DETEKSI AFRIKANISASI LEBAH Apis mellifera BERDASARKAN GEN SITOKROM B DARI DNA MITOKONDRIA. Oleh: ANIFA BINTAR RAHMAWATI G

Transkripsi

1 DETEKSI AFRIKANISASI LEBAH Apis mellifera BERDASARKAN GEN SITOKROM B DARI DNA MITOKONDRIA Oleh: ANIFA BINTAR RAHMAWATI G DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2007

2 ABSTRAK ANIFA BINTAR RAHMAWATI. Deteksi Afrikanisasi Pada Lebah Apis mellifera Berdasarkan Gen Sitokrom B Dari DNA Mitokondria. Dibimbing oleh RIKA RAFFIUDIN dan M. CHANDRA WIDJAJA. Apis mellifera merupakan lebah madu yang persebaran alaminya meliputi daerah Mediterania, Afrika, dan Eropa. Berdasarkan analisis morfometrik, Apis mellifera terbagi kedalam 24 subspesies yang terdiri dari kelompok garis keturunan A (Afrika), M (Eropa Utara dan Barat), C (Eropa Selatan) dan O (Timur Tengah). Peternak lebah di dunia banyak yang mengimpor A. mellifera. Peternak di Indonesia umumnya mengimpor dari Australia. Peternakan lebah menjadi terancam sejak A. m. scutellata diimpor dari Afrika ke Brazil yang keturunannya dengan A. m. ligustica menghasilkan Africanized honeybee yang bersifat agresif. Hingga saat ini belum ada usaha untuk mendeteksi keberadaan AHB di peternakan lebah madu Indonesia khususnya di lembaga yang berwenang seperti Balai Karantina Hewan. Tujuan penelitian ini adalah untuk mendeteksi afrikanisasi pada lebah A. mellifera berdasarkan gen sitokrom b dari DNA mitokondria. Keberadaan lebah AHB dapat dideteksi dari DNA mitokondria melalui gen sitokrom b berdasarkan keberadaan situs pemotongan enzim BglII. Hasil amplifikasi daerah gen sitokrom b dengan menggunakan primer forward dan reverse sitokrom b menghasilkan fragmen DNA berukuran 485 pb. Hasil pemotongan fragmen DNA tersebut dengan BglII menghasilkan satu mitotipe yang terdiri dari dua fragmen DNA masing-masing berukuran 194 pb dan 291 pb. Data DNA hasil restriksi menunjukkan bahwa belum ada AHB di Jawa. ABSTRACT ANIFA BINTAR RAHMAWATI. Detection africanized of A. mellifera honeybee based on cytochrome b gene in mitochondria DNA. Supervised by RIKA RAFFIUDIN and M. CHANDRA WIDJAJA. Apis mellifera is a honeybee that spread in Mediterania, Africa, and Europe regions. Based on morphometric analysis, it comprises of 24 subspecies that consist of four lineages; namely the African (A), Western and Northern Europe (M), Southeastern Europe (C), and Near Eastern (O). Beekeepers in many countries import and distribute A. mellifera. The beekeeper in Indonesia generally imported A. mellifera from Australia. The existence of A. m. scutellata in Brazil become threatened since A. m. scutellata hybridized with A. m. ligustica and became aggressive Africanized honeybee (AHB). Until recently, there was no attempt to detect the existence of the Africanized honeybee in quarantine apiary in Indonesia. Therefore, the objective of this research was to detect Africanized honeybee based on cytochrome b gene of mitochondrial DNA. Africanized honeybee could be detected based on cytochrome b gene in mitochondria DNA by using restriction site of cyt b/bglii. DNA fragment amplified by using cyt b forward and reverse primers revealed 485 bp. Digestion of the amplified region with the BglII restriction enzyme revealed one mitotype which produced two fragments of DNA that consist of 194 and 291 bp. This indicated that there were no AHB in Java, so far.

3 DETEKSI AFRIKANISASI LEBAH Apis mellifera BERDASARKAN GEN SITOKROM B DARI DNA MITOKONDRIA Skripsi Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains Pada Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor Oleh: Anifa Bintar Rahmawati G DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2007

4 Judul Skripsi : Deteksi Afrikanisasi Lebah Apis mellifera Berdasarkan Gen Sitokrom B Dari DNA Mitokondria Nama : Anifa Bintar Rahmawati NRP : G Menyetujui: Pembimbing I, Pembimbing II, Dr. Ir. Rika Raffiudin, Msi Drs. Chandra Widjaja,MM NIP NIP Mengetahui: Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor Prof. Dr. Ir. Yonny Koesmaryono, MS. NIP Tanggal Lulus:

5 PRAKATA Alhamdulillah segala puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat allah SWT atas segala rahmat serta limpahan karunianya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Penulis ingin mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada Dr. Ir. Rika Raffiudin, MSi. dan Drs. M. Chandra Widjaja, MM. atas bimbingan, saran, dan perhatiannya yang sangat besar selama ini. Terima kasih untuk Dr. Nampiah Sukarno, Msi. Atas masukan dan kritiknya terhadap karya ilmiah ini. Ucapan terima kasih juga penulis ucapkan untuk mbak Zulfarida dan Apriani yang telah membantu selama penelitian di Laboratorium. Ucapan terima kasih juga kepada seluruh dosen Zoologi; Ibu Taruni, Bapak Heru, Ibu Wita Farajalah, Bapak Ahmad Farajalah, Bapak Bambang Suryobroto, Bapak Tri Atmowidi, kak Berry, dan mbak Kanthi, juga staf Zoologi mbak Tini atas nasehatnya, pak Djupri, dan pak Adi. Terima kasih juga untuk teman-teman di Laboratorium Zoologi atas kebersamaannya selama ini: Isma, Adisti, Rian Haris, Ikbal, Bian, Gema, Wida, Rifah, Sanah, Sumi, Dian Erlangga, dan seluruh teman-teman Biologi 39. Ucapan terima kasih juga untuk seluruh warga Griya Amani, kelompok azzahra dan seseorang yang memberikan semangat didalam hatiku. Akhirnya, penulis ingin mengucapkan terima kasih yang sangat mendalam untuk Bapak dan Ibu, adik-adik: Putra Aminudin dan Ainin Jariati atas dukungan, semangat, kasih sayang serta doanya selama ini. Bogor, Mei 2007 Anifa Bintar Rahmawati

