Seminar Dewinta G

Transkripsi

1 Seminar Dewinta G Dewinta, Achmad Farajallah, dan Yusli Wardiatno Pola Distribusi Geografis pada Udang Mantis di Pantai Jawa Berdasarkan Genom Mitokondria. Seminar disampaikan tanggal 11 September 2010, Departemen Biologi FMIPA IPB. PENDAHULUAN Latar Belakang Udang mantis atau udang ronggeng merupakan anggota Filum Arthropoda, Subfilum Crustacea, Ordo Stomatopoda, yang terdiri atas empat famili, yaitu Odontodactylidae, Lysiosquillidae, Harpiosquillidae dan Squilidae. Sebagaimana udang pada umumnya, kelompok udang ini dicirikan dengan tubuh yang bersegmen, di belakang kepala terdapat karapas pendek, kaki beruas-ruas, ukuran tubuh yang besar dan mata seringkali berbentuk T (Carpenter dan Niem 1998). Habitat sebagian besar udang mantis adalah pantai, senang hidup di dasar air terutama pasir berlumpur. Cara hidup udang mantis dengan menggali dan bersembunyi di dasar air untuk berburu mangsa. Salah satu udang mantis yang bernilai ekonomi tinggi adalah Harpiosquilla harpax dari Famili Harpiosquillidae. Udang ini diekploitasi untuk diperdagangkan sebagai makanan eksotik. Jenis udang mantis lain yang sering diperdagangkan adalah Lysiosquillina maculata, Squilla empusa, dan S.mantis (Moosa 1997). Karakteristik dari stomatopoda sebagai hewan pemangsa memiliki dua metode untuk menangkap mangsa. Kedua metode inilah yang kemudian akan membedakan kelompok fungsional stomatopoda yang sangat luas, yaitu smashers (galak) dan spearers (sangat baik). H. Harpax sendiri tergolong kedalam spearers (Ahyong 1997). H. harpax banyak ditemukan di Pantai Utara Pulau Jawa, Selat Malaka sampai ke Laut Pasifik (Ahyong et al. 2008). Ciri-ciri H. harpax adalah tubuh terdiri atas tiga bagian yaitu kepala, thoraks dan abdomen, karapas dengan median carina, distal page 1 / 286

2 segmen dari uropod memiliki garis tengah warna putih atau sedikit hitam, carina intermediat tidak terlalu tajam, rostal dilengkapi dengan projeksi anterior, panjang total mencapai 30 cm, mata sangat besar dan berbentuk T, telson berduri dan median carina pada telson memiliki dua bintik hitam (Carpenter dan Niem 1998). Udang betina mampu menelurkan hingga 1 juta telur, yang akan menetas setelah 24 jam menjadi larva nauplius (Choi dan Hong 2001). Tahap perkembangan larva pada udang mantis terdiri dari empat fase. Fase pertama yaitu nauplius, larva nauplius tidak dapat berenang sehingga terbawa arus kemana saja arus bergerak, terutama arus sejajar garis pantai, bermetamorfosis dalam enam stages berkisar selama dua hari. Fase ke dua yaitu protozoea, mempunyai tujuh pasang anggota tubuh, bermetamorfosis dalam tiga stages berkisar selama tujuh hari. Fase ketiga yaitu mysis bermetamorfosis dalam tiga stages berkisar selama tujuh hari. Fase terakhir yaitu postlarva, pada fase ini udang mulai memiliki karakteristik udang dewasa, dilanjuti menjadi juvenil dan udang dewasa (Choi, 2001). Pergerakkan arus ini bergantung kepada arah/sudut gelombang yang datang. Pada kawasan pantai yang diterjang gelombang menyudut, terhadap garis pantai, arus yang dominan terjadi adalah arus sejajar pantai. Pergerakan arus sejajar dengan garis pantai inilah yang menyebabkan pola penyebaran terus mengikuti garis pantai. Persebaran larva yang hanyut terikut arus terus mengalami persebaran yang sangat luas bahkan antar samudera (Barber et al. 2002). Dalam penelitian ini populasi H. harpax berusaha dipelajari menggunakan penanda genetik genom mitokondria, yaitu ruas genom yang dikenal dengan d-loop atau control region. Genom mitokondria hewan merupakan genom sitoplasmik yang diwariskan secara uniparental, dan tidak mengalami rekombinasi. Genom mitokondria atau mtdna terdiri atas 2 gen penyandi rrna, 22 trna, dan 13 gen penyadi protein yang terlibat dalam rangkaian rantai respirasi selular, dan satu ruas yang berfungsi sebagai pengontrol transkripsi yang dikenal sebagai d-loop. Ruas d-loop dikenal mempunyai laju mutasi yang lebih cepat dibanding ruas-ruas gen lainnya, sehingga sangat cocok untuk digunakan sebagai penanda genetik untuk mempelajari fenomena intraspesifik (Cook 2005). Tujuan Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis keragaman genetik udang mantis Harpiosquilla harpax di Pantai Jawa, berdasarkan genom mitokondria. page 2 / 286

