VARIASI GEN lrrna LEBAH MADU Apis cerana DI LOMBOK, SUMBAWA, DAN FLORES INDRA ANGGRIAWAN

Transkripsi

1 VARIASI GEN lrrna LEBAH MADU Apis cerana DI LOMBOK, SUMBAWA, DAN FLORES INDRA ANGGRIAWAN DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2008

2 ABSTRAK INDRA ANGGRIAWAN. Variasi Gen Large Ribosomal RNA (lrrna) Lebah Madu Apis cerana di Lombok, Sumbawa, dan Flores. Dibimbing oleh RIKA RAFFIUDIN dan M. CHANDRA WIDJAJA. Lebah madu Apis cerana merupakan lebah lokal Asia dengan persebaran yang sangat luas. Belum lengkapnya data genetika A. cerana menjadi dasar utama penelitian ini. Tujuan penelitian ini untuk mempelajari variasi genetika A. cerana berdasarkan lrrna/drai dan analisis filogenetik antara A. cerana di Indonesia dan Thailand. Koleksi A. c. indica dilakukan di Lombok, Sumbawa, dan Flores. Analisis homologi dilakukan dengan A. cerana dari Thailand (AF140508; AF140509; dan AF140511), serta haplotipe A. cerana dari Pati dan Lombok (AcPt1 dan AcLb4). Jumlah koloni yang diperoleh masing-masing 22, 3, dan 4 koloni untuk Lombok, Sumbawa, dan Flores. Ukuran nukleotida gen lrrna yang diamplifikasi berkisar antara pb dengan basa AT sekitar 88.90%. Berdasarkan analisis lrrna/drai, ditemukan dua haplotipe yaitu haplotipe A dan C. Persentase haplotipe A sebesar 72.72, 100, dan 50%, berturut-turut untuk populasi A. c. indica di Lombok, Sumbawa, dan Flores. Persentase haplotipe C sebesar dan 50% untuk A. c. indica di Lombok dan Flores. Analisis filogenetik berdasarkan gen lrrna menggunakan Maximum Parsimony menunjukkan bahwa populasi lebah di Thailand membentuk kelompok yang terpisah dengan A. cerana di Indonesia. Jarak genetik terbesar (3.53%) terjadi antara AF dan AcLb4. Sedangkan nilai jarak genetik terkecil (0.00%) terjadi antara AcPt1 dan AcSbw5. Nilai transisi/transversi (ts/tv) >1 adalah 66.67% dan ts/tv <1 adalah 26.67%. ABSTRACT INDRA ANGGRIAWAN. Variation of large ribosomal RNA (lrrna) gene of Honey Bee Apis cerana from Lombok, Sumbawa, and Flores. Supervised by RIKA RAFFIUDIN and M. CHANDRA WIDJAJA. Apis cerana is a native, wide distribution honey bee in Asia and lack of its genetic data in Indonesia. Hence, the purposes of this research were to explore the genetic variations of A. cerana based on lrrna digested by DraI (lrrna/drai) and performed a phylogenetic analysis with A. cerana from Thailand. Apis cerana were collected from Lombok, Sumbawa, and Flores. DNA homology analysis were carried out with A. cerana from Thailand (AF140508, AF140509, and AF140511), and from Pati and Lombok (AcPt1 and AcLb4). A total of 22, 3, and 4 collonies of A. cerana were collected from Lombok, Sumbawa, and Flores, respectively. The nucleotide sequence of lrrna were AT-rich (88.90%), ranged from 625 up to 629 bp. There were two haplotypes, haplotype A and C, based on lrrna/drai analysis. The A haplotype were 72.72, 100, and 50 %, respectively for A. c. indica from Lombok, Sumbawa, and Flores. The C haplotype were and 50%, respectively from Lombok and Flores. Phylogenetic analysis by using maximum parsimony method, showed that A. cerana from Thailand clustered separately with those of Indonesian A. cerana. The highest genetic distance (3.53%) occured between AF and AcLb4. The shortest genetic distance (0.00%) was between AcPt1 and AcSbw5. Transition/transvertion (ts/tv) value >1 were 66.67% and ts/tv <1 were 26.67%.

3 VARIASI GEN lrrna LEBAH MADU Apis cerana DI LOMBOK, SUMBAWA, DAN FLORES INDRA ANGGRIAWAN Skripsi Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2008

4 Judul : Variasi Gen lrrna Lebah Madu Apis cerana di Lombok, Sumbawa, dan Flores Nama : Indra Anggriawan NIM : G Menyetujui : Pembimbing I, Pembimbing II, Dr. Ir. Rika Raffiudin, M.Si Drs. M. Chandra Widjaja, MM NIP NIP Mengetahui : Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor Dr. Drh. Hasim, DEA NIP Tanggal Lulus :

5 RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 19 Desember 1984 sebagai putra kedua dari pasangan Sudiono dan Titin. Pendidikan yang telah ditempuh oleh penulis yaitu pendidikan dasar di SDN 04 Lubang Buaya pada tahun 1997, pendidikan menengah pertama di SLTPN 81 Lubang Buaya pada tahun 2000, dan pendidikan menengah atas di SMUN 48 Pinang Ranti pada tahun Penulis kemudian melanjutkan pendidikannya di Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (FMIPA) Institut Pertanian Bogor (IPB) melalui jalur Seleksi Penerimaan Mahasiswa Baru (SPMB). Selama berkuliah di Departemen Biologi, penulis menjadi asisten untuk mata kuliah Biologi Tingkat Persiapan Bersama (Bio-TPB), Perkembangan Hewan, Biologi Sel dan Molekuler, dan Avertebrata pada tahun ajaran Penulis juga menjadi asisten untuk mata kuliah Bio-TPB, Studi Lapang, dan Vertebrata pada tahun ajaran Selain itu penulis juga aktif di organisasi kemahasiswaan Biologi (HIMABIO). Pada tahun , penulis menjadi ketua bagian Nata Bioworld dan ketua bidang eksplorasi alam. Pada tahun 2005, penulis melakukan studi lapang di Taman Wisata Alam (TWA) Situ Gunung mengenai keragaman semut di TWA Situ Gunung. Pada tahun berikutnya, penulis melakukan praktek lapang mengenai perawatan dan pemeliharaan Macaca fascicularis di Pusat Penyelamatan Satwa Cikananga (PPSC) Sukabumi. Pada tahun 2007 penulis melakukan ekspedisi lebah Apis cerana dan A. dorsata di Lombok dan Sumbawa. Ekspedisi tersebut bekerja sama dengan Universitas Mataram (Program Studi Biologi), Dinas Kehutanan (Dishut) Nusa Tenggara Barat (NTB), Rajawali Citra Televisi Indonesia (RCTI) Lombok, dan kelompok tani madu di Lombok dan Sumbawa. Ekspedisi dibiayai oleh Direktorat Jenderal Pendidikan, Departemen Pendidikan Nasional, atas nama Rika Raffiudin dengan judul Diferensiasi DNA Mitokondria Lebah Madu Apis cerana di Jawa, Lombok, Sumbawa, dan Flores. Pada tahun yang sama, penulis juga mengikuti seminar Biologi Internasional di Universitas Gadjah Mada Jogjakarta (Advance in Biological Sciences: Contribution Toward a Better Human Prosperity, Jogjakarta, 7-8 September 2007) sebagai peserta poster, dengan judul poster Nest Characteristics of Honey Bee in Sumbawa Island.