6 RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Nabire Pada tanggal 2 Maret 1985 sebagai anak pertama dari tiga bersaudara pasangan Rochmadi dan Siti Qomariah. Penulis menyelesaikan pendidikan dasar pada tahun 1996 di SDN 02 Karang Tumaritis Nabire. Pendidikan menegah pertama diselesaikan pada tahun 1999 di SLTPN 1 Nabire. Pendidikan menengah atas diselesaikan pada tahun 2002 di SMUN 1 Nabire dan pada tahu yang sama lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI). Penulis juga pernah mengikuti organisasi Himabio dan kewirausahaan Bioworld Pada Tahun 2003/2004. Kegiatan studi lapang pernah pernah dilakukan pada tahun 2004/2005 bertempat di Situ Gunung, Sukabumi dengan topik Identifikasi Semut Epifit. Pada tahun yang sama penulis menjadi asisten mata kuliah Vertebrata, Fisiologi Hewan dan Biologi Dasar. Kegiatan praktek lapang pernah penulis lakukan pada tahun 2005 mengenai aktivitas makan kupu-kupu jeruk Papilio demoleus di Museum Serangga dan Taman Kupu, Taman Mini Indonesia Indah. Penulis juga pernah mengikuti seminar Indonesian Toray Science Fondation pada tahun 2006, sebagai peserta.

7 DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL... vii DAFTAR GAMBAR... vii DAFTAR LAMPIRAN... vii PENDAHULUAN Latar Belakang... 1 BAHAN DAN METODE Koleksi Lebah... 1 Ekstraksi dan Isolasi DNA... 1 Amplikasi DNA Gen Sitokrom b A. mellifera... 2 Elektroforesis dan Visualisasi DNA... 2 Pengukuran pita DNA... 2 PCR-RFLP... 2 Sequencing (pengurutan) DNA dan Alignment (penjajaran) DNA... 3 HASIL Amplifikasi DNA... 3 Pemotongan DNA A. mellifera Hasil Amplikasi dengan Enzim Restriksi BglII... 3 Pengurutan DNA A. mellifera... 3 Alignment DNA... 3 PEMBAHASAN... 7 KESIMPULAN... 7 SARAN... 8 DAFTAR PUSTAKA... 8 LAMPIRAN... 9

8 DAFTAR TABEL Halaman 1. Nukleotida primer yang digunakan untuk mengamplikasi gen sitokrom b A. Mellifera... 2 DAFTAR GAMBAR Halaman 1. Hasil amplikasi gen sitokrom b A. mellifera menggunakan primer forward dan reverse sitokrom b Hasil pemotongan gen sitokrom b A. mellifera meggunakan enzim restriksi BglII Hasil pengurutan nukleotida DNA gen sitokrom b Homologi urutan nukleotida gen sitokrom b A. mellifera... 5 DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1. Daftar nama dan alamat peternak A. mellifera di Jawa Timur, Jawa Tengah, Yogyakarta, dan Jawa Barat Kromatogram hasil pengurutan DNA contoh Am19 Pati menggunakan primer forward sitokrom b Kromatogram hasil pengurutan DNA contoh Am19 Pati menggunakan primer reverse sitokrom b... 12

9 PENDAHULUAN Latar belakang Apis mellifera termasuk kedalam Ordo Hymenoptera, famili Apidae dan subfamili Apinae (Michener 2000). Lebah A. mellifera adalah lebah madu yang dibudidayakan karena produksi madunya yang tinggi. Lebah madu ada yang hingga saat ini belum semua dapat dibudidayakan. Lebah madu yang telah dapat dibudidayakan adalah dari kelompok lebah A. mellifera, dan A. cerana, sedangkan lebah madu yang belum dapat dibudiyakan yaitu A. koscevnikovi, A. dorsata, A. andreniformis, A. florea dan A. laboriosa. Lebah A. mellifera merupakan spesies lebah madu yang persebarannya paling luas. A. mellifera ditemukan di sebagian besar daerah gurun pasir dan daerah dengan temperatur yang dingin (Ruttner 1988). Persebaran alami A. mellifera adalah di daerah Mediterania, Afrika, dan Eropa. Berdasarkan analisis morfometrika, Ruttner (1988) membagi 24 subspesies ini menjadi empat kelompok garis keturunan (lineage). Garis keturunan A terdiri dari A. mellifera yang daerah persebarannya meliputi daerah Afrika, M meliputi Eropa utara dan barat, C meliputi Eropa Selatan dan O meliputi Timur Tengah. Pengelompokan yang sama juga dihasilkan oleh Franck et al. (2000) berdasarkan DNA mitokondria. Peternak lebah di dunia banyak mengimpor beberapa subspesies A. mellifera yaitu A. m. mellifera dan A. m. ligustica dari Eropa. Hal itu karena sifat jinak serta produksi madunya yang tinggi (Gojmerac 1983). Peternakan lebah menjadi terancam sejak lebah madu A. m. scutellata yang berasal dari Afrika diimpor ke Brazil pada tahun Lebah Afrika tersebut diimpor dengan tujuan untuk mendapat galur lebah yang adaptasinya baik di daerah tropis. A. m. scutellata mengalami hibridisasi dengan lebah madu Eropa yaitu A. m. ligustica dan A. m. mellifera yang menghasilkan Africanized honey bee (AHB) (Kenneth 1999). AHB memiliki sifat ganas, sengat yang mematikan dan sangat cepat dalam perbanyakan koloni (Sheppard 1999). Keturunan lebah AHB ini tersebar dari Brazil ke Meksiko, Texas, Arizona, dan California (Schneider et al. 2003). Secara morfologi peternak lebah tidak dapat membedakan antara lebah AHB dan lebah madu Eropa (bukan AHB). Penelitian dasar untuk mendeteksi lebah AHB dilakukan dengan menggunakan penanda molekuler mitokondria DNA. Mitokondria DNA diturunkan secara maternal melalui sitoplasma, tidak mengalami rekombinasi atau sedikit terjadi rekombinasi gen (Hoy 1994). Gen sitokrom b pada DNA mitokondria yang dipotong dengan enzim BglII dapat digunakan untuk mendeteksi AHB. Berdasarkan Crozier et al. (1991) enzim BglII mampu untuk memotong gen sitokrom b yang digunakan untuk mendeteksi AHB. Selain BglII dengan gen sitokrom b, enzim dan daerah gen lain dapat digunakan untuk mendeteksi keberadaan lebah AHB. Daerah gen tersebut adalah lrrna/eco RI dan cox 1/Hinc II (Pinto et al. 2003). Hingga saat ini belum ada usaha untuk mendeteksi keberadaan AHB di peternakan lebah madu di Indonesia khususnya di Balai Karantina Hewan. Penelitian ini bertujuan untuk mendeteksi afrikanisasi lebah A. mellifera di pulau Jawa berdasarkan gen sitokrom b pada DNA mitokondria. Bahan dan Metode Koleksi Lebah Contoh lebah diperoleh dari hasil pengkoleksian lebah madu pada tahun 2005 yang dilakukan di Pati (Jawa Tengah) dan Jember (Jawa Timur) (Raffiudin 2006). Sebanyak 70 koloni lebah yang berasal dari Pati dan Jember disimpan dalam tabung berisi etanol absolut. Ekstraksi dan Isolasi DNA Ekstraksi DNA sudah dilakukan oleh peneliti sebelumnya (Hidayat 2006, Raffiudin 2006). Secara garis besar tahap persiapan dan pelaksanaan ekstraksi DNA adalah sebagai berikut. Sebelum ekstraksi DNA dilakukan, lebah dimasukkan ke dalam Tris-EDTA (TE) 10 mm untuk menggantikan etanol dalam jaringan. Sumber DNA lebah yang digunakan adalah bagian toraks lebah. Jaringan toraks lebah dimasukkan ke dalam tabung 1.5 ml diletakkan dalam steroform berisi nitrogen cair lalu digerus. Ekstraksi DNA menggunakan metode ekstraksi CTAB dan presipitasi alkohol (Sambrook et al. 1989).

