II. TINJAUAN PUSTAKA...

Transkripsi

1 DAFTAR ISI Halaman SAMPUL DALAM... i PERNYATAAN KEASLIAN KARYA SKRIPSI... ii ABSTRAK... iii ABSTRACT... iv RINGKASAN... v HALAMAN PERSETUJUAN... vi TIM PENGUJI... vii RIWAYAT HIDUP... viii KATA PENGANTAR... ix DAFTAR ISI... xi DAFTAR GAMBAR... xiii DAFTAR LAMPIRAN... xiv I. PENDAHULUAN Latar Belakang Rumusan Masalah Tujuan Penelitian Manfaat Penelitian... 4 II. TINJAUAN PUSTAKA Agrobacterium tumefaciens Ti Plasmid Tanaman Terinduksi Crown Gall Faktor-Faktor yang Mempengaruhi Pertumbuhan Bakteri Media LB dan Media Selektif AB Isolasi Bakteri Metode Gores Metode Tusuk Metode Kultur Cair Isolasi Total DNA Elektroforesis Inokulasi Bakteri Kultur Stok Gliserol III. METODE PENELITIAN Waktu dan Tempat Alat dan Bahan Pelaksanaan Penelitian Pengambilan kultur stok bakteri Pembuatan media LB... 20

2 3.3.3 Kultur pada media LB Pembuatan media selektif AB Kultur pada media selektif AB Isolasi total DNA Elektroforesis Inokulasi bakteri Kultur stok media gliserol IV. HASIL DAN PEMBAHASAN Isolasi Bakteri dari Kultur Stok Gliserol Kultur Bakteri pada Media Luria Bertani (LB) Kultur Bakteri A. tumefaciens pada Media Selektif AB Hasil Isolasi Total DNA Pembentukan Crown gall pada Wortel Kultur Stok Bakteri A. tumefaciens pada Media Gliserol V. SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Saran DAFTAR PUSTAKA... 34

3 ABSTRAK Erna Ismawati. NIM Isolasi dan Identifikasi Bakteri Agrobacterium tumefaciens (pti) yang Mengalami Dormansi Selama 15 Tahun Pada Suhu -80 C. Dibimbing oleh: Dr. Ir. I Ketut Suada, M.P. dan Prof. Dr. Ir. I Gede Putu Wirawan, M.Sc*) Agrobacterium tumefaciens merupakan bakteri patogen yang menyebabkan penyakit crown gall pada tanaman dikotil. Bakteri ini mengandung sebuah plasmid besar yang disebut plasmid-ti yang berisi gen penyandi faktor virulensi penyebab infeksi pada tanaman. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi dan mengidentifikasi bakteri A. tumefaciens (pti) yang mengalami dormansi selama 15 tahun pada suhu -80 C dengan menggunakan beberapa metode yaitu media selektif, isolasi total DNA, elektroforesis dan uji virulensi bakteri pada wortel. Hasil penelitian ini menunjukkan adanya pertumbuhan bakteri pada media LB dan media selektif AB dengan karakteristik yang khas yaitu berwarna krem bernuansa merah muda, berbentuk bulat dengan garis pinggir rata dan memiliki permukaan cembung. DNA bakteri yang terisolasi merupakan DNA plasmid dan kromosom berdasarkan elektroforesis gel agarosa. Inokulasi pada tanaman wortel menunjukkan adanya pertumbuhan crown gall yang membuktikan adanya plasmid-ti. Bakteri yang sudah terbukti dikultur dan disimpan kembali dalam kultur stok gliserol pada suhu -80 C. Kata kunci : A. tumefaciens, virulen, DNA

