GAMBARAN RESTRICTION FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM (RFLP) GEN SITOKROM b DNA MITOKONDRIA DARI SEMBILAN SPESIES IKAN AIR TAWAR KONSUMSI DENNY SAPUTRA

Transkripsi

1 GAMBARAN RESTRICTION FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM (RFLP) GEN SITOKROM b DNA MITOKONDRIA DARI SEMBILAN SPESIES IKAN AIR TAWAR KONSUMSI DENNY SAPUTRA FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2009

2 PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI Saya menyatakan bahwa skripsi dengan judul Gambaran Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) Gen Sitokrom b DNA Mitokondria dari Sembilan Spesies Ikan Air Tawar Konsumsi adalah karya sendiri dengan arahan pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam daftar pustaka di bagian akhir skripsi. Bogor, Agustus 2009 Denny Saputra B

3 ABSTRAK DENNY SAPUTRA. Gambaran Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) Gen Sitokrom b DNA Mitokondria dari Sembilan Spesies Ikan Air Tawar Konsumsi. Dibimbing oleh ITA DJUWITA dan WAHONO ESTHI PRASETYANINGTYAS. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui data dasar fragmen restriksi dari sembilan spesies ikan air tawar berdasarkan variasi genetik yang terdapat pada daerah sitokrom b DNA mitokodria melalui metode Polymerase Chain Reaction- Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP). Jenis sampel yang digunakan berupa jaringan ikan. Sebagai media transport dan preservasi, sampel disimpan dalam NaCl 4,5 M yang mengandung DMSO 25 %. Ekstraksi DNA mitokondria dari jaringan menggunakan metode presipitasi amonium asetat, dilanjutkan dengan amplifikasi fragmen DNA mitokondria melalui metode PCR menggunakan primer universal sitokrom b L14841/H Amplikon yang diperoleh dari metode PCR, selanjutnya dipotong dengan enzim restriksi. Pemotongan fragmen DNA metode RFLP menggunakan enzim restriksi endonuklease Hinf I dan Rsa I masing-masing selama 2 jam dan 6 jam. Pemeriksaan fragmen DNA dengan elektroforesis gel agarose 2%, lalu dilanjutkan analisis hasil penghitungan ukuran fragmen restriksi dari setiap spesies dengan mengukur jarak antara migrasi DNA sampel dengan migrasi DNA ladder. Hasil penelitian menunjukkan bahwa PCR menggunakan primer universal sitokrom b dari kesembilan spesies ikan didapatkan amplikon sitokrom b berukuran 359 pasang basa (pb). Amplikon sitokrom b dari kesembilan spesies ikan memiliki situs restriksi Hinf I dan atau Rsa I, kecuali amplikon sitokrom b ikan sepat. Terdapat perbedaan ukuran fragmen restriksi (RFLP) hasil pemotongan baik dengan enzim Hinf I maupun Rsa I kecuali pada amplikon sitokrom b ikan patin. Hasil penelitian ini dapat disimpulkan bahwa metode PCR menggunakan primer universal sitokrom b serta pemotongan fragmen dengan enzim restriksi Hinf I dan RSA I dapat digunakan untuk mengenali kesembilan spesies ikan air tawar. Kata kunci: ikan air tawar, sitokrom b, PCR, RFLP

4 ABSTRACT DENNY SAPUTRA. The Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) of Mitochondrial DNA Cytochrome b Gene from Nine Species of Fresh Water Fish. Under direction of ITA DJUWITA and WAHONO ESTHI PRASETYANINGTYAS The aim of this research is to study the basic data of restriction fragment from nine fresh water fish species based on cytochrome b mitochondria DNA genetic variation using PCR-RFLP method. Fish body tissues were collected in 4,5 M NaCl containing 25 % DMSO as sampel transport and preservation media. Mitochondrial DNA extraction were done using ammonium acetate precipitation method followed by PCR fragment amplification using universal cytochrome b L14841/H15149 primers. The amplicons were cut with Hinf I and Rsa I endonuclease restriction enzymes for 2 and 6 hours respectively, DNA fragments examination were done on 2% agarose gel electrophoresis, and the result were analyzed to determine the restriction fragment polymorphism from each species by measuring the migration distance between sample DNA and ladder DNA. The results showed that nine fresh water fish species have 359 base pair (bp) amplicon. Cytochrome b amplicon of nine fish species have Hinf I and or Rsa I restriction site, except cytochrome b amplicon of sepat. There were differences on restriction fragment sizes result from Hinf I or Rsa I digestion, except cytochrome b amplicon of patin. In conclusion, universal oligonucleotida cytochrome b primer followed by digestion with Hinf I and or Rsa I restriction enzymes can be used for the nine fresh water fish species recognition. Keywords : fresh water fish, cytochrome b, PCR, RFLP

