYASA GENETIKA ( VEKTOR PLASMID ) Disusun oleh: NAMA : LASINRANG ADITIA NIM : KELAS : BIOLOGI A TUGAS : REKAYASA GENETIKA JURUSAN BIOLOGI FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI UNIVERSITAS ISLAM NEGERI ALAUDDIN MAKASSAR 2014

2 KATA PENGANTAR Puji syukur kita panjatkan kehadirat Allah SWT yang telah memberikan kita hidayah dan rahmat-nya agar senantiasa dekat dengan diri-nya dalam keadaan sehat wal afiat. Serta salam dan shalawat kita kirimkan kepada Muhammad SAW, dimana nabi yang membawa ummat-nya dari zaman kegelapan menuju zaman yang terang benderang dan telah menjadi suri tauladan bagi ummat-nya. Dalam makalah ini penulis akan membahas masalah mengenai Vektor Plasmid karena sebagai seorang mahasiswa saintist maka kita perlu mengetahui hal ini. Penulis sangat mengharapkan agar pembaca dapat menambah wawasan dan ilmu pengetahuan-nya tentang VEKTOR PLASMID. Saran dan kritik yang membangun tetap kami nantikan demi kesempurnaan makalah ini. Akhir kata tiada gading yang tak retak, begitu juga dengan manusia sendiri. Samata-Gowa, 12 Desember 2014 Lasinrang Aditia

3 DAFTAR ISI KATA PENGANTAR... DAFTAR ISI... BAB I PENDAHULUAN A. Latar Belakang... B. Rumusan Masalah... C. Manfaat Penulisan... BAB II PEMBAHASAN A. Pengertian plasmid sebagai vektor dalam rekayasa genetika... B. Kegunaan plasmid... C. Proses penggunaan plasmid di dalam rekayasa genetika... D. Enzim restriksi sebagai pemotong plasmid... E. Enzim Ligase sebagai penyembung plasmid dengan DNA asing... F. Pemotongan dan penyambungan plasmid dan DNA asing sehingga dihasilkan Plasmid Rekombinan... G. Plasmid Ti... BAB III PENUTUP A. Kesimpulan... B. Saran... DAFTAR PUSTAKA...

4 BAB I PENDAHULUAN A. Latar Belakang Setelah diketahui bahwa molekul DNA merupakan materi genetik yang menentukan sifat suatu organisme, dan sel bakteri dapat menerima DNA asing secara spontan, beberapa peneliti segera melakukan penelitian untuk melakukan manipulasi terhadap sifat-sifat genetik dari beberapa jenis sel. Berbagai penelitian telah dilakukan untuk memasukkan DNA asing kedalam sel bakteri, sel jamur, sel tanaman dan sel hewan. Namun demikian, pada tahap pertama manipulasi tersebut banyak yang mengalami kegagalan. Hal ini disebabkan karena hanya sedikit spesies bakteri yang dapat menerima DNA secara spontan. Sebagian besar spesies bakteri, sel hewan dan sel tanaman tidak dapat menerima DNA asing secara spontan. Selain itu DNA asing yang telah berhasil masuk ke dalam sel hanya mampu bertahan apabila dapat bereplikasi secara otonom, atau dapat terintegrasi kedalam kromosom hospesnya. Umumnya DNA asing yang masuk kedalam DNA kromosom akan segera didegradasi oleh enzim nuklease yang terdapat pada sel hospes. Modifikasi genetik suatu organisme baru bisa dilakukan sejalan dengan penemuan dan pengembangan berbagai teknik dalam biologi molekuler. Antara lain teknik isolasi dan pemurnian DNA, penemuan enzim restriksi endonuklease, enzim DNA polimerase dan DNA ligase, penemuan DNA plasmid dan teknik transfer DNA, teknik deteksi DNA, teknik pemetaan gen, dan teknik kultivasi. B. Rumusan Masalah 1. Menjelaskan pengertian plasmid sebagai vektor dalam rekayasa genetika? 2. Menjelaskan Kegunaan plasmid? 3. Menjelaskan proses penggunaan plasmid di dalam rekayasa genetika? 4. Menjelaskan enzim restriksi sebagai pemotong plasmid? 5. Menjelaskan enzim Ligase sebagai penyembung plasmid dengan DNA asing