10 2 Tabel 1 Nukleotida primer yang digunakan untuk mengamplifikasi gen sitokrom b A. mellifera berdasarkan posisi urutan DNA mitokondria A. mellifera Crozier & Crozier (1993) Nama Primer Susunan nukleotida primer (5-3 ) Posisi nukelotida primer pada mitokondria total Sitokrom b Forward TATGTACTACCTTGAGGACAAATATC Sitokrom b Reverse ATTACACCTCCTAATTTATTAGGAAT Sebanyak 200 µl cetyl trimetyl amonium bromida (CTAB) konsentrasi 20% dimasukkan ke dalam tabung berisi toraks yang sudah digerus untuk melisis membran. Kemudian ditambahkan 14 µl proteinase K dengan konsentrasi 5 mg/µl dan diinkubasi pada suhu 55 º C selama dua jam. Larutan berisi campuran CTAB dan proteinase K disentrifugasi rpm (10 menit). Supernatan yang berisi DNA dipindahkan ke dalam tabung steril baru, kemudian ditambahkan 250 µl Chloroform Isoamil Alkohol (C:IAA=24:1). Supernatan dikocok (5 menit) dan disentrifugasi rpm (5 menit). Fenol kloroform isoamil alkohol (P:C:I=25:24:1) kemudian disentrifugasi rpm (1menit). Larutan berisi DNA dipindahkan ke tabung 1.5 ml steril dan ditambahkan 400 µl CIAA, lalu dikocok (5 menit). Larutan berisi DNA disentrifugasi rpm (3 menit), kemudian supernatan dipindahkan ke tabung baru. DNA yang terlarut dalam supernatan dipresipitasi dengan menggunakan 600 µl isopropanol selama semalam pada suhu 4 º C. Campuran DNA dan isopropanol disentrifugasi rpm selama 30 menit. Etanol 70% sebanyak 500 µl ditambahkan pada pelet DNA. Campuran tersebut disentrifugasi rpm (10 menit) pada suhu 4 o C. Etanol dibuang dan pelet DNA dikeringkan dengan cara divakum (30 menit). DNA hasil ekstraksi dilarutkan dalam TE 0.5 mm dan disimpan pada suhu 4 o C. Amplifikasi DNA Gen Sitokrom b A. mellifera DNA lebah diamplifikasi menggunakan mesin PCR TaKaRa Thermal Cycler. Pereaksi PCR terdiri atas ddh20, 2.5 µm dntp, Mg 2+ free buffer, 25 µm MgCl 2, 10 µm primer sitokrom b reverse, 10 µm primer sitokrom b forward (Tabel 1) (Crozier et al. 1991), Taq polimerase 5 unit/0.1 µl, dan DNA hasil ekstraksi. Proses PCR dilakukan dengan tahapan; denaturation (pemisahan DNA utas ganda) pada 94 º C selama 1 menit, annealing (penempelan primer) pada 55 º C selama 1 menit, dan elongation (pemanjangan) pada 72 º C selama 2 menit. Semua tahap dilakukan selama 30 siklus. Elektroforesis dan Visualisasi DNA DNA hasil amplifikasi dipisahkan dengan polyacrilamide gel electrophoresis (PAGE) 6% menggunakan bufer 1 x Tris 0.5 M, Asam borat 0.65 M, EDTA 0.02M (TBE). Arus listrik yang digunakan sebesar 160 V selama 90 menit. Visualisasi DNA dalam gel poli akrilamid dilakukan dengan pewarnaan perak (Silver staining) yang dilakukan dalam shaking bath (Tegelstrom 1986). Gel hasil elektroforesis dicuci dengan larutan CTAB (0.2 gr/200 ml akuades) selama 8 menit. Kemudian gel dicuci dengan aquades dua kali masing-masing 2 menit. Setelah itu gel dibilas lagi dalam larutan NH 4 OH (2 ml/200 ml akuades) selama 6 menit. Selanjutnya gel direndam dalam campuran larutan 0.32 AgNO 3, 0.8 ml NH 4 OH, dan akuades 200 ml selama 10 menit. Kemudian gel dicuci lagi menggunakan aquades dua kali masing-masing 2 menit. Setelah itu gel direndam dalam campuran larutan 4 gr Na 2 CO 3, 100 µl formaldehida, dan 200 ml akuades sampai muncul pita DNA. Terakhir, gel direndam dalam larutan asam asetat 1% dalam 200 ml akuades untuk pengawetan pita DNA. Pengukuran pita DNA Pengukuran pita DNA dilakukan untuk mengetahui ukuran DNA berdasarkan gel akrilamida. Pengukuran ini dilakukan pada pita penanda DNA dan pada DNA target. Penentuan ukuran pita DNA target berdasarkan regresi menggunakan program R (the R Development Core Team Version 1.6.0) (Venables & Ripley 1999). PCR-RFLP DNA A. mellifera hasil amplifikasi dipotong menggunakan enzim restriksi BglII. Enzim restriksi BglII merupakan enzim pemotong enam basa. Situs pemotongannya adalah AGATCT (Griffiths et al. 1999) memotong basa ke 291 gen sitokrom b pada GenBank L Komposisi pereaksi RFLP dalam total reaksi 4 µl terdiri atas DNA hasil amplifikasi 2 µl, 10 x bufer enzim BglII 0.4 µl, enzim BglII 10 unit/0.5 µl, air destilata