6 PRAKATA Alhamdulillah, puji syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala nikmat Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr. Ir. Rika Raffiudin, M.Si dan Drs. M. Chandra Widjaja, MM atas bimbingan dan dukungannya, serta kritik dan sarannya sehingga karya ilmiah ini menjadi lebih baik lagi, dan kepada Nina Ratna Djuita, M.Si, selaku penguji atas kritik dan saran terhadap karya ilmiah ini. Ucapan terima kasih penulis ucapkan kepada Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi (DIKTI) atas dana penelitian tahun 2007 (dibiayai oleh Direktorat Jenderal Pendidikan, Departemen Pendidikan Nasional, Surat Perjanjian No.: 317/SP3/PP/DP2M/II/2006 tanggal: 1 Februari 2006 DIREKTORAT JENDERAL PENDIDIKAN TINGGI DEPARTEMEN PENDIDIKAN NASIONAL) atas nama Rika Raffiudin dengan judul Diferensiasi DNA Mitokondria Lebah Madu Apis Cerana di Jawa, Lombok, Sumbawa, dan Flores. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Bapak Bambang Suryobroto, Bapak Achmad Farajallah, Bapak Tri Heru W, Bapak Tri Atmowidi, Ibu Taruni Sri P, dan Ibu Dyah Perwitasari atas segala saran, ilmu, dan nasihat yang telah diberikan. Terima kasih kepada Pak Adi, Mba Tini, Pak Wandia, Mba Zul, dan Ani atas bantuannya selama di Laboratorium. Terima kasih kepada Sinyo dan keluarga, team eksplorasi lebah Lombok (Adi dan Dedi (mahasiswa Biologi Universitas Mataram), Sumbawa (Dinas Kehutanan (Dishut) Nusa Tenggara Barat (NTB), Rajawali Citra Televisi Indonesia (RCTI) Lombok, Asrul (mahasiswa Biologi Universitas Mataram), dan kelompok tani madu Abadi), Dompu-Bima (Pak Syam, Pak Azis, dan Mas Bambang), dan Flores (Taman Nasional Kelimutu). Kepada Nico, Lusi, Wildan, Citra, Rut, Gita, Oci, Wafa, Carwan, Dian, Muley, Rini, Femi, dan Sri Maria U, serta seluruh teman-teman Biologi atas dukungan dan motivasi yang telah diberikan. Terima kasih penulis haturkan kepada keluarga tercinta atas semua dukungan dan doa yang telah diberikan. Bogor, Januari 2008 Indra Anggriawan

7 DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL...VI vi DAFTAR GAMBAR...VI vi DAFTAR LAMPIRAN...VI vi PENDAHULUAN... 1 METODE... 1 Objek OBJEK Penelitian PENELITIAN KOLEKSI Koleksi Lebah LEBAH... 1 Ekstraksi EKSTRAKSI DNA... 2 Amplifikasi AMPLIFIKASI DNA... 2 ELEKTROFORESIS Elektroforesis DNA DNA... 2 VISUALISASI Visualisasi DNA ANALISIS Analisis PCR-RFLP... 3 PENGURUTAN Pengurutan (Sequence) (SEQUENCING) dan Analisis DAN ANALISIS Homologi HOMOLOGI (Alignment) (ALIGNMENT) DNA... DNA... 3 ANALISIS Analisis Filogenetik POHON FILOGENI HASIL... 4 Koleksi KOLEKSI Lebah LEBAH... 4 Ekstraksi EKSTRAKSI dan DAN Amplifikasi AMPLIFIKASI DNA DNA Analisis ANALISIS PCR-RFLP... 5 Pengurutan PENGURUTAN (Sequence) (SEQUENCE) DNA DNA... 6 Analisis ANALISIS Homologi HOMOLOGI (Alignment) (ALIGNMENT) DNA DNA... 7 Analisis ANALISIS Filogenetik FILOGENI A. A. CERANA cerana... 7 PEMBAHASAN Distribusi DISTRIBUSI A. A. cerana CERANA Analisis ANALISIS Keragaman KERAGAMAN Genetik GENETIK lrrna LRRNA dan cox DAN 1-2 COX A. c. 1-2 indica A. C.. INDICA Persentase PERSENTASE Haplotipe HAPLOTIPE A. c. A. indica C. INDICA Variasi VARIASI Nukleotida NUKLEOTIDA A. c. LRRNA indica A.. C. INDICA ANALISIS Analisis Pohon POHON Filogeni FILOGENI SIMPULAN SARAN DAFTAR PUSTAKA LAMPIRAN... 13

8 DAFTAR TABEL Halaman 1 Nukleotida primer yang digunakan untuk amplifikasi lrrna A. cerana berdasarkan nukleotida primer Sittipraneed (2001) Lebah madu Apis cerana dan A. mellifera yang digunakan pada penelitian ini Data lokasi koleksi lebah A. cerana Data haplotipe gen lrrna A. cerana Lombok, Sumbawa, dan Flores Persentase haplotipe A. cerana Lombok, Sumbawa, dan Flores Persentase nukleotida A. cerana lrrna/drai Jarak genetik antar koloni A. cerana lrrna/drai DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Lebah Madu A. cerana Peta lokasi pengambilan sampel di (a) Lombok, (b) Sumbawa, dan (c) Flores Pita DNA A. cerana gen lrrna. M: penanda DNA 100 pb Promega, 1-2: Ac21Lb, 3-4: Ac22Lb, 5-6: Ac4Sb, 7-8: Ac5Sb, 9-10: Ac6Sb Pita DNA A. cerana hasil pemotongan dengan DraI. M: penanda DNA 100 pb Promega, 1-2: Ac21Lb, 3-4: Ac22Lb, 5-6: Ac4Sb, 7-8: Ac5Sb, 9-10: Ac6Sb Peta restriksi hasil pemotongan gen lrrna/drai A. cerana. AcLb21, AcSbw5, AcFlr3, dan AcFlr4: hasil penelitian ini. AF140508, AF140509, dan AF140511: Sittipraneed (2001), AcPt1 dan AcLb4: Apriani (2006) Homologi urutan nukleotida gen lrrna A. cerana. AcLb21, AcSbw5, AcFlr3, dan AcFlr4: hasil penelitian ini. AF140508, AF140509, dan AF140511: Sittipraneed (2001), AcPt1 dan AcLb4: Apriani (2006), Amel_lrRNA: urutan nukleotida lrrna Apis mellifera (Acc number: L06178). TTT/AAA: situs restriksi DraI, *: homologi nukleotida Konstruksi pohon filogeni A. cerana gen lrrna berdasarkan Maximum Parsimony (Gambar a-c) dan Neighbour Joining (Gambar d), angka di atas nodus menyatakan nilai bootstrap 100x. AcLb21, AcSbw5, AcFlr3, dan AcFlr4: hasil penelitian ini. AF140508, AF140509, dan AF140511: Sittipraneed (2001), AcPt1 dan AcLb4: Apriani (2006), L06178: urutan nukleotida lrrna Apis mellifera... 9 DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1 Daerah koleksi A. c. indica Lombok dan Sumbawa (Apriani 2006) Peta persebaran A. cerana di Indonesia berdasarkan lrrna/drai ( ) Rasio substitusi transisi dengan transversi Kromatogram hasil pengurutan DNA A. c. indica (AcSbw5) menggunakan primer For lrrna Kromatogram hasil pengurutan DNA A. c. indica (AcSbw5) menggunakan primer Rev lrrna Kromatogram hasil pengurutan DNA A. c. indica (AcLb21) menggunakan primer For lrrna Kromatogram hasil pengurutan DNA A. c. indica (AcLb21) menggunakan primer Rev lrrna... 21