3 BAHAN DAN METODE Metode Koleksi Udang dan Identifikasi sampel. Udang mantis H. harpax sebanyak delapan ekor koleksi bapak Dr. Yusli Wardiatno dari Departemen Manajemen Sumberdaya Perairan IPB yang dipreservasi dalam etanol. Kepastian spesies udang mantis sebagai Harpiosquilla harpax diidentifikasi berdasarkan kunci identifikasi (Carpenter dan Niem 1998). Ekstraksi dan Isolasi DNA. Isolasi DNA dilakukan dari otot tungkai. Otot tungkai yang disimpan dalam etanol dicuci dengan air destilata dua kali kemudian dihomogenasi dalam bufer STE (NaCl 1M, Tris-HCL 10mM, EDTA 0.1mM, ph 8). Sel-sel otot dilisis menggunakan proteinase K 0,125 mg/ml dan sodium dodesil sulfat 1%. Metode ekstraksi DNA selanjutnya mengikuti petunjuk Genomic DNA mini kit for fresh blood. Amplifikasi dan Visualisasi Fragmen DNA. Bagian d-loop dari mtdna diamplifikasi menggunakan primer yang didesain menggunakan Primer 3 ( dengan referensi beberapa mtdna anggota stomatopoda yang ada di Gen Bank ( Primer forward AF180berada pada urutan nt dan primer reverse AF181 berada pada urutan terhadap mtdna H.harpax, dengan target DNA hasil amplifikasi berukuran 929 bp. Reaksi PCR dilakukan dalam volume 50 μl. Reaksi PCR dilakukan dengan kondisi predenaturasi pada suhu 94oC selama 5 menit, kemudian dilanjutkan 30 siklus yang terdiri atas denaturasi suhu 94oC selama 1 menit, penempelan primer suhu 54oC selama 1 menit, pemanjangan 72oC selama 2.30 menit dan diakhiri pemanjangan akhir suhu 72oC selama 7 menit. Produk PCR diuji menggunakan PAGE 6%, kemudian dilanjutkan dengan pewarnaan sensitif perak (Tegelstrom 1986). Perunutan Produk PCR dan Analisis DNA Sequencing. Produk PCR berupa pita tunggal di atas gel poliakrilamid dan berukuran sesuai desain primer dimurnikan, untuk dijadikan cetakan dalam PCR for sequencing. PCR untuk page 3 / 286

4 sequencing menggunakan primer yang sama seperti amplifikasi sebelumnya dengan metode big dye terminator cycle sequencing. Runutan nukleotida yang diperoleh kemudian diedit secara manual. Runutan-runutan nukleotida yang telah diedit kemudian saling disejajarkan dengan runutan nukleotida referensi, yaitu H. harpax yang ditangkap dari Pantai Vietnam dengan No akses AY (Miller dan Austin 2006) menggunakan program Clustal W 1.8 yang tertanam dalam program MEGA versi Analisis Filogeni. Analisis keragaman nukleotida dan filogenetik dilakukan menggunakan MEGA (Kumar et al. 2008) berdasarkan model subtitusi Kimura-2 -parameter. Analisis kekerabatan antar sampel menggunakan metode neighbour joining (NJ) dengan bootstrap 1000x. HASIL DAN PEMBAHASAN Identifikasi Hasil identifikasi berdasarkan buku identifikasi Carpenter dan Niem (1998) menunjukkan bahwa sampel udang yang digunakan adalah spesies H. harpax. Amplifikasi dan Visualisasi DNA Dari kedelapan sampel yang digunakan, semuanya berhasil diamplifikasi. Amplifikasi menggunakan pasangan primer AF180 dan AF181 menghasilkan pita tunggal berukuran sekitar 1100bp (Gambar 1). page 4 / 286