11 3 steril 1.1 µl. Campuran pereaksi RFLP kemudian disentrifugasi 4500 rpm selama 1 menit, lalu diinkubasi pada suhu 37 o C selama semalam. Hasil pemotongan dimigrasikan pada gel akrilamida 6% dengan arus 120 V selama 90 menit. Visualisasi DNA dalam gel poliakrilamid dilakukan dengan pewarnaan perak (Tegelstrom 1986). Pengurutan DNA dan Alignment DNA Pengurutan hasil amplifikasi DNA gen sitokrom b dilakukan menggunakan jasa Lembaga Biologi Molekuler Charoen Pockphan Jakarta, menggunakan mesin ABI 310 Applied Biosystem. Pengurutan DNA dilakukan dari ujung 5' dan 3' menggunakan primer sitokrom b forward dan reverse. Hasil pengurutan DNA dilakukan analisis homologi dengan cara alignment DNA. Alignment DNA dilakukan antara gen sitokrom b A. m 19 Pati dengan gen A. mellifera (Crozier dan Crozier 1993); Acc Number L pada GenBank menggunakan program Clustal X (Thompson 1997). Analisis homologi juga dilakukan antara gen sitokrom b Am 19 Pati, A. mellifera (Crozier dan Crozier 1993) dan AHB haplotipe satu: Genbank Acc Number EF dan AHB haplotipe dua: Acc Number EF HASIL Amplifikasi DNA Hasil amplifikasi dan RFLP gen sitokrom b dilakukan pada seluruh contoh A. mellifera. Seluruh contoh menghasilkan ukuran PCR produk yang sama (500 pb) (Gambar 1). Data gambar PCR produk dan RFLP diperoleh dari contoh A. mellifera asal Jawa Timur (koloni 61-70, sesuai Lampiran 1). Data gambar tersebut mewakili data dari seluruh contoh A. mellifera pada penelitian ini. pb M Gambar 1 Hasil amplifikasi gen sitokrom b A. mellifera yang diimpor ke Indonesia M = marker (DNA 100 bp), 1-10 = nomor contoh A. mellifera Jawa Timur dengan no. koloni (lampiran 1). Pemotongan DNA A. mellifera Hasil Amplifikasi dengan Enzim Restriksi BglII Seluruh produk sitokrom b A. mellifera dipotong dengan enzim restriksi BglII. Hasil gel menunjukkan satu mitotipe yang memiliki dua pita DNA berukuran kurang lebih 200 dan 300 pb. Dengan demikian terdapat satu situs pemotongan yang monomorfik (seragam) (Gambar 2). Daerah restriksi gen sitokrom b hasil pemotongan enzim BglII berdasarkan sekuen DNA menghasilkan dua fragmen dengan ukuran 194 pb & 291 pb (Gambar 3). Posisi BglII dari hasil pengurutan nukleotida DNA gen sitokrom b A. mellifera terdapat pada basa ke 291 pb (Gambar 4) M Pengurutan DNA A. mellifera Contoh A. mellifera yang dipilih untuk dilakukan pengurutan DNA adalah A. mellifera koleksi Pati dengan nomor koloni 19. Pemilihan nomor koloni Am 19 untuk pengurutan DNA berdasarkan pada produk DNA hasil amplifikasi yang baik. Proses pengurutan DNA menggunakan primer forward dan reverse sitokrom b. Hasil pengurutan DNA berupa kromatogram (Lampiran 2 & 3) telah diedit secara manual. Hasil edit kemudian dimasukkan ke dalam program Genetyx (Genetyx Win Versi 4.0) untuk analisis lebih lanjut. Hasil pengurutan DNA pada nomor contoh A. mellifera 19 Pati menggunakan primer sitokrom b forward dan reverse didapatkan 485 pb (Gambar 5). Alignment DNA Analisis alignment DNA dilakukan untuk mengetahui homologi nukleotida. Nomor contoh A. mellifera 19 Pati dilakukan alignment DNA dengan lebah A. mellifera yang 10 Gambar 2 Hasil pemotongan gen sitokrom b A. mellifera dengan menggunakan enzim restriksi BglII M=marker (DNA 100 bp), 1-10=nomor contoh A. mellifera dengan no koloni (61-70) (lampiran 1)