9 PENDAHULUAN Latar Belakang Lebah madu merupakan salah satu serangga sosial yang hidup dalam suatu koloni dan terdiri atas ribuan individu. Dalam koloni tersebut, terdapat tiga kasta yang dibedakan berdasarkan kemampuan reproduktif, yaitu ratu, jantan, dan pekerja (Winston 1987). Berdasarkan Michener (2000), lebah madu termasuk ke dalam ordo Hymenoptera, subordo Apocrita, infraordo Acuelata, superfamili Apoidea, famili Apidae, subfamili Apinae, tribe Apini, dan genus Apis. Lebah madu Apis cerana merupakan lebah lokal yang banyak diternakan di Indonesia. Hal itu dikarenakan A. cerana memiliki daya tahan terhadap tungau parasit Varrhoa dan daya adaptasi yang tinggi terhadap lingkungan (Morse 1997). Selain itu juga didukung dengan persebaran yang sangat luas dari lebah ini. Menurut Ruttner (1988), lebah madu A. cerana memiliki empat sub spesies yang tersebar di seluruh dunia, yaitu A. c. cerana (Asia bagian barat dan timur laut), A. c. indica (Asia selatan dan tenggara), A. c. himalaya (pegunungan Himalaya), dan A. c. japonica (Jepang). Taiwan, Koera, Nepal, dan Filipina menunjukkan adanya variasi DNA mitokondria pada daerah trna leu dan daerah Cytochrome Oxidase I-II (CO I-II) (Deowanish et al. 1996). Pada tahun 1999, dilakukan analisis dengan menggunakan enzim restriksi DraI pada daerah gen srrna, lrrna, dan daerah intergenik CO I- II. Dari 170 koloni yang digunakan, ditemukan variasi dari ketiga gen tersebut yaitu masingmasing dengan dua, empat, dan tujuh haplotipe (Sihanuntavong et al. 1999). Sedangkan dari hasil analisis RFLP dengan menggunakan gen lrrna/drai pada 225 koloni di Thailand, menghasilkan empat haplotipe (Sittipraneed et al. 2001). Penelitian mengenai keragaman genetik mtdna dari A. cerana di Indonesia telah dilakukan sebelumnya oleh Raffiudin pada tahun Penelitian tersebut menggunakan analisis gen lrrna/drai, dengan jumlah koloni yang digunakan 97 koloni, yang masing-masing berasal dari pulau Jawa (81 koloni), Kalimantan (enam koloni), Lombok (tujuh koloni), dan Sumbawa (tiga koloni). Dari hasil analisis tersebut diperoleh dua haplotipe untuk pulau Jawa, satu haplotipe untuk pulau Kalimantan, dan dua haplotipe untuk pulau Lombok dan Sumbawa. Tujuan Penelitian ini bertujuan untuk mengeksplorasi lebih lanjut variasi genetika A. cerana indica berdasarkan gen lrrna di pulau Lombok, Sumbawa, dan Flores. Selain itu, penelitian ini mempelajari filogeni A. cerana hasil penelitian ini dengan A. cerana asal Thailand. Dari hasil penelitian ini diharapkan dapat melengkapi database mengenai haplotipe dan urutan nukleotida gen lrrna A. c. indica di Indonesia. Gambar 1 Lebah madu A. cerana. DNA mitokondria (mtdna) merupakan informasi genetik yang hanya diturunkan secara maternal, sehingga analisis mtdna dapat digunakan untuk mempelajari evolusi hewan, keragaman populasi, dan aliran gen. Gen large ribosomal RNA (lrrna) merupakan salah satu gen pada mtdna yang tidak menyandi protein. Gen ini memiliki persentase A-T yang tinggi yaitu 83.33% (Crozier & Crozier 1993). Analisis Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) yang dilakukan pada populasi lebah di Jepang, Thailand, Vietnam, METODE Objek Penelitian Objek penelitian yang digunakan adalah lebah madu A. c. indica yang berasal dari Lombok, Sumbawa, dan Flores (hasil koleksi dari penelitian ini) dan koleksi Rika Raffiudin di Lab. Zoologi Departemen Biologi FMIPA IPB. Koleksi di Flores dilakukan oleh Islamul Hadi (Staf pengajar Program Studi Biologi, Universitas Mataram). Koleksi Lebah Koleksi lebah dilakukan di pulau Lombok (tujuh daerah), Sumbawa (tiga daerah), dan Flores (tiga daerah). Dari masing-masing

10 2 koloni diambil individu lebah pekerja dan kemudian disimpan di dalam tabung yang berisi etanol absolut. Ekstraksi DNA Ekstraksi DNA dilakukan dengan menggunakan metode cetyl trimethyl ammonium bromide (CTAB) 20% dan presipitasi etanol (Sambrook et al. 1989). Ekstraksi dilakukan terhadap dua individu lebah pekerja dari tiap koloni. Sebelum diekstraksi, lebah dimasukkan ke dalam 10 mm Tris HCl ph 8; 1 mm EDTA (TE) sebanyak tiga kali. Pencucian tersebut bertujuan untuk mengganti etanol dalam jaringan dengan TE. Toraks lebah kemudian dipotong dengan menggunakan pisau scalpel steril dan dimasukkan ke dalam tabung 1.5 ml. Setelah itu tabung yang berisi toraks lebah direndam dalam nitrogen selama 20 menit. Toraks kemudian digerus hingga hancur dengan menggunakan grinder. Sebanyak 500 μl bufer CTAB (10 ml 1 M Tris-HCl ph 8; 4 ml 0.5 M NaEDTA ph 8; 8.18 g NaCl; 2 g CTAB dan air hingga 100 ml) dan 14 μl Proteinase K (5 mg/ml) ditambahkan ke dalam tabung yang berisi hancuran jaringan toraks. Tabung kemudian diinkubasi pada suhu 55 C selama dua jam dan disentrifugasi dengan kecepatan rpm (10 menit). Supernatan yang terbentuk kemudian dipindahkan ke tabung 1.5 ml baru dan ditambahkan 250 μl fenol dan 250 μl CIAA (kloroform isoamil alkohol). Tabung lalu dikocok perlahan selama satu menit dan disentrifugasi dengan kecepatan rpm selama lima menit. Sentrifugasi akan membentuk dua lapisan yaitu lapisan atas yang mengandung DNA dan lapisan bawah yang merupakan campuran antara fenol dan isoamil alkohol. Lapisan bawah tersebut kemudian dibuang dan tabung disentrifugasi kembali selama satu menit. Lapisan atas yang mengandung DNA kemudian dipindahkan ke tabung baru dan ditambahkan larutan CIAA sebanyak 400 μl. Tabung kemudian dikocok perlahan selama satu menit dan disentrifugasi selama tiga menit pada kecepatan rpm. Kemudian lapisan bawah hasil sentrifugasi dibuang dan tabung disentrifugasi kembali dengan kecepatan rpm selama satu menit. Lapisan atas yang mengandung DNA dipindahkan ke tabung baru dan ditambahkan 600 μl isopropanol kemudian dipresipitasi selama semalam pada suhu 4 C. Tabung yang berisi campuran DNA dan isopropanol kemudian disentrifugasi dengan kecepatan rpm (30 menit) pada suhu 4 C. Larutan isopropanol kemudian dibuang dan ke dalam tabung ditambahkan 500 μl etanol 70%, selanjutnya tabung disentrifugasi kembali rpm (10 menit) pada suhu 4 C. Supernatan lalu dibuang dan endapan (pelet) DNA dikeringkan dengan cara divakum selama 30 menit. Pelet DNA hasil ekstraksi kemudian dilarutkan dalam TE 0.5 M dan disimpan pada suhu 4 C. Amplifikasi DNA DNA hasil ekstraksi kemudian diamplifikasi (diperbanyak) secara in vitro dengan menggunakan metode PCR (mesin PCR Takara Thermal Cycle). Komposisi pereaksi yang digunakan pada proses PCR terdiri atas 6.4 μl destilata water (DW) steril, 1 μl dntp 2.5 mm, 1.25 μl Mg 2+ free buffer, 1.5 μl MgCl 2 25 mm, 0.1 μl Taq polymerase 5 μm, 1 μl DNA hasil ekstraksi, μl primer For lrrna 10 μm, dan μl primer Rev lrrna 10 μm (Tabel 1). Total volume pereaksi yang digunakan sebanyak 12.5 μl. Amplifikasi dilakukan dalam tiga tahap, yaitu tahap predenaturasi dengan suhu 94 0 C selama satu menit. Kemudian dilakukan perbanyakan sebanyak 30 siklus dengan suhu denaturasi (pemisahan utas ganda DNA) 94 0 C, annealing (penempelan primer) 61 0 C, dan elongation (pemanjangan segmen DNA) 72 0 C, masing-masing selama 1 menit. Tahap terakhir yaitu sintesis DNA dengan suhu 72 0 C selama tujuh menit. Elektroforesis DNA DNA yang telah diamplifikasi kemudian dipisahkan dengan menggunakan polyacrilamide gel electrophoresis (PAGE) 5% dengan bufer 1xTBE (Tris 0.5 M, Asam borat 0.65 M, EDTA 0.02 M). Gel akrilamid 5% terdiri atas 4 ml akrilamid 30%, 4 ml bufer 5xTBE, 12.5 ml destilata water (DW) steril, 15 μl TEMED, dan 150 μl APS 10%. Fragmen DNA kemudian dimigrasikan dengan menggunakan arus listrik sebesar 145 Volt selama 100 menit. Proses ini menggunakan DNA ladder 100 bp (Promega) sebagai penanda DNA. Visualisasi DNA Pita DNA pada gel akrilamid divisualisasi dengan menggunakan metode pewarnaan silver nitrate (Tegelstrom 1986). Tahapan visualisasi DNA ini meliputi pencucian dengan larutan CTAB (0.2 g/200 ml akuades) selama 10 menit, dilanjutkan dengan akuades (200 ml) selama 2x2 menit. Kemudian gel direndam dalam