5 6. Menjelaskan proses pemotongan dan penyambungan plasmid dan DNA asing sehingga dihasilkan Plasmid Rekombinan? 7. Menjelaskan tentang plasmid Ti? C. Manfaat Adapun manfaat dari makalah ini adalah dapat memberikan pengetahuan tentan vektor plasmid untuk kepentingan dunia ilmu rekayasa genetika.

6 BAB II PEMBAHASAN A. Pengertian Plasmid Sebagai Vektor dalam Rekayasa Genetika Vektor merupakan molekul DNA yang membawa suatu DNA asing kedalam sel inang, dengan harapan sifat yang ada pada DNA asing tersebut dapat terekspresi dalam sel inang. Salah satu vektor yang bisa digunakan untuk membawa molekul DNA asing masuk dalam sel inang adalah plasmid. Plasmid digunakan untuk melakukan rekayasa pada berbagai organisme yang tidak bisa diperoleh secara alami. Rekayasa ini dilakukan pada tingkat genetik sehingga disebut sebagai rekayasa genetika. Plasmid adalah molekul DNA sirkuler (lingkaran tertutup) yang berantai ganda dan dapat bereplikasi sendiri di luar kromosom dan tidak mengandung gen-gen esensial. Plasmid terdapat secara alami maupun sudah mengalami modifikasi yang disesuaikan dengan keperluan manipulasi genetik. Plasmid terdapat pada organisme prokariot maupun eukariot. Plasmid inilah yang berfungsi sebagai pembawa sifat rekombinan pada organisme yang akan direkayasa. Plasmid memilki ciri-ciri antara lain : a. Berbentuk lingkaran tertutup dan untaiannya ganda (double stranded) b. Dapat melakukan replikasi sendiri di luar kromosom inti c. Terdapat di luar kromosom d. Secara genetik dapat ditransfer secara stabil Agar dapat digunakan sebagai vektor, plasmid harus memiliki syaratsyarat diantaranya sebagai berikut : 1. Ukurannya relatif kecil dibanding dengan pori dinding sel inangnya 2. Mempunyai sekurang-kurangnya 2 gen marker yang dapat menandai masuk tidaknya plasmid ke dalam sel inang 3. Mempunyai tempat pengenalan restriksi sekurang-kurangnya di dalam salah satu marker yang dapat digunakan sebagai tempat penyisipan fragmen DNA asing

7 4. Memiliki titik awal replikasi sehingga dapat melakukan replikasi dalam sel inang Menurut tujuan penggunaannya, plasmid dibedakan menjadi 2 yaitu : 1. Plasmid untuk kloning prokariot, sebagai contoh adalah plasmid puc 19 dan pbr Plasmid yang digunakan untuk kloning eukariot yang digunakan adalah plasmid Ti Gambar plasmid pbr 322 dengan tempat pengenalan pemotongan DNAnya dapat dilihat pada gambar 1. Gambar 1. Plasmid pbr 322 Gambar plasmid puc 19 dan tempat pengenalan pemotongan DNAnya dapat dilihat pada gambar 2. Gambar 2. Plasmid puc 19