12 4 telah diteliti sebelumnya oleh Crozier dan Crozier (1993) diperoleh dari Gen Bank ACC Number L Proses alignment DNA menggunakan program Clustal X (Thompson 1997). Hasil alignment DNA menunjukkan bahwa tidak ada perbedaan urutan nukleotida antara nomor contoh A. mellifera 19 Pati dengan A. melli- fera hasil dari Crozier dan Crozier (1993) Acc Number L Hasil alignment DNA sitokrom b Am 19 Pati dengan AHB dari GenBank Acc Number EF dan EF menunjukkan bahwa terdapat perbedaan urutan nukleotida, yaitu terdapat sembilan substitusi nukleotida (Gambar 5) tatgtactaccatgaggacaaatatcatattgaggtgcaacagttattactaatctttta tcagcaattccttatattggtgatacaattgtattatgaatttgaggtggattttcaatt aataatgctacattaaatcgatttttttctttacattttattttaccattattaatttta tttatagttattcttcatttatttgccttacatttaactggatcatctaatcctcttgga tcaaattttaataattataaaatttcatttcatccatatttttcaattaaagatctttta BglII ggattttatatcatcttatttatctttatattcattaattttcaatttccatatcattta ggagatccagacaatttcaaaattgcaaatccaataaatactccaactcatattaaacct gaatgatatttcctatttgcatattcaattttacgagcaattcctaataaattaggaggt 490 gtaat Gambar 3 Hasil pengurutan nukleotida DNA gen sitokrom b A. mellifera. Nukleotida yang digaris bawah adalah nukleotida tempat situs pemotongan enzim BglII 1 BglII pb Gambar 4 Peta restriksi hasil pemotongan gen sitokrom b A. mellifera dengan enzim restriksi BglII. Hasil pemotongan dengan enzim restriksi BglII menghasilkan dua fragmen DNA berukuran 194 pb dan 291 pb

13 5 CYTBL06178 ATGAAAAAATTTATAAACTTTTTTAGTTCCAATGAATTTCTAAAAATAATTATATCTACA 60 AM19PT EF016646_ EF016647_ CYTBL06178 ATTTATTTACCAACTCCAGTAAATATTAATTATATATGAAATTTTGGATCAATTCTTGGA 120 AM19PT EF016646_ EF016647_ CYTBL06178 ATTTTTTTAATAATTCAAATCATTTCTGGATTTATTTTATCAATACATTATTGTCCAAAT 180 AM19PT EF016646_ EF016647_ CYTBL06178 ATTGATATTGCTTTCTGATCAATTACTAATATTATAAAAGATATAAATTCAGGATGATTA 240 AM19PT EF016646_ EF016647_ CYTBL06178 TTTCGTTTAATTCACATAAATGGAGCATCATTTTATTTTTTAATAATATATATTCATATT 300 AM19PT EF016646_ EF016647_ CYTBL06178 AGTCGAAATTTATTTTATTGTTCATATAAATTAAATAATGTATGAGGAATTGGAATTATA 360 AM19PT EF016646_ EF016647_ CYTBL06178 ATTCTTTTAATATCAATAGCAGCTGCATTTATAGGATATGTACTACCATGAGGACAAATA 420 AM19PT TATGTACTACCATGAGGACAAATA 24 EF016646_ TATGTACTACCATGAGGACAAATA 24 EF016647_ TATGTACTACCATGAGGACAAATA 24 ************************ CYTBL06178 TCATATTGAGGTGCAACAGTTATTACTAATCTTTTATCAGCAATTCCTTATATTGGTGAT 480 AM19PT TCATATTGAGGTGCAACAGTTATTACTAATCTTTTATCAGCAATTCCTTATATTGGTGAT 84 EF016646_1 TCATATTGAGGTGCAACAGTCATTACTAATCTTTTATCAGCAATTCCTTATATTGGTGAT 84 EF016647_2 TCATATTGAGGTGCAACAGTTATTACTAATCTTTTATCAGCAATTCCTTATATTGGTGAT 84 ******************** *************************************** CYTBL ACAATTGTATTATGAATTTGAGGTGGATTTTCAATTAATAATGCTACATTAAATCGATTT 540 AM19PT ACAATTGTATTATGAATTTGAGGTGGATTTTCAATTAATAATGCTACATTAAATCGATTT 144 EF016646_1 ACAATTGTATTATGAATCTGAGGTGGGTTCTCAATTAATAATGCTACCTTAAATCGATTT 144 EF016647_2 ACAATTGTATTATGAATCTGAGGTGGGTTCTCAATTAATAATGCTACCTTAAATCGATTT 144 ***************** ******** ** ***************** ************ CYTBL06178 TTTTCTTTACATTTTATTTTACCATTATTAATTTTATTTATAGTTATTCTTCATTTATTT 600 AM19PT TTTTCTTTACATTTTATTTTACCATTATTAATTTTATTTATAGTTATTCTTCATTTATTT 204 EF016646_1 TTTTCTTTACATTTTATTTTACCATTATTAATTTTATTTATAGTTATTCTTCATTTATTT 204 EF016647_2 TTTTCTTTACATTTTATTTTACCATTATTAATTTTATTTATAGTTATTCTTCATTTATTT 204 ************************************************************ CYTBL06178 GCCTTACATTTAACTGGATCATCTAATCCTCTTGGATCAAATTTTAATAATTATAAAATT 660 AM19PT GCCTTACATTTAACTGGATCATCTAATCCTCTTGGATCAAATTTTAATAATTATAAAATT 264 EF016646_1 GCCTTACATTTAACTGGATCATCTAATCCTCTTGGATCAAATTTTAATAATTATAAAATT 264 EF016647_2 GCCTTACATTTAACTGGATCATCTAATCCTCTTGGATCAAATTTTAATAATTATAAAATT 264 ************************************************************ CYTBL TCATTTCATCCATATTTTTCAATTAAAGATCTTTTAGGATTTTATATCATCTTATTTATC 720 AM19PT TCATTTCATCCATATTTTTCAATTAAAGATCTTTTAGGATTTTATATCATCTTATTTATC 324 EF016646_1 TCATTTCATCCATATTTTTCAATTAAAGACCTTTTAGGATTTTATATTATCTTATTTATC 324 EF016647_2 TCATTTCATCCATATTTTTCAATTAAAGACCTTTTAGGATTTTATATTATCTTATTTATC 324 ***************************** ***************** ************