11 3 NH 4 OH (2 ml/200 ml akuades) selama 8 menit. Setelah itu gel direndam dalam campuran AgNO 3 (0.32 g AgNO 3, 0.8 ml NH 4 OH, 80 μl, dan 200 ml akuades) selama 20 menit. Gel lalu dicuci kembali dengan akuades selama 2x2 menit. Selanjutnya gel direndam dalam campuran NaCO 3 (4 g NaCO 3, 100 μl formaldehida, dan 200 ml akuades) sampai muncul pita DNA. Tahap terakhir yaitu gel direndam dalam larutan asam asetat 1% (200 μl asam asetat 1% dan 200 ml akuades). Analisis PCR-RFLP PCR produk kemudian dipotong dengan menggunakan enzim restriksi DraI. Enzim restriksi ini memiliki situs pemotongan TTT/AAA. Komposisi pereaksi yang digunakan pada proses PCR-RFLP terdiri atas 1.1 μl DW steril, 0.4 μl bufer B, 0.5 μl enzim restriksi DraI (10 U/μl), dan 2 μl PCR produk. Total volume pereaksi yang digunakan sebanyak 4 μl. Campuran tersebut kemudian diinkubasi selama semalam pada suhu 37 C. Hasil pemotongan kemudian dimigrasikan dengan menggunakan gel akrilamid 5% pada 145 Volt selama 100 menit. Pita DNA kemudian divisualisasi dengan menggunakan metode pewarnaan silver nitrate (Tegelstrom 1986). Pengurutan (Sequencing) dan Analisis Homologi (Alignment) DNA Nukleotida lrrna hasil PCR diurutkan dengan menggunakan jasa Lembaga Biologi Molekuler Charoen Pockphan Jakarta. Selanjutnya hasil pengurutan dianalisis dengan menggunakan program Genetyx Win 4.0 dan Clustal X (Thompson et al. 1997). Analisis homologi nukleotida lrrna dilakukan antara haplotipe yang ditemukan pada penelitian ini dengan haplotipe Sittipraneed et al. (2001) dari GenBank ( dengan Accession number (Acc number): AF140508; AF140509; dan AF , haplotipe dari hasil Apriani (2006): AcPt1 dan AcLb4, dan sebagai outgroup digunakan urutan nukleotida A. mellifera (Acc number: L06178) (Tabel 2). Analisis Filogenetik Analisis filogenetik dilakukan dengan menggunakan program PAUP 4.10 (PPC) versi Macintosh. Rekonstruksi yang digunakan pada analisis ini yaitu Maximum Parsimony (MP) dan Neighbour Joining (NJ), dengan menggunakan bootstrap 100x. Tabel 1 Nukleotida primer yang digunakan untuk amplifikasi lrrna A. cerana berdasarkan nukleotida primer Sittipraneed (2001) No Primer Urutan Nukleotida Primer (5`-3`) 1 Forward lrrna GGG ACG ATA AGA CCC TAT AG 2 Reverse lrrna CAA CCC TGA TAC AAA GGT ACA AAA Tabel 2 Lebah madu A. cerana dan A. mellifera yang digunakan pada penelitian ini Kelompok Lebah Kode Sampel Lokasi Acc Number Kolektor Ingroup A. cerana AcLb21 Lombok - Anggriawan I A. cerana AcSbw5 Sumbawa - Anggriawan I A. cerana AcFlr3 Flores - Hadi I A. cerana AcFlr4 Flores - Hadi I A. cerana AcPt1 Pati - Apriani A. cerana AcLb4 Lombok - Hadi I A. cerana AF Thailand AF Sittipraneed S A. cerana AF Thailand AF Sittipraneed S A. cerana AF Thailand AF Sittipraneed S Outgroup A. mellifera L L06178 Crozier RH

12 4 HASIL Koleksi Lebah Lebah madu A. c. indica yang berhasil dikoleksi berjumlah 29 koloni. Koloni diambil dari tujuh kecamatan di Lombok yaitu Kec. Selaparang (satu koloni), Kec. Pamenang (dua koloni), Kec. Pujut (tiga koloni), Kec. Tanjung (lima koloni), Kec. Santong (lima koloni), Kec. Kelayu (satu koloni), dan lima koloni dari Kec. Masbagik (Tabel 3, Gambar 2a). Selain itu, koloni tersebut juga berasal dari tiga tempat yang berbeda di Sumbawa yaitu Kec. Moyo Utara, Desa Pungka, dan Desa Pelat, dengan jumlah koloni masing-masing satu koloni (Tabel 3, Gambar 2b). Serta empat koloni yang berasal dari tiga desa di Flores, yaitu Desa Walogai (satu koloni), Desa Walogai Atas (dua koloni), dan Desa Moni (satu koloni) (Tabel 3, Gambar 2c). Budidaya lebah A. c. indica di Lombok umumnya dikelola oleh peternakan keluarga. Peternak memperoleh lebah dengan menangkap lebah langsung dari hutan, kemudian lebah disimpan dalam stup (kotak) dan glodok (potongan batang pohon kelapa yang dilubangi). Kotak stup disusun di rak atau digantung di pohon-pohon sekitar rumah mereka. Selain peternakan keluarga, di Lombok juga terdapat beberapa kelompok tani madu hasil binaan dinas kehutanan (Dishut) Nusa Tenggara Barat (NTB). Sedangkan di Sumbawa, A. c. indica umumnya diternakkan secara liar yang banyak ditemukan di lubang-lubang pohon. Di pulau ini peternakan lebah lebih banyak dikelola oleh kelompok tani madu binaan Dishut NTB. Selain A. cerana, kelompok tani madu di Sumbawa juga membudidayakan lebah A. dorsata. Kondisi budi daya lebah di Flores, tidak jauh berbeda dengan kondisi di Sumbawa. Di pulau ini, umumnya para peternak membudidayakan A. c. indica secara liar. Ekstraksi dan Amplifikasi DNA Ekstraksi dilakukan terhadap 58 individu lebah pekerja. Dari hasil amplifikasi dengan menggunakan primer For lrrna dan Rev lrrna diperoleh pita dengan ukuran pb (pasang basa) (Gambar 3). Tabel 3 Data lokasi koleksi lebah A. cerana Pulau Kode Sampel Lokasi Koordinat Ketinggian (m dpl) Jumlah Koloni Lombok AcLb11 Kampus lama Univ Mataram, Kec. Selaparang, Mataram AcLb12 Kelayu, Lombok Timur AcLb13-16 Santong AcLb17 Santong AcLb18-19 Desa Bentek, Kec. Pamenang, Lombok Barat AcLb20-22 Desa Kuta, Kec. Pujut, Lombok Tengah AcLb23-27 Desa Sire, Kec. Tanjung, Lombok Barat AcLb28-32 Desa Lendang Nangka, Kec. Masbagik Sumbawa AcSbw4 Gili Ngara, Kec. Moyo Utara, Sumbawa AcSbw5 Desa Pelat, Sumbawa AcSbw6 Desa Pungka, Sumbawa Flores AcFlr1 Desa Walogai, Flores AcFlr2-3 Desa Walogai Atas, Flores AcFlr4 Desa Moni, Flores Total 29