8 B. Kegunaan Plasmid Plasmid digunakan sebagai vektor dalam rekayasa genetika. Dalam hal ini plasmid digunakan untuk membawa suatu rangkaian fragmen DNA asing masuk dalam sel inang dengan harapan plasmid rekombinan itu mengalami replikasi dan mengekspresikan sifat baru pada DNA asing tersebut, sehingga sifat yang diinginkan dapat diperoleh dari plasmid rekombinan tersebut. C. Proses penggunaan plasmid di dalam rekayasa genetika Penggunaan plasmid untuk rekayasa genetika harus disesuaikan kebutuhannya sebab ada berbagai macam plasmid yang digunakan. Proses penggunaan plasmid dalam rekayasa genetika melalui langkah-langkah sebagai berikut : 1. Penentuan terlebih dahulu jenis plasmid yang hendak digunakan sebab ada beberapa jenis plasmid seperti pbr 322 dan puc19 yang bisa digunakan untuk prokariot dan plasmid Ti yang bisa digunakan untuk organisme eukariot 2. Bila plasmid telah ditentukan maka selanjutnya adalah menentukan tempat pengenalan enzim restriksi (pemotongan) yang hendak digunakan sebagai tempat penyisipan DNA asing dan marker untuk menandai masuk tidaknya plasmid pada sel inang 3. Apabila telah diketahui tempat pengenalan restriksi dan markernya maka langkah selanjutnya adalah menyiapkan enzim restriksi sebagai pemotong plasmid. Enzim yang digunakan untuk memotong plasmid harus sama dengan pemotong DNA asing sehingga nanti keduanya bisa bersatu misal : EcoR1 4. Langkah selanjutnya adalah plasmid dipotong dengan enzim restriksi yang sesuai pada daerah potongannya 5. Plasmid siap disambungkan dengan DNA asing yang memiliki sifat tertentu, yang telah dipotong juga dengan enzim restriksi yang sama dengan pemotong plasmid

9 D. Enzim restriksi sebagai pemotong plasmid Untuk memotong plasmid digunakan enzim restriksi. Enzim restriksi adalah enzim yang digunakan untuk memotong DNA secara spesifik. Enzim restriksi disebut sebagai gunting biologi. Enzim ini diisolasi dari bakteri. Restriksi yang digunakan untuk memotong plasmid harus sama dengan pemotong DNA asing agar urutan basanya bisa sesuai sehingga antara plasmid dan DNA asing yang disisipkan bisa bersatu. Prinsip kerja enzim restriksi adalah: 1. Enzim restriksi yang digunakan adalah enzim endonuklease restriksi. Enzim pemotong ini mengenali DNA pada situs kusus dan memotong pada situs tersebut 2. Situs pengenalan enzim restriksi adalah daerah yang simetri dengan poliandrom, artinya bila kedua utas DNA tersebut masing-masing dibaca dengan arah yang sama akan memberikan urutan yang sama pula nukleotidanya 3. Pemotongan enzim restriksi akan menghasilkan potongan yaitu ujung kohesif (sticky end) dan ujung rata (blunt end). Perbedaan antara hasil pemotongan yang berupa sticky end dan blunt end dapat dilihat pada tabel 1. berikut ini.

10 Berbagai contoh restriksi enzim yang mengenali pada situs pemotongan tertentu pada DNA dapat dilihat pada tabel 2. Proses pemotongan DNA digambarkan pada gambar 3. berikut ini: Gambar 3. Pemotongan enzim restriksi pada DNA E. Enzim Ligase sebagai penyembung plasmid dengan DNA asing Enzim ligase adalah enzim yang berfungsi untuk menyambung dua ujung potongan DNA. Enzim ligase yang sering digunakan adalah DNA ligase dari E. Coli dan DNA ligase dari Fage T4. Prinsip kerja enzim ligase sebagai berikut: 1. Enzim ligase menyambung dua ujung DNA yang semulanya terpotong 2. Penyambungan dilakukan dengan cara menyambung 2 ujung DNA melalui ikatan kovalen antara ujung 3 OH dari utas satu dengan ujung 5 P dari utas yang lain

11 3. Penggunaan ligasi DNA ini mengkatalis ikatan fosfodiester antara kedua ujung DNA sehingga kedua fragmen DNA yang berupa potongan bisa bersatu menjadi satu. Gambar struktur enzim ligase dapat dilihat pada gambar 4 berikut ini : Gambar 4. Struktur enzim ligase Proses penyambungan DNA ligasi pada daerah pemotongan digambarkan pada gambar 5. Gambar 5. Penyambungan DNA ligase pada potongan DNA