14 6 CYTBL TTTATATTCATTAATTTTCAATTTCCATATCATTTAGGAGATCCAGACAATTTCAAAATT 780 AM19PT TTTATATTCATTAATTTTCAATTTCCATATCATTTAGGAGATCCAGACAATTTCAAAATT 384 EF016646_1 TTTATATTCATTAATTTTCAATTTCCATATCATTTAGGAGATCCAGATAATTTTAAAATT 384 EF016647_2 TTTATATTCATTAATTTTCAATTTCCATATCATTTAGGAGATCCAGATAATTTTAAAATT 384 *********************************************** ***** ****** 9 CYTBL06178 GCAAATCCAATAAATACTCCAACTCATATTAAACCTGAATGATATTTCCTATTTGCATAT 840 AM19PT GCAAATCCAATAAATACTCCAACTCATATTAAACCTGAATGATATTTCCTATTTGCATAT 444 EF016646_1 GCAAATCCAATAAATACTCCAACTCATATTAAACCTGAATGATATTTTCTATTTGCATAT 444 EF016647_2 GCAAATCCAATAAATACTCCAACTCATATTAAACCTGAATGATATTTTCTATTTGCATAT 444 *********************************************** ************ CYTBL06178 TCAATTTTACGAGCAATTCCTAATAAATTAGGAGGTGTAATCGGATTAGTAATATCAATT 900 AM19PT TCAATTTTACGAGCAATTCCTAATAAATTAGGAGGTGTAAT EF016646_1 TCAATTTTACGAGCAATTCCTAATAAATTAGGAGGTGTAAT EF016647_2 TCAATTTTACGAGCAATTCCTAATAAATTAGGAGGTGTAAT ***************************************** CYTBL06178 CTTATTCTTTATATTATAATTTTTTATAATAATAAAATAATAAACAATAAATTTAATATA 960 AM19PT EF016646_ EF016647_ CYTBL06178 TTAAATAAAATTTATTATTGAATATTTATTAATAACTTCATTTTATTAACATGATTAGGT 1020 AM19PT EF016646_ EF016647_ CYTBL06178 AAACAATTAATTGAATATCCATTTACTAATATTAATATATTATTTACAACAACATATTTT 1080 AM19PT EF016646_ EF016647_ CYTBL06178 TTATATTTTTTCTTAAATTTCTATTTAAGAAAATTATGAGATAATTTAATTTGAAATTCA 1140 AM19PT EF016646_ EF016647_ CYTBL06178 CCATTAAATTAA 1152 AM19PT EF016646_ EF016647_ Gambar 5 Homologi urutan nukleotida gen sitokrom b A. mellifera. Cyt B = sitokrom b; Cyt B L06178 berasal dari GenBank Acc Number L06178, Am 19 pt adalah hasil urutan gen sitokrom b A. mellifera asal Pati. EF016646_1 adalah AHB haplotipe satu, EF016647_2 adalah AHB haplotipe dua berasal dari GenBank. * = kesamaan (homologi) nukleotida. Angka disamping kanan adalah nomor nukleotida. Nukleotida digarisbawah adalah situs restriksi BglII. Nukleotida di dalam kotak adalah perbedaan AHB satu dan AHB dua. = Perbedaan AHB dan bukan AHB. Angka diatas urutan nukleotida menunjukkan substitusi yang terjadi antara Am 19 Pt dengan AHB haplotipe satu dan AHB haplotipe dua.