4 ABSTRACT Erna Ismawati. NIM Isolation and Identification Of Agrobacterium tumefaciens After 15 Years Stored At -80 o C. Supervisied by: Dr. Ir. I Ketut Suada, M.P. and Prof. Dr. Ir. I Gede Putu Wirawan, M.Sc*) Agrobacterium tumefaciens is a pathogenic bacteria that cause crown gall diseases in dicotyledonous plants. These bacteria have Ti-plasmid containing the gene encoding virulence factors cause crown gall tumor in plants. This study tried to isolate and identify A. tumefaciens that has been stored for 15 years at -80 C using several methods of selective media, DNA isolation, electrophoresis, and virulence test on carrot roots. The results of this study demonstrated the growth of bacteria in LB media and AB selective media, showed unique characteristic of A. tumefaciens that was pink colored, round-shaped with a flat edge, and has a convex surface. The DNA isolation showed the chromosomal DNA and its Ti plasmids after subjecting to electophoresis. The result of virulent tests showed crown gall were growed on carrot roots. This results indicated that A. tumefaciens which was stored at -80 C for 15 years still alife and could caused crown gall tumor. Keywords: A. tumefaciens, virulent, DNA

5 I. PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Bakteri adalah salah satu organisme prokariotik yang memiliki informasi genetik berupa DNA, tetapi tidak terlokalisasi dalam nukleus dan tidak ada membran inti. Bentuk DNA bakteri sirkuler dan panjang, yang disebut nukleoid. DNA bakteri tidak mempunyai intron dan hanya tersusun atas ekson saja. Bakteri juga memiliki DNA ekstrakromosomal yang tergabung menjadi plasmid yang berbentuk kecil dan sirkuler (Yulika, 2009). Plasmid adalah molekul DNA berbentuk kecil dan sirkuler yang terdapat bebas dalam sel bakteri. Plasmid hampir selalu membawa satu gen atau lebih yang menyebabkan adanya ciri-ciri penting yang ditunjukkan oleh bakteri tuan rumah. Ukuran plasmid berkisar antara 1 kb untuk yang terkecil sampai 250 kb untuk yang besar. Semua plasmid memiliki paling sedikit satu urutan (rangkaian) DNA yang dapat bertindak sebagai asal replikasi, sehingga plasmid-plasmid itu mampu memperbanyak diri di dalam sel (Puspitasari, 2008). Bakteri berkembangbiak secara alami maupun dengan bantuan manusia, yaitu dengan cara memanfaatkan nutrisi media untuk menyusun komponen sel. Bakteri yang dikembangkan dengan bantuan manusia harus melalui substrat yaitu media. Hidayat & Sutarma (1999) menyatakan bahwa media adalah suatu substansi yang terdiri dari campuran zat-zat nutrisi yang diperlukan untuk pertumbuhan dan perkembangbiakan mikroorganisme. Media dapat berbentuk padat, cair dan semi padat. Di dalam laboratorium mikrobiologi, kultur media sangat penting untuk isolasi, identifikasi, pengujian sifat-sifat fisis dan biokemis bakteri serta untuk diagnosa suatu penyakit. Nutrisi yang dibutuhkan bakteri pada

6 umumnya sangat bervariasi, dapat berbentuk senyawa-senyawa organik sederhana atau senyawa-senyawa organik komplek (majemuk). Sutarma (2000) menyatakan bahwa komposisi nutrisi media yang komplit mengandung sumber karbon, nitrogen, belerang, fosfat, logam mikro, vitamin, penyubur, NaCl dan air. Kristal violet, brilian green, bile salt, natrium selenit, antibiotik dan anti jamur adalah bahan penghambat/pembunuh bakteri/jamur yang tak diinginkan pada waktu isolasi yang sering ditambahkan ke dalam media. Era transformasi genetik sekarang ini, peran Agrobacterium sangat besar dalam menghasilkan tanaman yang dimodifikasi untuk mendapatkan sifat yang diinginkan. Peran Agrobacterium dalam hal ini adalah sebagai pembawa gen (vektor) yang diinginkan. Agrobacterium tumefaciens merupakan bakteri gram negatif yang habitat alaminya di dalam tanah dan menyebabkan tumor (crown gall) pada tanaman dikotil. Bakteri ini menginfeksi melalui bagian yang luka pada batang tanaman dan mengakibatkan tumor pada daerah sekitar akar dan batang tanaman. Kemampuannya dalam menyebabkan penyakit ini berhubungan dengan gen penginduksi tumor yang ada pada plasmid (Ti) yang dijumpai dalam bakteri tersebut. Dalam sel tumor yang terbentuk terkandung enzim-enzim yang tidak terdapat pada tanaman normal, karena enzim tersebut hanya dihasilkan oleh sel Agrobacterium. Enzim-enzim tersebut menghasilkan suatu senyawa gula spesifik yang dinamakan opin (Manalu et al., 2014). Agrobacterium tumefaciens menyerang tanaman pada bagian luka. Pengiriman pesan kimia (chemical messengers), biasanya senyawa fenolik seperti acetosyringone, yang berasal dari sel tanaman yang luka, mempengaruhi transkripsi gen virulen Ti-plasmid-borne yang dihasilkan di dalam bakteri. Produk-produk gen vir mempengaruhi transfer