12 F. Pemotongan dan penyambungan plasmid dan DNA asing sehingga dihasilkan Plasmid Rekombinan Untuk menciptakan plasmid rekombinan yang mengandung sifat DNA asing tertentu yang dilakukan adalah dengan menyambung DNA asing tersebut dengan plasmid yang ada. Plasmid rekombinan terbentuk sebagai sambungan antara plasmid dengan DNA asing, sehingga plasmid tersebut mengandung sifat tertentu yang telah disesuaikan dengan kebutuhan. Secara sederhana prosedur untuk menciptakan plasmid rekombinan dapat dilakukan sebagai berikut: 1. Menyiapkan bakteri yang mengandung DNA asing dengan sifat tertentu 2. Menyiapkan plasmid yang akan digunakan sebagai vektor 3. Pemotongan DNA asing dengan sifat yang dibutuhkan dengan enzim restriksi semisal dari E. coli 4. Pemotongan plasmid yang akan digunakan sebagai vektor dengan enzim restriksi yang sama yaitu E. Coli 5. Hasil potongan DNA dengan sifat tertentu disambungkan pada plasmid dengan menggunakan enzim penyambung yaitu DNA ligase. DNA ligase akan mengikat ujung 3 OH dengan ujung 5 P dan membentuk ikatan fosfodiester sehingga plasmid dan DNA asing dengan sifat tertentu bisa bersatu 6. Terbentuklah plasmid rekombinan yang membawa DNA asing dengan sifat tertentu tersebut. Plasmid ini siap ditransfer ke dalam sel inang untuk memperoleh organisme transgenik Gambar proses terbentuknya Plasmid rekombinan sebagai hasil penyambungan plasmid dengan DNA asing dengan sifat tertentu dapat dilihat pada gambar 6 berikut ini.

13 Gambar 6. Penyambungan Plasmid dengan DNA asing G. Plasmid Ti Sel-sel tumbuhan tidak mengandung plasmid alami yang dapat digunakan sebagai vektor kloning, akan tetapi ada suatu bakteri yaitu Agrobacterium tumefaciens yang dapat membawa plasmid berukuran 200 kb dan disebut dengan plasmid Ti (Tumor inducing atau penyebab tumor). Bakteri Agrobacterium tumefaciens dapat menginfeksi tanaman dikotil seperti tomat dan tembakau serta tanaman monokotil khususnya padi. Ketika infeksi berlangsung bagian tertentu plasmid Ti yang disebut dengan T-DNA, akan terintegrasi ke dalam DNA kromosom tanaman menyebabkan pertumbuhan sel-sel yang tak terkendali, akibatnya akan terbentuk tumor. Plasmid Ti rekombinan dengan suatu gen target yang disisipkan pada daerah T-DNA dapat mengintegrasikan gen tersebut ke dalam DNA tanaman. Gen target ini selanjutnya akan diekspresikan dengan menggunakan sistem DNA tanaman. Dalam prakteknya ukuran plasmid yang begitu besar sangat sulit untuk dimanipulasi. Namun ternyata apabila bagian T-DNA dipisahkan