15 7 PEMBAHASAN Penelitian dasar untuk mendeteksi AHB dilakukan dengan menggunakan penanda molekuler. Salah satu penanda molekuler yang banyak digunakan adalah DNA mitokondria karena sifatnya yang diturunkan secara maternal. Ada beberapa penanda molekuler yang dapat digunakan untuk membedakan AHB dan bukan AHB. Crozier et al. (1991) di Australia telah menggunakan gen sitokrom b yang dipotong dengan enzim restriksi BglII. Hasil penelitiannya menghasilkan satu fragmen DNA berukuran 485 pb untuk AHB. Dua fragmen DNA berukuran 194 pb dan 291 pb dihasilkan untuk yang bukan AHB. Penelitian yang sama juga telah dilakukan di Amerika Serikat oleh Pinto et al. (2003). Gen sitokrom b/bglii dapat membedakan antara A. mellifera dari garis keturunan Afrika dan garis keturunan A. mellifera yang lain. Satu fragmen DNA berukuran 485 pb dihasilkan A. mellifera yang termasuk garis keturunan Afrika. Dua fragmen DNA berukuran 194 pb dan 291 pb untuk keturunan A. mellifera selain Afrika. Crozier & Koulinous (1996) telah melakukan penelitian yang sama di Australia. Dengan menggunakan gen sitokrom b/bglii dapat membedakan antara kelompok garis keturunan asal Afrika dan Eropa. Hal tersebut diketahui berdasarkan keberadaan situs pemotongan BglII. Hasil penelitiannya menunjukkan bahwa tidak ada situs pemotongan BglII pada A. mellifera dari garis keturunan Afrika. Menurut penelitian yang dilakukan oleh Hidayat (2006), mengenai asal lebah madu impor A. mellifera di Indonesia berdasarkan daerah intergenik cox 1-2/Dra1 DNA mitokondria, menyatakan bahwa A. mellifera yang ada di Indonesia merupakan keturunan A. m. ligustica yang diimpor dari Australia. Pada penelitian ini ukuran DNA seluruh contoh A. mellifera hasil amplifikasi gen sitokrom b berdasarkan sekuen DNA ialah 485 pb. Daerah gen sitokrom b hasil pemotongan enzim BglII berdasarkan sekuen DNA menghasilkan dua fragmen DNA. Fragmen tersebut berukuran 194 pb dan 291 pb. Hal ini sesuai dengan hasil penelitian Crozier et al. (1991) pada gen sitokrom b/bglii. Apis mellifera membutuhkan sumber pakan yang lebih banyak dibanding lebah lain. Untuk mensiasati pemenuhan sumber pakan berupa bunga, maka lebah ini perlu dipindahkan (diangon). Sekitar bulan Mei, Juni, Juli pohon randu di daerah Jawa Tengah dan Timur sedang mengalami musim bunga. Pada saat itu lebah dari peternak di Jawa Barat membawa lebahnya untuk diangon di Jawa Timur. Selain contoh lebah dari Jawa Tengah dan Jawa Timur, contoh lebah dari Jawa Barat juga ikut diambil untuk dianalisa pada penelitian ini. Dari seluruh contoh A. mellifera yang dideteksi yaitu contoh yang berasal dari Jawa Tengah, Jawa Barat, dan Jawa Timur tidak membawa gen AHB. Hal tersebut karena dari hasil amplifikasi fragmen DNA dapat dipotong oleh enzim BglII. Analisis homologi dilakukan antara nukleotida A. mellifera dari Crozier dan Crozier dengan Acc.Number: L0-6178, A. mellifera asal Pati dan A. m. scutellata (AHB) haplotipe satu dan haplotipe dua. Berdasarkan hasil Alignment diketahui bahwa contoh A. mellifera pada penelitian ini mempunyai urutan nukleotida yang sama dengan A. mellifera dari Crozier dan Crozier (1993) pada GenBank Acc Number: L06178 yang dimulai dari nukleotida ke 396. Situs BglII terdapat pada posisi nukleotida ke 694. Pencarian data dari GenBank diperoleh dua haplotipe AHB yaitu EF (AHB haplotipe satu) dan EF (AHB haplotipe dua). Berdasarkan analisis homologi, kedua haplotipe tersebut berbeda pada posisi nukleotida ke 65 (Gambar 4). Perbedaan antara AHB dan bukan AHB adalah terdapat substitusi pada nukleotida ke 295 (Gambar 5. Mutasi no 5). Nukleotida timin (T) yang dikenali oleh enzim BglII pada Am 19 pt mengalami mutasi menjadi nukleotida sitosin (C)n pada lebah AHB. Hal ini menyebabkan pada AHB tidak terdapat situs restriksi BglII sehingga hanya satu pita pada hasil RFLP. Berdasarkan hasil alignment DNA, terdapat sembilan substitusi yang membedakan antara Am 19 pt dari hasil penelitian ini dengan AHB haplotipe satu dan haplotipe dua. KESIMPULAN Amplifikasi daerah gen sitokrom b DNA mitokondria Apis mellifera berdasarkan urutan DNA menghasilkan produk sebesar 485 pb. Pemotongan DNA hasil amplifikasi dengan enzim restriksi BglII menghasilkan dua fragmen DNA masing-masing berukuran 194 pb dan 291 pb. Data sitokrom b/bglii hasil restriksi menunjukkan bahwa belum ada lebah AHB di pulau Jawa. Dengan demikian, keberadaan lebah Africanized dapat dideteksi dari DNA mitokondria melalui gen sitokrom b

16 8 berdasarkan keberadaan situs pemotongan BglII. SARAN Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengetahui tingkat akurasi daerah gen lain pada DNA mitokondria dengan enzim restriksi yang berbeda. DAFTAR PUSTAKA Clarke et al The Africanization of honeybees (Apis mellifera ligustica) of the Yucatan: study massive hybridization event across time. Evolution 56: Crozier RH, Koulinos S, Crozier YC An improved test for africanized honeybee mitochondrial DNA. Experientia 47: Crozier RH & Koulianos S Mitochondrial DNA sequence data provides further evidence that the honeybees of Kangaroo Islands, Australia, are of hybrid origin. Apidologie 27: Crozier YC & Crozier RH The mitochondrial genome of the honeybee Apis mellifera: complete sequence and genome organization. Genetics 133: Franck P et al Molecular confirmation of a fourth lineage in honeybees in the Near East. Apidologie 31(2): Gojmerac W.L Bees, Beekeeping, Honey and Pollination. Connecticut: AVI Pub. Griffiths AJ et al Modern Genetic Analysis. Freeman & Company, Madison Avenue, New York. Hidayat RM Asal Lebah Madu Impor Apis mellifera Di Indonesia Berdasarkan Daerah Intergenik cox 1/cox 2 DNA Mitokondria [Skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Institut Pertanian Bogor Hoy MA Insect Molecular Genetics: An Introduction to Principles and Applications. Academic Press. Inc. Kenneth TK & Oguro J Update on the status of Africanized honeybees in the Western States. British Medical Association. West J Med 170: Michener DC The Bees of the World. Baltimore and London. The Johns Hopkins University Pr. Pinto AM et al Identification of Africanized honey bee (Hymenoptera: Apidae) mitochondrial DNA: Validation of a rapid polymerase chain reaction based assay. Ann Entomol 96(5): Raffiudin R Mitochondrial DNA Evidence of the Imported Honey Bee Apis mellifera in Indonesia. Report in Indonesian Toray Science Foundation (ITSF) Seminar on Science and Technology, Jakarta, 1 February Ruttner F Biogeography and Taxonomy of Honey Bees. Berlin: Springer Hiedelberg New York. Sambrooks J, Fritsch EF, Maniatis T Molecular Cloning a Laboratory Manual. Ed ke-2. New York: Cold Spring Harbor Pr. Schneider, Hoffman DG, Smith DR The African honeybee: factors contributing to a successful biological invasion. Ann Entomol 49: Sheppard et al Analysis of Africanized honeybee mitochondrial DNA reveals further diversity origin. Genet Mol Biol 22: Suwanda O Pengelolaan lebah madu oleh pramuka. Di dalam: Budi Daya dan Biologi Lebah Madu. Prosiding Lokakarya Pembudidayaan Lebah Madu untuk Peningkatan Kesejahteraan Masyarakat: Sukabumi, Mei Jakarta: Perum Perhutani.hlm Tegelstrom H Mitochondrial DNA in natural population : an improved routine for screening of genetic variation based on sensitif silver staining. Electrophoresis 7: Thompson JD et al The Clustal X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools Nucleic Acid Res 25: Venables EO & Ripley BD Modern Applied Statistics with S-plus. New York: Springer