7 T-DNA ke sel tanaman. T-DNA mengkode enzim auksin, sitokinin, biosintesis dan fitohormon senyawa ini mengganggu keseimbangan hormon pada tanaman inang, sehingga terbentuklah tumor. T-DNA juga mengkode enzim-enzim yang mensintesa senyawa yang tidak lumrah yang disebut opines. Opines hanya dapat digunakan oleh Agrobacterium yang membawa Ti-plasmid, sebagai sumber karbon dan nitrogen, tetapi tidak dapat digunakan oleh tanaman inang dan mikroorganisme lainnya. Proses transformasi membentuk suatu ekologi yang bisa ditempati (ecological niche) untuk bakteri, yang merupakan sejenis transformasi parasitis yang disebut kolonisasi genetik (Wirawan & Supartana, 2009). Memandang pentingnya peranan bakteri, maka diperlukan adanya penyimpanan bakteri yang benar-benar menjamin ketahanan bakteri. Metode penyimpanan dengan pendinginan terutama dengan media gliserol sering digunakan untuk menyimpan bakteri. Media gliserol mengandung gliserol dan akuades yang berfungsi sebagai media dormansi bakteri. Dormansi adalah suatu keadaan berhenti tumbuh yang dialami organisme hidup atau bagiannya sebagai tanggapan atas suatu keadaan yang tidak mendukung pertumbuhan normal. Pada media tersebut bakteri harus disimpan dalam suhu -80 C agar tetap mengalami dormansi. Selama penyimpanan ada salah satu faktor yang berpengaruh terhadap penyimpanan bakteri yaitu suhu. Hal ini berpengaruh karena jika bakteri tidak berada pada suhu -80 C bakteri akan hidup dengan beraktifitas mencari nutrisi pada media gliserol, sedangkan pada media tersebut tidak terdapat nutrisi yang dibutuhkan bakteri. Semakin lama bakteri hidup akan mengalami kematian karena tidak adanya ketersediaan nutrisi pada media tersebut. Dalam penelitian ini bakteri disimpan pada kultur stok gliserol -80 C yang sudah mengalami dormansi

8 selama 15 tahun, sehingga penelitian ini ingin membuktikan apakah pada kultur stok dengan suhu -80 C yang mengalami dormansi selama 15 tahun masih mengandung bakteri A. tumefaciens, serta membawa Ti-plasmid yang menyebabkan adanya crown gall dengan membuktikannya pada wortel. Hal ini dilakukan untuk mengetahui seberapa lama bakteri A. tumefaciens mampu membawa Ti-plasmid di dalam selnya. 1.2 Rumusan Masalah 1. Apakah bakteri A. tumefaciens yang di kultur dari kultur stok pada suhu -80 C tersebut masih hidup? 2. Bagaimana virulensi A. tumefaciens yang dibiakkan dari kultur stok tersebut pada wortel? 1.3 Tujuan Penelitian 1. Untuk mengetahui bakteri A. tumefaciens yang di kultur dari kultur stok pada suhu -80 C tersebut masih hidup. 2. Untuk mengetahui virulensi A. tumefaciens yang dibiakkan dari kultur stok tersebut pada wortel. 1.4 Manfaat Penelitian Manfaat penelitian ini adalah jika bakteri A. tumefaciens yang telah mengalami dormansi selama 15 tahun pada suhu -80 C tersebut masih hidup dan terbukti virulen dengan adanya crown gall pada wortel, maka bakteri tersebut masih mengandung plasmid (Ti) yang dapat digunakan untuk melakukan transfer gen tanaman agar didapatkan tanaman transgenik.