HASIL DAN PEMBAHASAN. Hasil. dua lembar plastik transparansi dan semua sisinya direkatkan hingga rapat.

Transkripsi

1 (Polyacrilamide Gel Elektroforesis) 5,5% pada tegangan 85 V selama 6 jam. Standar DNA yang digunakan adalah ladder (Promega) Gel polyacrilmide dibuat dengan menggunakan 30 ml aquades, 4 ml 10xTBE, 5,5 ml acrilamide, 150 µl APS (Amonium peroxodisulfate) 2,5 %, dan 25 µl TEMED (Tetra Methyle Ethylene Diamine). Pewarnaan dilakukan dengan menggunakan metode Silver Staining. Proses Silver Staining adalah sebagai berikut. Setelah proses elektroforesis selesai, gel acrilamide dilepas dari cetakannya dan direndam dalam larutan 0,2 g CTAB (cetyl trimethyl ammonium bromide) dan 200 ml aquades kemudian digoyang berlahan selama 20 menit. Kemudian larutan dibuang dan gel dibilas dengan 200 ml aquades lalu digoyang selama 15 menit. Setelah itu air dibuang, digantikan dengan larutan 2,4 ml amonia (NH 4OH), 200 ml aquades dan digoyang selama 20 menit. Setelah selesai, larutan dibuang dan dimasukkan campuran 0,48 gram perak nitrat (AgNO 3), 120 µl NaOH, 1,2 ml amonia, dan 200 ml aquades lalu digoyang 20 menit. Lalu larutan dibuang dan gel dibilas dengan 200 ml aquades dan digoyang selama 15 menit. Aquades kemudian dibuang dan digantikan dengan larutan 4 g natrium karbonat (Na 2CO 3), 100 µl FA (formaldehid), dan 200 ml aquades lalu digoyang sampai terlihat adanya pita DNA. Setelah seluruh pita muncul, larutan tersebut segera dibuang dan digantikan dengan larutan 0,2 ml asam asetat dan 200 ml aquades. Untuk penyimpanan, gel diletakkan diantara dua lembar plastik transparansi dan semua sisinya direkatkan hingga rapat. HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil 1. Amplifikasi Daerah D-Loop DNA Mitokondria Amplifikasi daerah D-Loop mtdna pada kerbau dengan menggunakan primer dan menghasilkan fragmen yang berukuran sekitar 1361 pb (Gambar 6). Semua sampel yang berhasil diamplifikasi oleh primer tersebut menunjukkan ukuran yang sama pb 1361 pb 1000 pb T1 T2 T3 T4 T5 IAJ INB AJ AB NJ1 NJ2 NJ3 NB1 NB2NB3 Gambar 6 Amplifikasi D-loop dengan PCR. Hasil PCR dielektroforesis pada gel agarosa. Berdasarkan sekuen acuan genom DNA mitokondria B. bubalis yang berasal dari Haikou-Cina (Qian 2004) pada Gen- Bank Database (NCBI) dengan kode akses NC_ (Lampiran 1) menghasilkan fragmen berukuran 1361 pb yang tersusun atas trna Thr (53 pb), trna Pro (50 pb), D-Loop (931 pb), trna Phe (82 pb), dan 12S rrna yang berukuran 245 pb (Gambar 7). Hasil PCR trna Pro trna Thr 1361 pb 931 pb D-Loop trna Phe 12S rrna Gambar 7 Peta pemotongan sekuen acuan berdasarkan Gene-Bank pada B. bubalis.