5 Gambar 1. Produk PCR berupa pita tunggal yang diuji dengan menggunakan polyacrilamide gel electrophoresis (PAGE) 6%. Keterangan: M = DNA marker 100 bp, No urut sesuai dengan Gambar 2. Perunutan Produk PCR dan Analisis DNA SequencingPanjang basa nukleotida DNA setelah ruas penempelan primer dibuang dan diedit, yakni sekitar 800-an. Setelah disejajarkan, runutan nukleotida yang bisa dilanjutkan dianalisis berada pada posisi nt sampai nt berdasarkan referensi mtdna H. harpax (Miller dan Austin 2006) sepanjang 787 nt. Dari 787 nukleotida, sebanyak 645 nt sama untuk semua sampel. Dari 142 nt yang berbeda, sebanyak 9 nt merupakan insersi/delesi yang hanya ditemukan pada satu sampel dan 84 nt substitusi yang hanya ditemukan pada satu sampel sehingga sebanyak 93 nt tidak diikutkan dalam analisis berikutnya karena tidak bersifat parsimoni. Sisanya sebanyak 49 nt yang terdiri dari dua jenis mutasi, yaitu subsitusi dan insersi/delesi kemudian digunakan dalam menghitung keragaman genetik (Gambar 2). Gambar 2. Runutan nukleotida yang saling berbeda antar sampel yang digunakan dalam analisis keragaman genetik dan membangun pohon filogeni. Nomor urut page 5 / 286

6 nuleotida ditulis secara vertikal (5 baris paling atas) mengacu pada genom mitokondria H. harpax No. akses AY Secara filogeografi H. harpax di Perairan Cirebon terpisah dengan H. harpax di Perairan Vietnam. Hal ini dibuktikkan oleh nilai jarak genetik terjauh adalah antara H. harpax Vietnam dan H. harpax 3 yaitu sebesar 10,5%, sedangkan jarak genetik paling dekat adalah antara H. harpax 1dan 6 (kelompok 1) yaitu sebesar 1,8%. Keragaman genetik H.harpax di Perairan Cirebon berdasarkan ruas d-loop memiliki nilai lebih besar yaitu 5.1% (±0,005) (Tabel 1) bila dibandingkan dengan keragaman genetik Halocyprida sp berdasarkan ruas C01 yaitu sebesar 2,27%. Nilai keragaman genetik d-loop yang lebih besar membuktikkan bahwa ruas d-loop memiliki laju mutasi lebih tinggi dibandingkan ruas-ruas pada mtdna lainnya dan mutasi yang tinggi berbanding lurus dengan tingginya keragaman (Cook 2005). Rata-rata komposisi nukleotida A=41,2% ; T=38,7% ; G=7,9% ; C=12,3%. Persentase A+T (79,9%) lebih besar daripada C+G (20,2%). Banyaknya basa A+T pada genom mitokondria d-loop dibandingkan C+T berkaitan dengan d-loop sebagai promotor titik awal transkripsi bagi utas berat maupun utas ringan (Hoelzoel et al. 1994). Hal lain yang menyebabkan basa AT lebih tinggi disebakan oleh adanya sekuens yang berulang dan panjangnya urutan T (Cook 2005). Analisis Filogeni Topologi pohon filogeni menggunakan metode NJ dengan bootstrap1000x mengelompokkan udang H. Harpax dalam satu percabangan dan H. Harpax Vietnam berada di luar percabangan. Struktur populasi yang digambarkan oleh mtdna ini setidaknya membagi populasi H. harpax di perairan Cirebon menjadi dua yaitu kelompok 1 dan kelompok 2. H. harpax 1,4,6 dan 10 termasuk ke dalam kelompok 1 dan saling berkerabat dekat. H. harpax 2, 3, 5, dan 8 termasuk ke dalam kelompok 2 dan saling berkerabat dekat. Titik nenek moyang (anchestral node) menunjukkan bahwa kekerabatan H. harpax 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8 dan 10 adalah berasal dari satu nenek moyang/indukkan. Sedangkan populasi H harpax dari perairan Cirebon berbeda nenek moyang/indukan dengan H. harpax di perairan Vietnam (Gambar 3). Hal ini disebabkan oleh pola penyebaran udang mantis sangat berkaitan erat dengan arus laut. Arus pada Laut Jawa bergerak ke arah Kalimantan sedangkan arus dari Laut China Selatan bergerak ke Vietnam sehingga pergerakan arus dari Cirebon dan Vietnam tidak searah. Penyebaran udang mantis melalui tingkat larva yang terbawa page 6 / 286