5 RINGKASAN DENNY SAPUTRA. Gambaran Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) Gen Sitokrom b DNA Mitokondria dari Sembilan Spesies Ikan Air Tawar Konsumsi. Dibimbing oleh ITA DJUWITA dan WAHONO ESTHI PRASETYANINGTYAS. Indonesia memiliki banyak kekayaan alam baik hayati maupun hewani. Sumber protein hewani bisa didapatkan dari mengkonsumsi ikan. Kekayaan jenis ikan di Indonesia sangat berlimpah, namun demikian informasi tentang keragaman variasi genetik jenis ikan di Indonesia belum banyak dipelajari. Salah satu cara untuk mengetahui data molekuler spesies hewan adalah dengan menggunakan metode Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP) berdasarkan gen sitokrom b DNA Mitokondria. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui data dasar fragmen restriksi dari sembilan spesies ikan air tawar konsumsi berdasarkan variasi genetik yang terdapat pada daerah sitokrom b DNA mitokodria melalui metode PCR-RFLP. Jenis sampel yang digunakan berupa jaringan ikan. Sampel ikan air tawar yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: ikan patin (Pangasius hypophthalmus), nila (Oreochromis niloticus), lele (Clarias sp.), sepat (Trichogaster pectoralis), sapu-sapu (Hypostomus sp.), mujair (Oreochromis mossambicus), mas (Cyprinus carpio), gurami (Osphronemus gouramy), dan bawal (Colossoma macropomum). Sebagai media transport dan preservasi, sampel disimpan dalam NaCl 4,5 M yang mengandung DMSO 25 %. Ekstraksi DNA mitokondria dari jaringan menggunakan metode presipitasi amonium asetat, dilanjutkan dengan amplifikasi fragmen DNA mitokondria melalui metode PCR menggunakan primer universal sitokrom b L14841/H Komposisi reaksi PCR adalah sebagai berikut: apabila digunakan sampel hasil ekstraksi DNA sebanyak [1 μl/50 ng] maka secara berurutan reagen yang dicampurkan ke dalam tabung PCR adalah ddh 2 O sebanyak 16,55 μl, kemudian dicampurkan dengan buffer 10 X sebanyak 2,5 μl, lalu dicampurkan dntp sebanyak 2 mm. Setelah itu, dimasukkan primer 1 dan 2 masing-masing sebanyak 1 μl, dan selanjutnya dimasukkan Taq polimerase sebanyak 2,5 unit, serta dicampurkan DNA template (DNA sampel) sebanyak ± 100 ng (volume total untuk satu kali reaksi dalam PCR ini adalah 25 μl). Amplikon yang diperoleh dari metode PCR, selanjutnya dipotong dengan enzim restriksi. Pemotongan fragmen DNA metode RFLP menggunakan enzim restriksi endonuklease Hinf I dan Rsa I. Komposisi reaksi RFLP adalah sebagai berikut: beberapa reagen yang digunakan dalam pemotongan DNA hasil PCR dengan Hinf I secara berurutan adalah ddh 2 O sebanyak 12,25 μl, kemudian larutan buffer sebanyak 2,5 μl, setelah itu dicampurkan enzim Hinf I sebanyak 2,5 unit, serta DNA hasil PCR sebanyak 10 μl [1 μl/50 ng] (volume total dalam pemotongan dengan Hinf I ini adalah 25 μl). Beberapa reagen yang digunakan dalam pemotongan DNA hasil PCR dengan Rsa I secara berurutan adalah ddh2o sebanyak 10,5 μl, kemudian larutan buffer sebanyak 2,5 μl, setelah itu dicampurkan enzim Rsa I sebanyak 20 unit, serta DNA hasil PCR sebanyak sebanyak 10 μl [1 μl/50 ng] (volume total dalam pemotongan DNA hasil PCR dengan Rsa I adalah 25μl). DNA hasil PCR yang dipotong selanjutnya diinkubasi