13 5 Analisis PCR-RFLP Analisis PCR-RFLP yang dilakukan pada 29 koloni lebah A. c. indica dengan menggunakan enzim restriksi DraI menunjukkan adanya variasi genetika, yaitu dengan ditemukan dua haplotipe (A dan C) (Gambar 4). Haplotipe A ditemukan pada koloni yang berasal dari Kec. Selaparang, Kec. Santong, Kec. Pamenang, Kec. Tanjung, dan Kec. Masbagik (Lombok), Kec. Moyo Utara, Desa Pelat, dan Desa Pungka (Sumbawa), serta Desa Walogai dan Desa Walogai Atas (Flores), sedangkan haplotipe C ditemukan pada koloni yang berasal dari Kec. Santong, Kec. Pujut, dan Kec. Masbagik (Lombok), serta Desa Walogai Atas dan Desa Moni (Flores) (Tabel 3, Tabel 4). Perbedaan posisi pemotongan dapat dilihat pada setiap urutan nukleotida (Gambar 5). Ac Lb Ac 17 Lb Ac Lb Ac Lb Ac 7 Lb Ac 9 Lb Ac 4, 11 Lb Ac 6 Lb Ac Lb Ac 5 Lb Ac 10 Lb Ac 12 Lb Ac4Sbw 4 Ac5Sbw 5 Ac6Sbw 6 Ac3Sbw 3 Ac2Sbw 2 Sbw Ac Lb Sungai di Sumbawa Lokasi A. cerana Gunung di Sumbawa Lokasi A. cerana Sungai di Lombok Gunung di Lombok (a) (b) Ac 2-3 Flr Ac 1 Flr Ac 4 Flr Lokasi A. cerana Sungai di Flores Gunung di Flores (c) Gambar 2 Peta lokasi pengambilan sampel di (a) Lombok, (b) Sumbawa, dan (c) Flores.

14 M Gambar 3 Pita DNA A. cerana gen lrrna. M: penanda DNA 100 pb Promega, 1-2: Ac21Lb, 3-4: Ac22Lb, 5-6: Ac4Sb, 7-8: Ac5Sb, 9-10: Ac6Sb. M Gambar 4 Pita DNA A. cerana hasil pemotongan dengan DraI. M: penanda DNA 100 pb Promega, 1-2: Ac21Lb, 3-4: Ac22Lb, 5-6: Ac4Sb, 7-8 : Ac5Sb, 9-10: Ac6Sb. Berdasarkan perhitungan persentase haplotipe, haplotipe A merupakan haplotipe umum yang ditemukan pada koloni lebah Lombok, Sumbawa, dan Flores, dengan persentase sebesar 72.72% (Lombok), 100% (Sumbawa), dan 50% (Flores), sedangkan haplotipe C memiliki persentase sebesar 27.28% (Lombok) dan 50% (Flores) (Tabel 5). Pengurutan (Sequence) DNA Pengurutan DNA dilakukan dengan menggunakan primer For dan Rev lrrna pada masing-masing haplotipe yang berbeda (haplotipe A dan C). Masing-masing haplotipe tersebut mewakili individu asal Lombok, Sumbawa, dan Flores yaitu AcSbw5, AcLb21, dan AcFlr4 dengan panjang DNA hasil pengurutan pb, pb, dan pb. Panjang DNA tersebut ditambah dengan panjang urutan nukleotida primer (For + Rev) sebesar + 30 pb, sehingga panjang DNA yang sebenarnya adalah pb, pb, dan pb. Hasil pengurutan ditampilkan dalam bentuk kromatogram (Lampiran 4-9). Tabel 4 Data haplotipe gen lrrna A. cerana Lombok, Sumbawa, dan Flores No Asal Haplotipe Lombok 1 Ac Lb 11 A 2 Ac Lb 12 C 3 Ac Lb 13 A 4 Ac Lb 14 A 5 Ac Lb 15 C 6 Ac Lb 16 A 7 Ac Lb 17 A 8 Ac Lb 18 A 9 Ac Lb 19 A 10 Ac Lb 20 A 11 Ac Lb 21 C 12 Ac Lb 22 C 13 Ac Lb 23 A 14 Ac Lb 24 A 15 Ac Lb 25 A 16 Ac Lb 26 A 17 Ac Lb 27 A 18 Ac Lb 28 A 19 Ac Lb 29 A 20 Ac Lb 30 C 21 Ac Lb 31 A 22 Ac Lb 32 A Sumbawa 23 Ac Sbw 4 A 24 Ac Sbw 5 A 25 Ac Sbw 6 A Flores 26 Ac Flr 1 A 27 Ac Flr 2 C 28 Ac Flr 3 A 29 Ac Flr 4 C AF AF AF AcPt1 AcSbw5 AcFlr3 AcLb4 AcLb21 AcFlr4 Gambar 5 Peta restriksi hasil pemotongan gen lrrna/drai A. cerana. AcLb21, AcSbw5, AcFlr3, dan AcFlr4: hasil penelitian ini. AF140508, AF140509, dan AF140511: Sittipraneed (2001), AcPt1 dan AcLb4: Apriani (2006).

15 7 Analisis Homologi (alignment) DNA Analisis kesamaan (homologi) dilakukan pada masing-masing haplotipe yang ditemukan pada penelitian ini dengan haplotipe hasil penelitian Sittipraneed et al. (2001) yang diambil dari GenBank dengan Acc Number: AF140508, AF140509, dan AF140511, haplotipe hasil penelitian Apriani (2006), dan urutan nukleotida A. mellifera dengan Acc number L Hasil alignment DNA dengan haplotipe Sittipraneed (2001) ditemukan adanya tiga situs pemotongan yang berbeda. Posisi situs pemotongan yang berbeda disebabkan karena adanya perubahan nukleotida. (Gambar 6). Analisis Filogenetik A. cerana Analisis filogenetik dilakukan dengan menggunakan program PAUP 4.10 (PPC) versi Macintosh. Dari hasil analisis didapat bahwa urutan nukleotida dari koloni A. cerana yang dianalisis lebih didominasi oleh nukleo- tida A (43.834%) dan T (42.103%) (Tabel 6). Jarak genetik terbesar terjadi antara AF dan AcLb4 dengan nilai 3.53%, sedangkan nilai genetik terkecil terjadi antara AcPt1 dan AcSbw5 dengan nilai 0.00% (Tabel 7). Rasio substitusi transisi terhadap tranversi antar pasangan koloni menunjukkan nilai tertinggi yaitu 2.20%, antara AF dan AcFlr3. Sedangkan nilai terendah yaitu 0.00%, antara AcLb4 dan ACLb21. Total rasio transisi terhadap transversi yaitu 66.67% untuk ts/tv >1 dan 26.67% untuk ts/tv <1 (Lampiran 3). Konstruksi pohon filogenetik dilakukan berdasarkan urutan nukleotida gen lrrna A. cerana dengan metode Maximum Parsimony (MP) (Gambar 7a-c) dan Neighbour Joining (NJ) (Gambar 7d). Dari hasil analisis dengan menggunakan MP, terdapat 512 karakter yang konstan, 69 karakter yang parsimony uninformative, dan hanya 21 karakter yang parsimony informative. Tabel 5 Persentase haplotipe A. cerana Lombok, Sumbawa, dan Flores Lokasi Jumlah koloni (a) Persentase haplotipe (%) Jumlah koloni (b) Persentase haplotipe (a-b) (%) A C A C A C A C Lombok Sumbawa Flores Ket : (a) data hasil penelitian tahun 2007; (b): data hasil penelitian Apriani (2006) AcLb4 AATTTAATCATTATCACTATATTTTTTAAATTAAAATATATATTTTTATAGAATTAATAA 297 AcLb21 AATTTAATCATTATCACTATATTTTAAAAATTAAAATATATATTTTTATAGAATTAATAA 297 AF AATTTAATCATTATCACTATATTTCAAAAATTAAAATATATATTTTTATAGAATAAATAA 297 AF AATTTAATCATTATCACTATATTTTAAAAATTAAAATATATATTTTTATAGAATAAATAA 297 AF AATTTAATCATTATCACTATATCTTAAAAATTAAAATATATGTTTTTATAGAATAAATAA 297 AcPt1 AATTTAATCATTATCACTATATTTTAAAAATTAAAATATATATTTTTATAGAATAAATAA 300 AcSbw5 AATTTAATCATTATCACTATATTTTAAAAATTAAAATATATATTTTTATAGAATAAATAA 300 AcFlr3 AATTTAATCATTATCACTATATTTTAAAAATTAAAATATATATTTTTATAGAATAAATAA 297 AcFlr4 AATTTAATCATTATCACTATATTTTAAAAATTAAAATATATATTTTTATAGAATAAATAA 299 L06178 AATCTAATCACTATTTCTATATTTTATTAATTAAAATATAAATTTTTATAGAA-AAATAA 288 *** ****** *** ****** * ************ *********** ***** AcLb4 AATTTAAAATTTAAATTTTTAAAAA-TTAATAAC--TAAATTATTAAATTTTTTATATTA 354 AcLb21 AATTTAAAATTTAAATTTTTAAAAA-TTAATAAC--TAAATTATTAAATTTTTTATATTA 354 AF AATTTAAAATTTAAATTTTTTAAA--TTAATAAC--TAAATTATTAAATTTTTTATATTA 353 AF AATTTAAAATTTAAATTTTTTAAA--TTAATAAC--TAAATTATTAAATTTTTTATATTA 353 AF AATTCAAAATTTAAATTTTTAAAAA-TTAATAAC--TAAATTATTAAATTTTTTATATTA 354 AcPt1 AACTTAAAATTTAAATTTTTTAAAAATTAATAAC--TAAATTATTAAATTTTTTATATTA 358 AcSbw5 AACTTAAAATTTAAATTTTTTAAAAATTAATAAC--TAAATTATTAAATTTTTTATATTA 358 AcFlr3 AACTTAAAATTTAAATTTTTTTAAAATTAATAAC--TAAATTATTAAATTTTTTATATTA 355 AcFlr4 AACTTAAAATTTAAATTTTTTTAAAATTAATAAC--TAAATTATTAAATTTTTTATATTA 357 L06178 AATATAAA-TTTAAATCATTATTAATTTATAAATATTAAATTATTAAATTATTAAAATTA 347 ** *** ******* ** * *** ** ************** ** * ****