7 arus dan bergerak mengikuti garis pantai. Teluk Vietnam yang berada di sisi utara dari Laut China Selatan tidak terhubung/ saling terpisah dengan Laut Jawa (Cirebon), sehingga memiliki garis pantai yang tidak berhubungan (McCleave et al. 1984). Hal lain yang menyebabkan H. harpax di Perairan Cirebon berbeda nenek moyang/indukkan dengan H. harpax dari Perairan Vietnam adalah arus dari Indo-Pasifik saling berhubungan karena arus yang datang dari Pasifik menuju lautan Indonesia yang juga melewati Vietnam bergerak bolak-balik, hanya saja dikarenakan adanya bencana alam yang pernah terjadi menyebabkan pola penyebaran H. harpax hanya berkisar ±40km, sehingga menyebabkan keragamannya homogen dan pola penyebaran yang terbatas/tidak luas (Barber et al. 2002). Dari data yang ada, kelompok 1 dan 2 mungkin sebagai spesies yang berbeda dalam genus Harpiosquilla. Hal ini diperkuat dengan adanya beberapa perbedaan yaitu seperti intermediat carina pada bagian thoraks tanpa/ dilengkapi dengan duri, dari segi warna ada yang lebih gelap dan terang, dan segmen distal pada uropod ada yang tidak/ bewarna sedikit hitam (data tidak diperlihatkan). Hal ini juga disebabkan oleh spesies H. harpax yang tertangkap di Perairan Cirebon seringkali tertangkap bersamaan dengan H. raphidae. Gambar 3. Hasil rekontruksi pohon filogeografi pengelompokan sampel H. harpax berdasarkan ruas d-loop mtdna menggunakan metode NJ dengan bootstrap 1000x. page 7 / 286

8 Tabel 1.Jarak genetik antar sampel (di bawah diagonal) dan standar error (di atas diagonal) berdasarkan model subtitusi K2P dengan bootstrap 1000x. No Sampel 1 H. harpax H. harpax H. harpax H page 8 / 286