14 dari bagian-bagian lain plasmid Ti, integrasi DNA tanaman masih dapat terjadi asalkan T-DNA dan bagian lainnya tersebut masih berada dalam satu sel Agrobacterium tumefaciens. Dengan demikian, manipulasi atau penyisipan fragmen DNA asing hanya dilakukan pada T-DNA dengan cara seperti halnya yang dilakukan pada plasmid E. Coli. Selanjutnya plsmid T-DNA rekombinan yang dihasilkan ditransformasikan ke dalam sel Agrobacterium tumefaciens yang membawa plamid Ti tanpa bagian T-DNA. Perbaikan prosedur berikutnya adalah pembuangan gen-gen pembentuk tumor yang terdapat pada T-DNA. Gambar. Plasmid Ti Pemanfaatan plasmid Ti dalam rekombinan tumbuhan sudah banyak dimanfaatkan seperti plasmid Ti Agrobacterium tumefaciens yang digunakan untuk pembuatan tanaman kapas Bt yang tahan terhadap hama ulat. Ulat yang memakan tanaman akan mengalami kematian. Pemanfaatan plamid ini juga untuk meningkatkan produksi tanaman. Misalkan saja tanaman yang mengandung protein tertentu setelah direkayasa dengan menggunakan plasmid rekombinan ini. Sehingga pada saat makan tanaman ini sudah mengandung protein tertentu.

15 Gambar. Rekayasa tanaman dengan menggunakan Plasmid Ti Dari gambar di atas dapat dijelaskan bahwa penggunaan plasmid Ti dilakukan dengan cara menyambung plasmid dengan DNA asing. Pemotongan DNA dilakukan dengan menggunakan enzim restriksi kemudian masingmasing potongan dilekatkan dengan ligasi DNA terbentuklah plasmid rekombinan. Sebagai hasilnya plasmid rekombinan dimasukan dalam nukleus tanaman melalui fusi protoplasma dan plasmid rekombinan akan berfusi dengan inti tanaman. Protopalasma selanjutnya dikulturkan dalam media kultur jaringan kemudian setelah terbentuk tanaman, setelah itu tanaman ditumbuhkan pada habitatnya. Tanaman yang dihasilkan akan memiliki sifat tertentu sesuai dengan sifat DNA asing yang digunakan. Sehingga apabila kita memakan tanaman tersebut berarti telah mengkonsumsi protein tertentu. Sifat inilah yang mulai dikembangkan pada tanaman.

16 BAB III KESIMPULAN DAN SARAN A. Kesimpulan Dari uraian diatas kami dapat mengambil kesimpulan bahwa Vektor merupakan molekul DNA yang membawa suatu DNA asing kedalam sel inang, dengan harapan sifat yang ada pada DNA asing tersebut dapat terekspresi dalam sel inang. Salah satu vektor yang bisa digunakan untuk membawa molekul DNA asing masuk dalam sel inang adalah plasmid. Plasmid digunakan untuk melakukan rekayasa pada berbagai organisme yang tidak bisa diperoleh secara alami. Rekayasa ini dilakukan pada tingkat genetik sehingga disebut sebagai rekayasa genetika. Plasmid adalah molekul DNA sirkuler (lingkaran tertutup) yang berantai ganda dan dapat bereplikasi sendiri di luar kromosom dan tidak mengandung gen-gen esensial. Plasmid terdapat secara alami maupun sudah mengalami modifikasi yang disesuaikan dengan keperluan manipulasi genetik. Plasmid terdapat pada organisme prokariot maupun eukariot. Plasmid inilah yang berfungsi sebagai pembawa sifat rekombinan pada organisme yang akan direkayasa. B. Saran Demikian makalah ini kami buat, kami ucapkan banyak terima kasih kepada pihak yang telah membantu atas terselesainya makalah ini. Kami menyadari makalah yang kami buat ini jauh dari kata sempurna. Oleh karena itu kami mohon kritik dan saran yang sifatnya membangun, agar kami dapat memperbaiki makalah kami selanjutnya.

17 DAFTAR PUSTAKA Muladno. Teknologi rekayasa Genetika. Bogor: IPB Press, Old, R.W., dan Primrose, S.B. Prinsip-prinsip Manipulasi Gen; Pengantar Rekayasa Genetika. Jakarta: UI Press, Radji, M. Rekayasa Genetika; Pengantar untuk Profesi Kesehatan. Jakarta: Sagung Seto, Sudjadi. Bioteknologi Kesehatan. Yogyakarta: Kanisius, Walsh, G. Pharmaceutical Biotechnology; Concepts and Application. England: Wiley, 2007.