16 8 AcLb4 ATAAAAAATATTAATTTCATAATATTATAAATAAAATTAAAAATTTTTATAAATAAATTT 414 AcLb21 ATAAAAAATATTAATTTCATAATATTATAAATAAAATTAAAAATTTTTATAAATAAATTT 414 AF ATAAAAAATATTAACTTCATAATATTATAAATAAAATCAAAAATTTTTATAAATAAATTT 413 AF ATAAAAAATATTAACTTCATAATATTATAAATAAAATCAAAAATTTTTATAAATAAATTT 413 AF ATAAAAAATATTAACTTCATAATATTATAAATAAAATCAAAAATTTTTATAAATAAATTT 414 AcPt1 ATAAAAAATATTAACTTCATAATATTATAAATAAAATCAAAAATTTTTATAAATAAATTT 418 AcSbw5 ATAAAAAATATTAACTTCATAATATTATAAATAAAATCAAAAATTTTTATAAATAAATTT 418 AcFlr3 ATAAAAAATATTAATTTCATAATATTATAAATAAAATCAAAAATTTTTATAAATAAATTT 415 AcFlr4 ATAAAAAATATTAATTTCATAATATTATAAATAAAATCAAAAATTTTTATAAATAAATTT 417 L06178 AAGAAAAATATTATCTCTATAACATTAAAAATTAAAATTAAA-TTTTTATCT-TAAATTT 405 * ********** * **** **** **** *** *** ******* ******* AcLb4 ATAGTTTATCCCATAAATTTTTAATATAAAAATTAATATCATAAA-TAAATTTTAATGTA 473 AcLb21 ATAGTTTATCCCATAAATTTTTAATATAAAAATTAATATCATAAA-TAAATTTTAATGTA 473 AF ATAGTTTATCCCATAAATTTTTAATATAAAAATTAATACTATAAA-TAAATTTTAATGTA 472 AF ATAGTTTATCCCATAAATTTTTAATATAAAAATTAATACTATAAA-TAAATTTTAATGTA 472 AF ATAGTTTATCCCATAAATTTTTAATATAAAAATTAATACTATAAA-TAAATTTTAAGGTA 473 AcPt1 ATAGTTTATCCCATAAATTTTTAATATAAAAATTAATACTATAAA-TAAATTTTAATGTA 477 AcSbw5 ATAGTTTATCCCATAAATTTTTAATATAAAAATTAATACTATAAA-TAAATTTTAATGTA 477 AcFlr3 ATAGTTTATCCCATAAATTTTTAATATAAAAATTAATACTATAAA-TAAATTTTAATGTA 474 AcFlr4 ATAGTTTATCCCATAAATTTTTAATATAAAAATTAATACTATAAA-TAAATTTTAATGTA 476 L06178 ATAGATTATCCCATAAATTTTTAATATAAAAATTAATAAATTAAAATAAAATTTAATTTA 465 **** ********************************* **** **** ***** ** AcLb4 TTAAAAATTTTATATCTAAATTAAATTTATTTCTAAAAAAACTAGATATCAATAAGTTCG 533 AcLb21 TTAAAAATTTTATATCTAAATTAAATTTATTTCTAAAAAAACTAGATATCAATAAGTTCG 533 AF TTAAAAATTTTATATCTAAATTAAATTTATTTCTAAAAAAACTAGATATCAATAACTTCG 532 AF TTAAAAATTTTATATCTAAATTAAATTTATTTCTAAAAAAACTAGATATCAATAACTTCG 532 AF TTAAAAATTTTATATCTAAATTAAATTTATTTCTAAAAAAACTAGATATCAATAACTTCG 533 AcPt1 TTAAAAATTTTATATCTAAATTAAATTTATTTCTAAAAAAACTAGATATCAATAAGTTCG 537 AcSbw5 TTAAAAATTTTATATCTAAATTAAATTTATTTCTAAAAAAACTAGATATCAATAAGTTCG 537 AcFlr3 TTAAAAATTTTATATCTAAATTAAATTTATTTCTAAAAAAACTAGATATTAATAAGTTCG 534 AcFlr4 TTAAAAATTTTATATCTAAATTAAATTTATTTCTAAAAAAACTAGATATTAATAAGTTCG 536 L06178 CTAAAATAATTATATCTAAATTAAATTTATTTCTAAAAAAACTAGATATTAATAAGTTCG 525 ***** **************************************** ***** **** Gambar 6 Homologi urutan nukleotida gen lrrna A. cerana. AcLb21, AcSbw5, AcFlr3, dan AcFlr4: hasil penelitian ini. AF140508, AF140509, dan AF140511: Sittipraneed (2001), AcPt1 dan AcLb4: Apriani (2006), Amel_lrRNA: urutan nukleotida lrrna Apis mellifera (Acc number: L06178). TTT/AAA: situs restriksi DraI, *: homologi nukleotida. Tabel 6 Persentase nukleotida A. cerana lrrna/drai Taxon A C G T Tabel 7 Jarak genetik antar koloni A. cerana lrrna/drai AcLb4-2 AcLb AF AF AF AcPt AcSbw AcFlr AcFlr L

17 9 73 AF AcPt1 71 AF AcSbw5 41 AF AcFlr AcPt1 AcSbw AcFlr4 AF AcLb21 AcLb AF AF AcFlr3 88 AcLb21 AcFlr4 AcLb4 (a) L06178 (b) L AF AcLb21 71 AF AcLb4 41 AF AF AcPt1 AcSbw AF AcFlr3 AcFlr AcPt1 AF AcLb21 AcLb4 93 AcSbw5 AcFlr3 AcFlr4 (c) L06178 (d) L06178 Gambar 7 Konstruksi pohon filogeni A. cerana gen lrrna berdasarkan Maximum Parsimony (Gambar a-c) dan Neighbour Joining (Gambar d), angka di atas nodus menyatakan nilai bootstrap 100x. AcLb21, AcSbw5, AcFlr3, dan AcFlr4: hasil penelitian ini. AF140508, AF140509, dan AF140511: Sittipraneed (2001), AcPt1 dan AcLb4: Apriani (2006), L06178: urutan nukleotida lrrna Apis mellifera.