9 page 9 / 286

10 page 10 / 286

11 page 11 / 286

12 page 12 / 286

13 page 13 / 286

14 page 14 / 286

15 page 15 / 286

16 page 16 / 286

17 page 17 / 286

18 page 18 / 286

19 page 19 / 286

20 page 20 / 286

21 page 21 / 286

22 page 22 / 286

23 page 23 / 286

24 page 24 / 286

25 page 25 / 286

26 page 26 / 286

27 page 27 / 286

28 page 28 / 286

29 page 29 / 286

30 page 30 / 286

31 page 31 / 286

32 page 32 / 286

33 page 33 / 286

34 page 34 / 286

35 page 35 / 286

36 page 36 / 286

37 page 37 / 286

38 page 38 / 286

39 page 39 / 286

40 page 40 / 286

41 page 41 / 286

42 page 42 / 286

43 page 43 / 286

44 page 44 / 286

45 page 45 / 286

46 page 46 / 286

47 page 47 / 286

48 page 48 / 286

49 page 49 / 286

50 page 50 / 286

51 page 51 / 286

52 page 52 / 286

53 page 53 / 286

54 page 54 / 286

55 page 55 / 286

56 page 56 / 286

57 page 57 / 286

58 page 58 / 286

59 page 59 / 286

60 page 60 / 286

61 page 61 / 286

62 page 62 / 286

63 page 63 / 286

64 page 64 / 286

65 page 65 / 286

66 page 66 / 286

67 page 67 / 286

68 page 68 / 286

69 page 69 / 286

70 page 70 / 286

71 page 71 / 286

72 page 72 / 286

73 page 73 / 286

74 page 74 / 286

75 page 75 / 286

76 page 76 / 286

77 page 77 / 286

78 page 78 / 286

79 page 79 / 286

80 page 80 / 286

81 page 81 / 286

82 page 82 / 286

83 page 83 / 286

84 page 84 / 286

85 page 85 / 286

86 page 86 / 286

87 page 87 / 286

88 page 88 / 286

89 page 89 / 286

90 page 90 / 286

91 page 91 / 286

92 page 92 / 286

93 page 93 / 286

94 page 94 / 286

95 page 95 / 286

96 page 96 / 286

97 page 97 / 286

98 page 98 / 286

99 page 99 / 286

100 page 100 / 286

101 page 101 / 286

102 page 102 / 286

103 page 103 / 286

104 page 104 / 286

105 page 105 / 286

106 page 106 / 286

107 page 107 / 286

108 page 108 / 286

109 page 109 / 286

110 page 110 / 286

111 page 111 / 286

112 page 112 / 286

113 page 113 / 286

114 page 114 / 286

115 page 115 / 286

116 page 116 / 286

117 page 117 / 286

118 page 118 / 286

119 page 119 / 286

120 page 120 / 286

121 page 121 / 286

122 page 122 / 286

123 page 123 / 286

124 page 124 / 286

125 page 125 / 286

126 page 126 / 286

127 page 127 / 286

128 page 128 / 286

129 page 129 / 286

130 page 130 / 286

131 page 131 / 286

132 page 132 / 286

133 page 133 / 286

134 page 134 / 286

135 page 135 / 286

136 page 136 / 286

137 page 137 / 286

138 page 138 / 286

139 page 139 / 286

140 page 140 / 286

141 page 141 / 286

142 page 142 / 286

143 page 143 / 286

144 page 144 / 286

145 page 145 / 286

146 page 146 / 286

147 page 147 / 286

148 page 148 / 286

149 page 149 / 286

150 page 150 / 286

151 page 151 / 286

152 page 152 / 286

153 page 153 / 286

154 page 154 / 286

155 page 155 / 286

156 page 156 / 286

157 page 157 / 286

158 page 158 / 286

159 page 159 / 286

160 page 160 / 286

161 page 161 / 286

162 page 162 / 286

163 page 163 / 286

164 page 164 / 286

165 page 165 / 286

166 page 166 / 286

167 page 167 / 286

168 page 168 / 286

169 page 169 / 286

170 page 170 / 286

171 page 171 / 286

172 page 172 / 286

173 page 173 / 286

174 page 174 / 286

175 page 175 / 286

176 page 176 / 286

177 page 177 / 286

178 page 178 / 286

179 page 179 / 286

180 page 180 / 286

181 page 181 / 286

182 page 182 / 286

183 page 183 / 286

184 page 184 / 286

185 page 185 / 286

186 page 186 / 286

187 page 187 / 286

188 page 188 / 286

189 page 189 / 286

190 page 190 / 286

191 page 191 / 286

192 page 192 / 286

193 page 193 / 286

194 page 194 / 286

195 page 195 / 286

196 page 196 / 286

197 page 197 / 286

198 page 198 / 286

199 page 199 / 286

200 page 200 / 286

201 page 201 / 286

202 page 202 / 286

203 page 203 / 286

204 page 204 / 286

205 page 205 / 286

206 page 206 / 286

207 page 207 / 286

208 page 208 / 286

209 page 209 / 286

210 page 210 / 286

211 page 211 / 286

212 page 212 / 286

213 page 213 / 286

214 page 214 / 286

215 page 215 / 286

216 page 216 / 286

217 page 217 / 286

218 page 218 / 286

219 page 219 / 286

220 page 220 / 286

221 page 221 / 286

222 page 222 / 286

223 page 223 / 286

224 page 224 / 286

225 page 225 / 286

226 page 226 / 286

227 page 227 / 286

228 page 228 / 286

229 page 229 / 286

230 page 230 / 286

231 page 231 / 286

232 page 232 / 286

233 page 233 / 286

234 page 234 / 286

235 page 235 / 286

236 page 236 / 286

237 page 237 / 286

238 page 238 / 286

239 page 239 / 286

240 page 240 / 286

241 page 241 / 286

242 page 242 / 286

243 page 243 / 286

244 page 244 / 286

245 page 245 / 286

246 page 246 / 286

247 page 247 / 286

248 page 248 / 286

249 page 249 / 286

250 page 250 / 286

251 page 251 / 286

252 page 252 / 286

253 page 253 / 286

254 page 254 / 286

255 page 255 / 286

256 page 256 / 286

257 page 257 / 286

258 page 258 / 286

259 page 259 / 286

260 page 260 / 286

261 page 261 / 286

262 page 262 / 286

263 page 263 / 286

264 page 264 / 286

265 page 265 / 286

266 page 266 / 286

267 page 267 / 286

268 page 268 / 286

269 page 269 / 286

270 page 270 / 286

271 page 271 / 286

272 page 272 / 286

273 page 273 / 286

274 page 274 / 286

275 page 275 / 286

276 page 276 / 286

277 page 277 / 286

278 page 278 / 286

279 page 279 / 286

280 page 280 / 286

281 page 281 / 286

282 page 282 / 286

283 page 283 / 286

284 page 284 / 286

285 page 285 / 286

286