2 c. Pemotongan dengan enzim restriksi Rsa I (GT\AC). Pemotongan dengan enzim restriksi Rsa I menghasilkan dua pita DNA yang berukuran 284 pb dan 1077 pb (Gambar 12). Berdasarkan sekuen acuan, dihasilkan tujuh pita DNA yang masing-masing berukuran 262 pb, 84 pb, 35 pb, 20 pb, 7 pb, 19 pb, dan 934 pb (Gambar 13). Lokasi situs pemotongan Rsa I pada sekuen acuan dapat dilihat pada lampiran 4. Lokasi situs pemotongan Hinc II pada sekuen acuan dapat dilihat pada lampiran pb 200 pb 158 pb 1077 pb TI T2 T3 T4 T5 IAJ INB AJ AB NJ1 NJ2 NJ3 NB1 NB2 NB3 Gambar 14 Hasil pemotongan dengan Hinc II. 200 pb Gambar 12 Hasil pemotongan dengan Rsa I. Perkiraan situs pemotongan berdasarkan sekuen acuan. 284 pb pb 262 pb 284 pb IAJ INB AJ AB NJ1 NJ2 NJ3 NB1 NB2 NB3 T1 T2 T3 T4 T Gambar 13 Perbandingan hasil pemotongan dengan Rsa I. 934 pb Perkiraan situs pemotongan berdasarkan sekuen acuan pb 1143 pb Gambar 15 Perbandingan hasil pemotongan dengan Hinc II. e. Pemotongan dengan enzim restriksi Bam HI (G\GATCC) dan Eco RI (G\AATTC). Penggunaan enzim restriksi Bam HI dan Eco RI tidak menghasilkan pita hasil pemotongan (Gambar 16 dan 17) pb 158 pb d. Pemotongan dengan enzim restriksi Hinc II (GT(T/C)\(A/G)AC). Pemotongan dengan enzim restriksi Hinc II menghasilkan dua pita DNA yang berukuran 1203 pb dan 158 pb (Gambar 14). Berdasarkan sekuen acuan, dihasilkan tiga pita DNA yang masing-masing berukuran 1143 pb, 60 pb, dan 158 pb (Gambar 15).

3 1500 pb ~1361 pb T1 T2 T3 T4 T5 IAJ INB AJ AB NJ1 NJ2 NJ3 NB1 NB2 NB3 Gambar 16 Hasil pemotongan dengan Bam HI. ~1361 pb T1 T2 T3 T4 T5 IAJ INB AJ AB NJ1 NJ2 NJ3 NB1 NB2 NB3 Gambar 17 Hasil pemotongan dengan Eco RI. Pembahasan DNA mitokondria mamalia merupakan DNA ekstrakromosomal berbentuk sirkuler tertutup. Ukuran mtdna pada kerbau berdasarkan GenBank Database (NCBI) dengan kode akses NC_ adalah pb. Amplifikasi D-loop dengan menggunakan sepasang primer dan menghasilkan produk PCR yang seragam yaitu sekitar 1361 pb. Pada beberapa sampel, ditemukan pita DNA non-spesifik (non-target). Munculnya pita DNA ini disebabkan oleh kondisi PCR, yaitu pengaturan suhu yang tidak optimum pada saat proses penempelan primer (annealing), dimana semakin rendah suhu maka semakin mudah terbentuk pita DNA non-spesifik (Sambrook et al. 1989). Hasil penelitian ini menunjukkan tidak terdapat polimorfisme fragmen D-loop pada situs-situs restriksi Hae III, Alu I, Rsa I, Hinc II, Bam HI, dan Eco RI. Hal ini berbeda dengan hasil penelitian pada anggota famili Bovidae yang lain yaitu sapi (Bos taurus) dan anoa (Bubalus depressicornis). Troy et al. (2001) mengatakan bahwa dari 383 sampel sapi yang dipelajari terdapat 152 haplotipe dan Rahajeng (1999) mengatakan bahwa pada anoa terdapat 7 haplotipe dari 10 sampel yang dipelajari. Fragmen D-loop yang cenderung monomorfik juga ditemukan pada hasil penelitian rusa timor (Cervus timorensis). Syafitri (2004) mengatakan bahwa tidak terdeteksi adanya variasi pada situs restriksi tertentu di daerah D-loop rusa timor, sehingga dapat dikatakan bahwa semua sampel rusa berasal dari nenek moyang yang sama. Bath et al. (1997), Amano et al. (1994), dan Misra et al. (1997) dalam Bath (1999) menyatakan adanya hasil penelitian yang menunjukkan bahwa mtdna pada kerbau cenderung kurang beragam. Dari 15 enzim restriksi yang digunakan untuk memotong seluruh genom mitokondria, 14 enzim tidak menunjukkan adanya variasi, kecuali pada enzim Bgl I. Laporan tersebut mengindikasikan bahwa mtdna kerbau mempunyai situs restriksi yang terkonservasi cukup tinggi, kecuali untuk Bgl I. Fragmen D-loop pada sampel kerbau tidak polimorfik dapat disebabkan oleh beberapa hal. Pertama yaitu karena kurangnya enzim restriksi yang digunakan. Kedua yaitu kemungkinan situs pemotongan enzimenzim restriksi yang digunakan