18 10 PEMBAHASAN Distribusi A. cerana Lebah madu A. cerana merupakan lebah lokal Asia dengan persebaran yang sangat luas. Berdasarkan Smith (2000), persebaran A. cerana di Indonesia mencapai kepulauan Timor. Hal itu sesuai dengan hasil koleksi pada penelitian ini, yaitu dengan ditemukannya A. c. indica di Flores Lebah ini merupakan lebah terbanyak kedua yang dibudidayakan oleh masyarakat Indonesia setelah A. mellifera, sehingga data mengenai distribusi dan keragaman genetik A. cerana perlu dieksplorasi, untuk memberikan gambaran mengenai keragaman dari A. cerana di Indonesia. Analisis Keragaman Genetik lrrna dan cox 1-2 A. c. indica DNA mitokondria (mtdna) merupakan informasi genetik yang hanya diturunkan secara maternal. DNA ini banyak digunakan untuk mempelajari tentang aliran gen dan keragaman populasi. Berdasarkan Crozier & Crozier (1993), persentase AT pada mtdna sangat tinggi yaitu 83.33%. Persentase yang tinggi juga diperoleh pada penelitian ini yaitu 88.90%. Salah satu gen yang digunakan pada analisis mtdna adalah gen large ribosomal RNA (lrrna). Gen ini umum digunakan karena tidak menyandikan protein dan memiliki laju mutasi yang tinggi. Analisis keragaman genetik dengan menggunakan analisis gen lrrna telah banyak dilakukan di antaranya di Thailand oleh Sihanuntavong et al. (1999) dan Sittipraneed et al. (2001). Di Indonesia, penelitian mengenai keragaman genetik A. cerana dengan menggunakan analisis gen lrrna/drai telah dilakukan oleh Raffiudin & Hadi (2006) terhadap 97 koloni asal Jawa, Kalimantan, Lombok, dan Sumbawa (penelitian pendahuluan untuk tahun 2007). Keragaman genetik A. c. indica asal Lombok, Sumbawa, dan Flores dengan analisis gen lrrna/drai ditemukan dua haplotipe yaitu haplotipe A dan C (penamaan berdasarkan Raffiudin & Hadi (2006)). Berdasarkan peta restriksi, diperoleh enam pita DNA untuk haplotipe A dengan ukuran 9, 47, 79, 91, 95, dan 278 pb, sedangkan pada haplotipe C terdapat tujuh pita dengan ukuran 7, 8, 38, 79, 91, 94, dan 278 pb. Haplotipe A pada penelitian ini hampir sama dengan haplotipe C pada penelitian Sihanuntavong et al. (1999). Hal itu dapat dilihat dari ukuran pita DNA hasil pemotongan lrrna/drai yaitu 8, 91, 94, 124, dan 278 pb. Untuk mendapatkan data yang lebih informatif mengenai keragaman genetika A. c. indica asal Lombok, Sumbawa dan Flores, dilakukan analisis pada daerah intergenik cox 1-2. Dari hasil analisis dengan menggunakan enzim restriksi DraI, diperoleh lima haplotipe. Keragaman genetik yang diperoleh dari analisis pada daerah intergenik cox 1-2 lebih banyak dibandingkan analisis gen lrrna. Hal itu karena daerah intergenik cox 1-2 memiliki laju mutasi yang lebih tinggi daripada gen lrrna. Persentase Haplotipe A. c. indica Haplotipe A merupakan haplotipe umum yang ditemukan pada koloni asal Lombok, Sumbawa, dan Flores. Hal itu dibuktikan melalui perhitungan persentase terhadap kedua haplotipe. Berdasarkan perhitungan persentase, haplotipe A memiliki persentase sebesar 72.72% (Lombok), 100% (Sumbawa), dan 50% (Flores), sedangkan haplotipe C memiliki persentase sebesar 27.28% (Lombok) dan 50% (Flores). Perhitungan tersebut mempengaruhi persentase haplotipe A. c. indica Lombok, dan Sumbawa pada penelitian sebelumnya (Apriani 2006). Dengan adanya penambahan jumlah koloni yaitu tujuh koloni untuk Lombok dan tiga koloni untuk Sumbawa, terjadi perubahan persentase kedua haplotipe. Pada koloni asal Lombok, terjadi peningkatan persentase pada haplotipe A menjadi 75.86%, sedangkan haplotipe C mengalami penurunan menjadi 24.14%. Begitu juga dengan koloni asal Sumbawa, pada haplotipe A terjadi penurunan sebesar 16.67% menjadi 83.33%, sedangkan haplotipe C meningkat menjadi 16.67% (Lampiran 2). Terdapat kesamaan haplotipe antara koloni asal Jawa dengan koloni asal Lombok, Sumbawa, dan Flores (haplotipe A). Hal itu terjadi karena pada awalnya pulau Jawa, Lombok, Sumbawa, dan Flores bersatu dengan Asia membentuk suatu daratan (Hall 1997). Karena itulah terjadi aliran gen dari pulau Jawa sampai Flores. Variasi Nukleotida lrrna A. c. indica Hasil alignment DNA dengan haplotipe hasil Sittipraneed et al. (2001), haplotipe Apriani (2006), dan urutan nukleotida

19 11 A. mellifera (Acc number: L06178) menunjukkan persamaan dan perbedaan situs pemotongan enzim restriksi. Terdapat tiga situs pemotongan enzim restriksi yang berbeda, yaitu pada posisi 260, 300, dan 315 pada AcLb21. Perbedaan situs pemotongan enzim restriksi terjadi karena adanya perubahan nukleotida. Perubahan tersebut dapat terjadi karena adanya mutasi, seperti transversi (purin pirimidin), transisi (purin purin atau pirimidin pirimidin), delesi, dan insersi. Analisis Pohon Filogeni Hasil analisis karakterisasi gen lrrna menunjukkan nukleotida A dan T lebih mendominasi urutan nukleotida pada setiap koloni dengan nilai % dan %. Berdasarkan Saccone et al. (1999), komposisi A+T sangat tinggi pada genom serangga dan nematoda. Perbedaan nukleotida yang terjadi pada semua koloni lebih didominasi oleh transisi. Hal itu dapat dilihat dari nilai rasio subtitusi transisi terhadap transversi. Dari hasil perhitungan, nilai rasio transisi terhadap transversi (ts/tv) terbesar terjadi antara AF dan AcFlr4 sebesar 2.20%, sedangkan nilai ts/tv terkecil terjadi antara AcLb4 dan AcLb21 sebesar 0.00%. Total rasio yang diperoleh untuk ts/tv >1 sebesar 66.67% dan untuk ts/tv <1 sebesar 26.67%. Jarak genetik terbesar terjadi antara AF dan AcLb4 dengan nilai 3.53%, sedangkan nilai genetik terkecil terjadi antara AcPt1 dan AcSbw5 dengan nilai 0.00%. Konstruksi yang dilakukan dengan menggunakan Maximum Parsimony menghasilkan tiga pohon dengan topologi yang berbeda. Perbedaan tersebut dapat dilihat dari koloni yang menempati bagian basal di dalam ingroup. Pada pohon (a), posisi basal di dalam ingroup ditempati oleh AcFlr3 dan AcFlr4, sedangkan pada pohon (b) dan (c) ditempati oleh AcLb4 dan AcLb21. Adanya perbedaan tersebut dikarenakan analisis ini hanya berdasarkan satu gen saja. Berdasarkan Cao et al. (1994), analisis dengan menggunakan set data yang besar dapat memberikan hasil yang lebih kuat dibandingkan dengan analisis berdasarkan gen tunggal. Akan tetapi, dari ketiga pohon tersebut terdapat kesamaan bahwa koloni A. cerana asal Thailand (AF140508, AF140509, dan AF140511) membentuk cluster tersendiri yang terpisah dengan koloni asal Indonesia. SIMPULAN Koleksi A. c. indica dilakukan di tujuh kecamatan di Lombok, tiga desa di Sumbawa, dan tiga desa di Flores. Budidaya lebah A. c. indica di Lombok umumnya dikelola oleh peternakan keluarga, sedangkan A. c. indica diternakkan secara liar di Sumbawa dan Flores. Ukuran nukleotida gen lrrna yang diamplifikasi berkisar antara pb dengan basa AT sekitar 88.90%. Berdasarkan analisis lrrna/drai, ditemukan dua haplotipe yaitu haplotipe A dan C. Persentase haplotipe A sebesar 72.72, 100, dan 50%, berturut turut untuk populasi A. c. indica di Lombok, Sumbawa, dan Flores. Persentase haplotipe C sebesar dan 50% untuk A. c. indica di Lombok dan Flores. Analisis filogeni berdasarkan gen lrrna menggunakan Maximum Parsimony menunjukkan bahwa populasi lebah di Thailand membentuk kelompok yang terpisah dengan A. cerana di Indonesia. Jarak genetik terbesar (3.53%) terjadi antara AF (A. cerana asal Thailand) dan AcLb4 (asal Lombok), sedangkan nilai jarak genetik terkecil (0.00%) terjadi antara AcPt1 (Pati) dan AcSbw5 (Sumbawa). Nilai rasio transisi terhadap tranversi (ts/tv), untuk ts/tv >1 sebesar 66.67% dan untuk ts/tv <1 sebesar 26.67%. SARAN Perlu adanya penelitian selanjutnya dengan memperluas daerah pengambilan sampel terutama pada daerah-daerah yang belum dieksplorasi, seperti Sumatra, Kalimantan, Bali, Sulawesi, dan Timor. Sehingga data mengenai distribusi dan variasi genetika dari lebah madu A. c. indica di Indonesia lebih lengkap. DAFTAR PUSTAKA Apriani Keragaman genetik lebah madu A. cerana di Indonesia berdasarkan DNA mitokondria gen ribosoma besar (lrrna) [Skripsi]. Departemen Biologi. Institut Pertanian Bogor: Bogor. Cao Y, Adachi A, Janke A, Paabo S, Hasegawa M Phylogenetic relationship among eutherian orders estimated from inferred protein sequences of mitochondrial proteins: instability of a tree based on a single gene. J Mol Evol 39:

20 12 Crozier RH, Crozier YC The mitochondrial genome of the honeybee Apis mellifera L: complete sequence and genome organization. Genetics 133: Deowanish S, Nakamura J, Matsuka M, Kimura K MtDNA variation among subspesies of Apis cerana using restriction fragment length polymorphism. Apidologie 27: Hall R Reconstructing cenozoic South East Asia. Geological Soc London Spec Publ 106: Michener CD The Bees of The World. London: The Johns Hopkins Univ Pr. Morse RA, Flottum K, editor Honey bee Pests, Predators, and Diseases. 3rd Ed. Root Company. Raffiudin R, Hadi I Diferensiasi DNA mitokondria lebah madu Apis cerana di Jawa, Lombok, Sumbawa, dan Flores. Laporan Penelitian Fundamental Tahun I. Ditjen Pendidikan Tinggi. Ruttner F Biogeography and Taxonomy of Honeybees. Springer-Verlag: Berlin. Saccone C, De Giorgi C, Gissi C, Pesole G, Reyes A Evolutionary genomics in Metazoa: the mitochondrial DNA as a model system. Gene 238: Sambrooks J, Fritsch EF, Maniatis T Molecular Cloning a Laboratory Manual. Ed ke 2. New York: Cold Spring Harbor Lab Pr. Sihanuntavong D, Sittipraneed S, Klinbunga S Mitochondrial DNA diversity and population structure of the honey bee, Apis cerana in Thailand. J Apic Res 38: Sittipraneed S. Sihanuntavong D, Klinbunga S Genetic differentiation of honeybee (Apis cerana) in Thailand revealed by polymorphism of a large subunit of mitochondrial ribosomal DNA. J Insect Soc 48: Smith D.R, Villafuerte L, Otis G, Palmer M.R Biogeography of Apis cerana F and A. nigrocincta Smith: insight from mtdna studies. Apidologie 21: Tegelstrom H Mitochondrial DNA in natural population: an improved routine for screening of genetic variation based on sensitive silver staining. Electrophoresis 7: Winston LM The Biology of the Honeybee. Cambridge: Harvard Univ Pr.

21 LAMPIRAN

22 14 Lampiran 1 Daerah koleksi A. c. indica Lombok dan Sumbawa (Apriani 2006) a. Lombok No Kode Sampel Lokasi 1 Ac Lb 4 Mataram, Kec. Selaparang, Mataram 2 Ac Lb 5 Trunojoyo, Kec. Ampenan, kodya Mataram 3 Ac Lb 6 Gomong, Kec. Mataram Barat, Kodya Mataram 4 Ac Lb 7 Bertais, Kec. Cakranegara, Kodya Mataram 5 Ac Lb 8 Jorong, Kelayu, Kec. Mataram Barat, Kodya Mataram 6 Ac Lb 9 Gomong, Kec. Mataram Barat, Kodya Mataram 7 Ac Lb 10 Kec. Selong, Kab. Lombok Timur Ketinggian Koordinat (meter) Jumlah Koloni b. Sumbawa Kode No Sampel 1 Ac Sb 1 2 Ac Sb 2 3 Ac Sb 3 Lokasi Desa Jorok, Kec. Unteriwes, Kab. Sumbawa Kec. Moyo Utara, Olat Rawa, Kab. Sumbawa Dusun Rapit Doya, Kec. Unteriwes, Kab. Sumbawa Koordinat Ketinggian (meter) Jumlah Koloni

23 Lampiran 2 Peta persebaran A. cerana di Indonesia berdasarkan lrrna/drai ( ) D 100% B 1.53% A 94.46% 24.14% 75.86% C A 16.67% 50% C A A C 83.33% 50%

24 Lampiran 3 Rasio substitusi transisi dengan transversi ---ti tv ident prop ti/tv Taxa AG CT AC AT CG GT AA CC GG TT diff ratio total AcLb4 vs. AcLb AcLb4 vs. AF AcLb4 vs. AF AcLb4 vs. AF AcLb4 vs. AcPt AcLb4 vs. AcSbw AcLb4 vs. AcFlr AcLb4 vs. AcFlr AcLb4 vs. L AcLb21 vs. AF AcLb21 vs. AF AcLb21 vs. AF AcLb21 vs. AcPt AcLb21 vs. AcSbw AcLb21 vs. AcFlr AcLb21 vs. AcFlr AcLb21 vs. L AF vs. AF AF vs. AF AF vs. AcPt AF vs. AcSbw AF vs. AcFlr AF vs. AcFlr AF vs. L AF vs. AF AF vs. AcPt AF vs. AcSbw AF vs. AcFlr AF vs. AcFlr AF vs. L AF vs. AcPt AF vs.

25 17 Lampiran 3 (Lanjutan) AcSbw AF vs. AcFlr AF vs. AcFlr AF vs. L AcPt1 vs. AcSbw AcPt1 vs. AcFlr AcPt1 vs. AcFlr AcPt1 vs. L AcSbw5 vs. AcFlr AcSbw5 vs. AcFlr AcSbw5 vs. L AcFlr3 vs. AcFlr AcFlr3 vs. L AcFlr4 vs. L

26 Lampiran 4 Kromatogram hasil pengurutan DNA A. c. indica (AcSbw5) menggunakan primer For lrrna

27 Lampiran 5 Kromatogram hasil pengurutan DNA A. c. indica (AcSbw5) menggunakan primer Rev lrrna

28 Lampiran 6 Kromatogram hasil pengurutan DNA A. c. indica (AcLb21) menggunakan primer For lrrna

29 Lampiran 7 Kromatogram hasil pengurutan DNA A. c. indica (AcLb21) menggunakan primer Rev lrrna