S2-Kimia Institut Pertanian Bogor BIOESAI MELIBATKAN ENZIM

Transkripsi

1 OH OH O OH OH S2-Kimia Institut Pertanian Bogor BIOESAI MELIBATKAN ENZIM Agenda Pendahuluan Yang perlu diperhatian untuk esai dengan enzim Pengembangan metode esai cepat enzim untuk penapisan bahan alam: Contoh 1

2 Pendahuluan Enzim tertentu adalah molekul target untuk penemuan obat dan banyak obat ditemukan dengan melibatkan enzim target dalam penapisannya. Biasanya esai ini memanfaatkan enzim yang dimurnikan sebagian atau murni dari manusia dan melibatkan pengukuran pembentukan produk menggunakan beberapa metode seperti radiometri, kolorimetri dan fluorometri Yang perlu diperhatikan dalam pengembangan esai dengan enzim Sumber enzim Konsentrasi enzim yang digunakan Menentukan dan konsentrasi esai akhir Perlunya kofaktor dan konsentrasi esai akhir Penentuan batas akhir analisis ph analisis Suhu analisis Profil inhibitor Kompatibiliti DMSO Kompatibiliti ekstrak 2

3 Yang perlu diperhatikan dalam pengembangan esai dengan enzim Sebelum mengembangkan metode esai enzim, perlu dipelajari mekanisme reaksi enzim yang mungkin. Apakah reaksi enzim melibatkan satu jenis atau multi, mekanisme katalisis, apa kofaktor yang diperlukan faktor yang meregulasi aktivitas enzim Yang perlu diperhatikan dalam pengembangan esai dengan enzim Memilih sumber enzim Memilih konsentrasi enzim Memilih dan konsentrasi Memilih konsentrasi kofaktor Memilih ph analisis Memilih suhu analisis Kompatibilitas DMSO Kompatibilitas ekstrak Profil inhibitor Inhibisi kompetitif Inhibisi unkompetitif Inhibisi nonkompetitif 3

4 Memilih sumber enzim Sebaiknya yang berasal dari manusia untuk tujuan pengobatan Sebagian besar enzim yang diisolasi dari spesies yang berbeda mungkin sangat homolog tapi mungkin tidak sama sifatnya dengan enzim manusia Umumnya sulit mengisolasi enzim langsung dari manusia Sel manusia atau cell lines secara praktis merupakan sumber enzim Setelah sumber enzim ditentukan murnikan enzim hingga jumlah yang cukup untuk penapisan Pemurnian enzim memberikan bobot yang kecil karena kehilangan selama pemurnian atau rusak saat dimurnikan Memilih sumber enzim Metode yang paling mudah untuk memproduksi enzim untuk esai penapisan ialah melakukan clone dan ekspresi enzim manusia pada sistem yang sesuai Beberapa suplayer telah menyediakan enzim dengan beberapa tingkat kemurnian Makin murni biasanya makin tinggi keaktifannya tapi biayanya lebih mahal 4

5 Memilih konsentrasi enzim Jumlah enzim yang digunakan dalam esai sebaiknya diminimalkan tetapi tetap harus memenuhi syarat S/N yang baik Dicoba esai menggunakan enzim dengan beberapa konsentrasi lalu diputuskan berapa konsentrasi enzim terrendah yang baik digunakan untuk esai tsb Stabilitas enzim sering berkurang karena penyimpanan perlu dicek sebelum melakukan esai Memilih dan konsentrasi A. esai enzim reversible dengan 1 Substrat tipe ini biasanya tinggi afinitasnya untuk berinteraksi dengan enzim cukup dengan jumlah yang sedikit dapat memberikan esai yang sensitif untuk identifikasi inhibitor yang berkompetisi dengan pada sisi aktif Secara fisiologis yang digunakan biasanya memiliki nilai Km yang kecil, tetapi beberapa esai menggunakan peptida sintesis atau turunan peptida. Km enzim untuk tertentu ditentukan secara percobaan dengan menentukan hubungan konsentrasi pada laju reaksi awal 5

6 Memilih dan konsentrasi A. esai enzim reversible dengan 1 Pada konsentrasi rendah, laju reaksi awal setara dengan konsentrasi dan reaksi mengikuti laju reaksi orde pertama terhadap. Jika konsentrasi enzim meningkat laju reaksi tidak bergantung pada konsentrasi atau laju mengikuti reaksi orde ke-nol. Berdasarkan persamaan Michaelis- Menten untuk tunggal: Memilih dan konsentrasi A. esai enzim reversible dengan 1 Secara umum, direkomendasikan bahwa nilai Km dari dimasukkan dalam esai enzim dengan satu. Di bawah nilai Km, S/N akan terlalu rendah Penggunaan enzim di atas nilai Km akan meningkatkan nilai S/N tetapi makin tidak sensitif dalam mendeteksi inhibitor kompetitif karena sangat banyak nya 6

7 Memilih dan konsentrasi B. esai enzim reversible dengan 2 Penentuan Km untuk 2 mirip dengan metode 1 Konsentrasi B tetap pada tingkat jenuh dan konsentrasi A bervariasi untuk ditentukan efeknya pada laju reaksi dan nilai Km untuk A yang ditulis sebagai KmA Secara umum 3 konsentrasi B yang tetap digunakan Kebalikannya KmB ditentukan pada konsentrasi A jenuh yang tetap dan konsentrasi B bervariasi Reaksi enzim - 2 umumnya berada pada 2 kelas umum yaitu single- dan double- displacement enzyme reaction Memilih dan konsentrasi B. esai enzim reversible dengan 2 Reaksi enzim single-displacement: kedua A dan B akan berikatan dengan enzim untuk membentuk kompleks ternary. Substrat A dan B akan berasosiasi dengan enzim dalam keadaan acak atau beraturan Reaksi enzim double-displacement, satu harus berikatan pada enzim dan satu produk dilepaskan sebelum kedua berikatan dan berdisosiasi dari enzim 7