4 berada pada daerah D-loop yang tidak hipervariabel. Daerah D-loop merupakan daerah non coding pada mitokondria yang hipervariabel dengan laju mutasi yang lebih tinggi dibanding bagian lain dari mtdna (Silva et al. 2003). Tetapi tidak semua bagian pada D-loop hipervariabel. Berdasarkan Douzery & Randi 1997, D-loop terdiri dari tiga daerah. Daerah pertama terletak terletak dekat trna Prolin. Bagian ini mengandung Terminationassociated Sequence (TAS) dan Repeated Sequence (RS). Daerah kedua terletak di tengah. Daerah ini disebut Central Conserved Region (CCR) dan dicirikan oleh adanya beberapa CSB (Conserved Sequence Blocks) yaitu F, E, D, C, dan B. Daerah ketiga. dekat trna Phenilalanin. Daerah ini mengandung Promotor untuk inisiasi transkripsi Utas Berat maupun Utas Ringan (HSP dan LSP). Pada daerah ini juga terdapat CSB 1-3 dan ruas RS (Lampiran 6). Daerah pertama dan ketiga merupakan daerah yang hipervariabel sedangkan daerah kedua relatif stabil. Hasil pemotongan dengan Hae III menunjukkan kemungkinan bahwa situs pemotongan enzim tersebut terletak pada daerah kedua. Hasil pemotongan dengan Hinc II menunjukkan kemungkinan bahwa situs pemotongan enzim tersebut terdapat pada trna Phenilalanin. Hasil pemotongan dengan Alu I menunjukkan kemungkinan bahwa situs pemotongan enzim tersebut terletak di daerah pertama, kedua, dan ketiga pada D-loop, serta di daerah 12S rrna. Hasil pemotongan dengan Rsa I menunjukkan kemungkinan bahwa situs pemotongan enzim tersebuat terdapat di daerah pertama pada D-loop. Walaupun terdapat di daerah pertama pada D-loop, diduga situs pemotongan tersebut terdapat pada bagian D-loop yang tidak variabel. Kemungkinan ketiga adalah domestikasi kerbau yang kemungkinan berpusat di Indonesia. Domestikasi yaitu perubahan substansial pada suatu spesies yang telah dipelihara oleh manusia secara turun temurun dari generasi ke generasi, baik dalam penampilan maupun perilaku sehingga spesies inipun dinyatakan sebagai spesies yang teradaptasi dengan campur tangan manusia (Wikipedia 2005). Domestikasi kerbau di Asia Tenggara diduga berlangsung pada milenium ke-2 sebelum masehi (Cockrill 1984). Fahimudin 1975 menyatakan bahwa Indonesia merupakan salah satu pusat domestikasi kerbau di Asia Tenggara. Tempat lain yang diperhitungkan sebagai pusat domestikasi kerbau menurut Leslie 1967 adalah Laos, Kamboja, Vietnam Utara dan Selatan, serta Thailand. Karena Indonesia merupakan salah satu pusat domestikasi maka dapat dikatakan bahwa kerbau-kerbau yang tersebar di berbagai daerah di Indonesia berasal dari satu nenek moyang yang kemudian berkembang dan menyebar ke berbagai daerah. Dengan demikian dapat diduga bahwa kerbau-kerbau di Indonesia mempunyai D-loop dengan tingkat polimorfisme yang rendah. Kemungkinan lainnya adalah terjadinya introduksi kerbau ke Indonesia yang berasal dari satu sumber penyebaran. Karena hasil yang didapat monomorfik maka dapat disimpulkan bahwa belum didapat hubungan yang jelas antara variasi situs restriksi pada fragmen D-loop dengan warna kulit belang pada kerbau. Oleh sebab itu, berarti RFLP pada D-loop tidak dapat digunakan sebagai penciri khusus kerbau belang. Fenotip warna kulit belang pada kerbau kemungkinan dikontrol oleh gen yang