6 pada suhu 37 C selama 2 jam untuk pemotongan dengan Hinf I dan selama 6 jam untuk pemotongan dengan Rsa I, lalu dilakukan pembacaan hasil dengan elektroforesis. Pemeriksaan fragmen DNA dengan elektroforesis gel agarose 2%, lalu dilanjutkan analisis hasil penghitungan ukuran fragmen restriksi dari setiap spesies dengan mengukur jarak antara migrasi DNA sampel dengan migrasi marka DNA. Hasil penelitian menunjukkan bahwa PCR menggunakan primer universal sitokrom b dari kesembilan spesies ikan didapatkan amplikon sitokrom b berukuran 359 pasang basa (pb). Pemotongan menggunakan enzim restriksi endonuklease Hinf I menghasilkan fragmen restriksi kecuali pada ikan sapu-sapu, mas, mujair, dan sepat. Pemotongan menggunakan enzim restriksi endonuklease Rsa I menghasilkan fragmen restriksi kecuali pada ikan sepat. Ikan patin, lele, sapu-sapu memiliki ciri morfologi dan taksonomi yang hampir sama, tetapi apabila dipotong dengan enzim restriksi endonuklease Hinf I dan Rsa I ternyata memiliki situs pemotongan yang berbeda. Ikan patin dan ikan lele memiliki ciri morfologi yang hampir sama, ternyata memiliki situs pemotongan yang hampir sama untuk pemotongan dengan menggunakan Hinf I, sehingga untuk keperluan identifikasi lebih baik menggunakan enzim Rsa I untuk membedakan antara ikan patin dengan ikan lele, kerena memiliki situs restriksi yang jauh berbeda. Ikan mas dan ikan bawal memiliki ciri morfologi yang berbeda, hal ini diikuti pula situs pemotongan Hinf I dan Rsa I yang jauh berbeda, sehingga kedua enzim tersebut dapat digunakan untuk membedakan kedua ikan tersebut dengan ikan yang lain. Ikan mujair dan ikan nila yang memiliki kemiripan morfologi dan pesamaan taksonomi sampai tingkat genus, ternyata memiliki situs pemotongan yang jauh berbeda jika dipotong dengan menggunakan enzim Hinf I dan Rsa I. Hal ini dapat dikatakan bahwa kedua enzim tersebut dapat digunakan untuk membedakan antara ikan mujair dengan ikan nila. Ikan gurami dan ikan sepat tidak memiliki kemiripan morfologi tetapi memiliki persamaan taksonomi sampai tingkat famili, ternyata memiliki hasil pemotongan yang berbeda jika dipotong dengan menggunakan enzim Hinf I dan Rsa I sehingga kedua enzim tersebut dapat digunakan untuk membedakan antara kedua ikan tersebut. Amplikon ikan sepat ternyata tidak memiliki situs restriksi pada gen sitokrom b DNA mitokondria, sehingga dibutuhkan enzim lain untuk menemukan situs pemotongan. Hasil penelitian ini dapat disimpulkan bahwa metode PCR menggunakan primer universal sitokrom b serta pemotongan fragmen dengan enzim restriksi Hinf I dan Rsa I dapat digunakan untuk mengenali kesembilan spesies ikan air tawar. Kata kunci: ikan air tawar, sitokrom b, PCR, RFLP

7 Hak Cipta milik IPB, tahun 2009 Hak Cipta dilindungi Undang-Undang Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh Karya tulis dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

8 GAMBARAN RESTRICTION FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM (RFLP) GEN SITOKROM b DNA MITOKONDRIA DARI SEMBILAN SPESIES IKAN AIR TAWAR KONSUMSI DENNY SAPUTRA Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Kedokteran Hewan pada Fakultas Kedokteran Hewan Bogor FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2009

9 Judul Skripsi Nama NIM : Gambaran Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) Gen Sitokrom b DNA Mitokondria dari Sembilan Spesies Ikan Air Tawar Konsumsi : Denny Saputra : B Disetujui Dr. drh. Hj. Ita Djuwita, M. Phil Ketua drh. Wahono Esthi Prasetyaningtyas, M.Si Anggota Diketahui Dr. Dra. Nastiti Kusumorini Wakil Dekan Fakultas Kedokteran Hewan Tanggal Lulus:

10 PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT atas segenap limpahan karunia yang tak terhitung banyaknya. Shalawat serta salam semoga tetap tercurah kepada Rasulullah SAW. Penyusunan skripsi yang berjudul Gambaran Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) Gen Sitokrom b DNA Mitokondria dari Sembilan Spesies Ikan Air Tawar Konsumsi merupakan salah satu syarat untuk memperoleh gelar sarjana pada Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor. Penulis mengucapkan terima kasih kepada seluruh pihak yang telah membantu dalam penyelesaian skripsi ini, diantaranya kepada: 1. Ibu Dr. drh. Hj. Ita Djuwita, M. Phil dan Ibu drh. Wahono Esthi Prasetyaningtyas, M.Si sebagai pembimbing atas segala saran, kritik, arahan, perbaikan, dan motivasi serta semua ilmu yang telah diberikan. 2. Kedua orang tua, Ayahanda Sumiran S.Pd dan Ibunda Sri Sunarti S.Pd atas segala doa dan apapun yang telah diberikan kepada saya yang tak tak terhitung banyaknya. 3. Ibu drh. Dewi Ratih Agungpriyono Ph.D selaku pembimbing akademik yang telah memberikan bimbingan selama menjalani masa perkuliahan, semangat dan perhatiannya serta telah bersedia mendengarkan keluh kesah selama menjalani hari-hari di FKH IPB. 4. Kedua kakakku mbak Ika dan mbak Novita, keponakanku Tiara, mas Lutvi, dan mas Fajar yang selalu memberikan doa dan perhatiannya. 5. Imma Nur Cahyawati atas semangat yang telah diberikan selama ini. 6. Teman-teman sepenelitian Dicky, Tufi, dan Ruli yang selalu semangat dan membantu. 7. Laboratorium Terpadu Fakultas Kedokteran Hewan yang telah saya gunakan selama penelitian ini sampai selesai. 8. Rekan-rekan FKH angkatan 42 yang tidak dapat disebutkan satu per satu.