17 LAMPIRAN

18 9 Lampiran 1 Daftar nama dan alamat peternak A. mellifera di Jawa Timur, Jawa Tengah, Yogya, dan Jawa Barat (Raffiudin 2006). No Peternak Nama sampel Alamat 1 Pusbahnas Am 1 Parung panjang, Bogor 2 Pusbahnas Am 2 Parung panjang, Bogor 3 Ari puspa(joko) Am 3 Ds.Glagah kulon RT 1/RW 1, Kudus 4 Muria agung (Nurcholis) Am 4 Sragen 5 Ramli Am 5 Jawa tengah 6 Rifa'I Am 6 Jawa tengah 7 Harno Am 7 Purwasari, Tlogowungu, Pati 8 Mashudi Am 8 Ds.Tlogorejo, Tlogowungu 9 Mashudi Am 9 Ds.Tlogorejo, Tlogowungu 10 Mashudi Am 10 Ds.Tlogorejo, Tlogowungu 11 Santoso Am 11 Jawa tengah 12 UP3 Regaloh (Marsudi) Am 12 Jawa tengah 13 UP3 Regaloh (Marsudi) Am 13 Jawa tengah 14 Harno Am 14 Purwosari, Tlogowungu, Pati 15 Rahayu (Supri dan kani) Am 15 Yogyakarta 16 Bambang suseno Am 16 Jawa tengah 17 KUD Batu (Bashori) Am 17 Jl.Diponegoro no 8 kota Batu 18 Harwi Am 18 Jawa tengah 19 Serangga mas (Herman) Am 19 Yogyakarta, Mojosongo, solo 20 Serangga mas (Herman) Am 20 Yogyakarta 21 Serangga mas (Herman) Am 21 Yogyakarta 22 Serangga mas (Herman) Am 22 Yogyakarta 23 Serangga mas (Herman) Am 23 Yogyakarta 24 Sudar Am 24 Jawa tengah 25 Apiari madu (Geri) Am 25 Malang 26 Herman Am 26 Jawa tengah 27 Karya sari (Sutrisno) Am 27 Jawa tengah 28 Karya sari jaya (Sutirisno) Am 28 Jawa tengah 29 Djaenuri Am 29 Jawa tengah 30 Darsono jenggin Am 30 Jawa tengah 31 Kelp.tani lebah madu sariwono (wien) Am 31 Jawa tengah 32 Cipta apiari (Budi) Am 32 Jawa tengah 33 Sartono Am 33 Jawa tengah 34 Sartono Am 34 Jawa tengah 35 Pramuka (Wawan) Am 35 Temanggung, Jawa tengah 36 Perhutani gunung arca (Solichin) Am 36 Sukabumi, Jawa barat 37 Heru Am 37 Ketanggan, Gembong, Pati 38 Kelompok tani Yogya (Sutrisno) Am 38 Pringsurat, Temanggung 39 Madu sekarsari (Untung) Am 39 Yogyakarta 40 Mulyadi Am 40 Jawa tengah 41 Sari alam (Susanto) Am 41 Ds.Bedono, dusun wawarkidul RT 2/3 Ambarawa 42 Yapet Am 42 Jawa tengah 43 Suharjo Am 43 Jawa tengah

19 No Peternak Nama sampel Alamat 44 Suharjo Am 44 Jawa tengah 45 Cepi Am 45 Jawa tengah 46 Cepi Am 46 Jawa tengah 47 Khoirudin Am 47 Jawa tengah 48 Mustika apiaris (Nanang haryono) Am 48 Banyuwangi, Jawa timur 49 Mustika apiaris (Nanang haryono) Am 49 Banyuwangi, Jawa timur 50 Prima (Supri) Am 50 Jawa tengah 51 Santoso (Hawai) Am 51 Perhutani regaloh (Hawai) 52 Nuhana (Holland) Am 52 Dusun Purworejo, Ds bringin pare, Kediri 53 Santoso (Australia) Am 53 Gringsing,Batang 54 Santoso (Cina) Am 54 Perhutani regaloh (Hawai) 55 Nuhana madu (Nuhana) Am 55 Dusun Purworejo, Ds bringin pare, Kediri 56 Sumber madu (Junaidi) Am 56 Ds.Lumbang,kec.Lumbang, Probolinggo 57 KSR (Kasrin) Am 57 Singosari, Malang 58 KS (Liem) Am 58 Surabaya 59 Mekarsari (Samsul) Am 59 Jember 60 Warna muria (H.mustamar) Am 60 Gembong,Pati, Jawa timur 61 AL (Hasan) Am 61 Tempurejo, Jember 62 Sumber madu (Marsito) Am 62 Ds.Kepung pare, Kediri 63 Nektarindo abadi (Trisukow8ibowo) Am 63 Purwosari, Pasuruan 64 AL ihsan (H.tato) Am 64 Wajak, Malang 65 Bintang apiari Am 65 Batu, Malang 66 KUD Batu (Adrian sembodo) Am 66 Jl.Diponegoro no 8 kota Batu 67 Lebah alam (Mulyo haryono) Am 67 Punten batu, Malang 68 Omega madu (Narko/purnomo) Am 68 Dorok manggis RT 05/03,puncu, Kediri 69 Tasmuji Am 69 Pare, Kediri 70 Lestari (ketang) Am 70 Taraken, Kediri 10

20 Lampiran 2 Kromatogram hasil pengurutan DNA A. mellifera sampel Am 19 Pati menggunakan primer forward sitokrom b 11

21 Lampiran 3 Kromatogram hasil pengurutan DNA A. mellifera sampel Am 19 Pati menggunakan primer reverse sitokrom b 12