5 terdapat pada DNA inti seperti yang terdapat pada sapi. Pada sapi, gen penyandi warna kulit terdapat di DNA inti. Terdapat lima macam pola warna kulit pada sapi (Noor 2004). Sapi Hereford memiliki pola warna putih pada bagian tubuh depan dan bagian atas leher. Sapi Angus memiliki pola warna yang polos. Sapi FH (Frisien Holstein) mempunyai bercak putih tidak beraturan pada bagian tubuh yang berwarna hitam. Sapi Pinzgauer hanya berwarna pada kepala, leher, samping kiri dan kanan tubuh, sedangkan bagian tubuh lainnya berwarna putih. Terdapat sapi yang memiliki pola warna kulit campuran antara pola warna Hereford dan pola warna samping. Kelima pola warna tersebut dikontrol oleh 4 alel yaitu, S H yang mengontrol pola Hereford, alel S yang mengontrol pola warna Angus, alel s yang mengontrol pola warna FH, dan alel S c yang mengontrol pola warna samping. Derajat dominasi untuk S H, S dan s adalah S H > S > s. Gen yang berada di sebelah kanan resesif terhadap gen yang berada di sebelah kiri. Alel S C bersifat kodominan terhadap alel S H dan dominan lengkap terhadap S dan s. Sapi yang memiliki genotip S H S c akan memperlihatkan pola campuran antara pola warna Hereford dan pola warna samping. Genotipe dan Fenotipe yang berhubungan dengan warna kulit tersebut dapat dilihat pada Tabel 2. Tabel 2 Genotipe dan Fenotipe beberapa Genotipe Homozigot pola warna pada sapi (Noor 2004). Genotipe Heterozigot Fenotipe S H S H S H S, S H s Pola Hereford S c S c S c S, S c s Pola samping - S H c Pola samping dengan S wajah putih SS Ss Polos ss - Pola FH Pada kerbau apakah mengikuti pola seperti pada sapi atau mengikuti pola yang lain, perlu dilakukan penelitian lebih lanjut karena selama ini belum ada publikasi mengenai hal tersebut. KESIMPULAN DAN SARAN Amplifikasi fragmen DNA kerbau menggunakan primer dan menghasilkan produk sekitar 1361 pb. Hasil pemotongan dengan menggunakan enzim restriksi Hae III, Alu I, Rsa I, Hinc II, Bam HI, dan Eco RI tidak menunjukkan adanya variasi pada daerah D-loop (monomorfik). Hal tersebut dapat disebabkan karena beberapa hal. Pertama dapat disebabkan karena enzim restriksi yang digunakan terlalu sedikit. Kedua dapat disebabkan karena situs pemotongan enzim-enzim restriksi yang digunakan berada pada daerah D-loop yang tidak hipervariabel. Ketiga dapat disebabkan karena Indonesia merupakan salah satu pusat domestikasi kerbau di Asia Tenggara atau telah terjadi introduksi kerbau ke Indonesia yang berasal dari satu sumber penyebaran, sehingga dapat dikatakan bahwa kerbau-kerbau tersebut berasal dari satu nenek moyang yang sama. Dari hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa belum ditemukan hubungan antara variasi situs restriksi pada fragmen D-loop dengan warna kulit belang pada kerbau. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mendapatkan data yang lebih akurat, seperti penggunaan enzim restriksi yang berbeda serta perbandingan hasil sequencing pada sampel yang lebih beragam dan lebih banyak. DAFTAR PUSTAKA Bhat PN Buffaloes. Di dalam : Payne WJA, Wilson RT. An Introduction to