8 Memilih dan konsentrasi B. esai enzim reversible dengan 2 Dalam reaksi 2 dapat ditentukan esai digunakan untuk inhibitor A atau B yang berinteraksi dengan enzim Contoh: reaksi protein kinase Substrat: ATP dan peptida yang akan difosforilasi Biasanya digunakan inhibitor uantuk peptida fosfat dan bukan inhibitor untuk ATP Esai melibatkan jumlah ATP yang jenis dan nilai Km untuk peptida Akan dihasilkan esai yang sensitif untuk mendapatkan inhibitor kompetitif Memilih konsentrasi kofaktor Banyak enzim memerlukan kofaktor untuk aktivitas maksimal Setelah kofaktor ditentukan, perlu ditentukan konsentrasi kofaktor yang diperlukan untuk aktivitas enzim yang optimal Secara umum, konsentrasi jenuh harus digunakan dalam esai penapisan Contoh esai enzim NO sintase harus mengandung jumlah kofaktor NADPH, tetrahidrobiofterin, kalsium dan kalmodulin dalam konsentrasi jenuh 8

9 Memilih titik akhir esai 3 tipe esai yang umum digunakan: Radiometrik sangat sensitif dan bisa untuk automatis, perlu dan produk yang terlabel, tidak baik untuk volume yang besar karena biaya yang mahal dan limbahnya Kolorimetrik kurang sensitif tetapi banyak untuk high troughput screening. Perhatikan warna sampel yang mungkin muncul yang mengganggu nilai titik akhir Fluorometrik sangat sensitif dan digunakan HTS. Natural produk dapat mengganggu nilai titik akhir. Yang paling banyak digunakan karena S/Nnya memungkinkan dia untuk diminiaturisasi Memilih ph esai Kebanyakan enzim memiliki nilai ph optimum untuk aktivitas maksimal Hubungan aktivitas enzim dan ph untuk enzim merupakan fungsi lonceng Perlu menentukan ph optimum dengan pengukuran sederhana pada nilai ph yang berbeda untuk konsentrasi jenuhnya Nilai Km juga bergantung ph yang digunakan 9

10 Memilih suhu esai Suhu esai juga penting untuk ditentukan Umumnya reaksi enzim meningkat dengan meningkatnya suhu (laju meningkat 2 kali tiap kenaikan 10 o C) Tetapi peningkatan suhu dapat mendenaturasi enzim atau terjadi proteolisis pembatas suhu inkubasi Untuk tujuan praktis esai biasanya dilakukan pada suhu ruang sehingga tidak memerlukan inkubator Kompatibitas DMSO Ekstrak kering natural produk biasanya dilarutkan dalam DMSO sebelum digunakan untuk uji Semakin tinggi konsentrasi DMSO dalam esai, semakin tinggi kemungkinan metabolit sekunder ada di dalam larutan Perlu diperhatikan apakah esai enzim tolerance terhadap konsentrasi DMSO berbeda yang digunakan 10

11 Kompatibitas Ekstrak Senyawa kimmia berbeda dalam ekstrak dari berbagai organisme memberikan tipe metabolit sekunder yang berbeda Perlu dievaluasi dan ditentukan konsentrasi optimalnya termasuk dalam skrining Secara umum yang digunakan antara 0.1% - 1% Profil Inhibitor Perlu mengetahui tipe inhibitor Nilai Ki dan mekanisme inhibisi dapat ditentukan dibandingkan dengan informasi dari literatur Aktivator enzim juga merupakan info yang menarik untuk diketahui 3 tipe inhibitor enzim cek dari Vmax dan nilai Km ditentukan Ki-nya Kompetitif Unkompetitif nonkompetitif 11

12 Profil Inhibitor Inhibisi Kompetitif Inhibitor yang berkompetisi dengan pada sisi aktif enzim Inhibisi kompetitif dapat berkurang dengan meningkatkan konsentrasi Km meningkat, tidak mengubah Vmax Profil Inhibitor Inhibisi Unkompetitif Inhibitor yang tidak berinteraksi dengan enzim bebas tetapi berinteraksi dengan kompleks enzim sehingga menghambat pembentukan produk Km dan Vmax turun saat ada inhibitor 12

13 Profil Inhibitor Inhibisi Nonkompetitif Inhibitor yang berinteraksi dengan enzim bebas atau dengan kompleks enzim- Biasanya berikatan dengan enzim bukan pada sisi aktif dan mengubah konformasi enzim sehingga enzim tidak berfungsi sehingga tidak terbentuk kompleks -enzim atau dekomposisi menghasilkan satu produk dengan laju tipikal Jarang ditemukan, kadang disebut mixed inhibition Km tetap dan Vmax turun saat ada inhibitor Profil Inhibitor Dari poin pencarian obat, inhibitor nonkompetitif tidak terlalu diutamakan dibandingkan inhibitor kompetitif dan diperkirakan lebih nonselektif dan dapat menghambat berbagai enzim Untuk enzim 2, pengaruh peningkatan konsentrasi inhibitor dievaluasi pengaruhnya dihubungkan dengan A dan B pada nilai Km dan Vmax ditentukan dari hubungan Lineweaver-Burk 13

14 Pengembangan metode esai cepat enzim untuk penapisan bahan alam: Contoh Farnesiltransferase: enzim yang mengatalisis penambahan C15 farnesil isoprenoid ke protein pada asam amino C terminal Ras: fisiologis Beberapa kanker manusia resisten untuk obat antikanker konvensional seperti kanker kolon dan pankreas, kadar Ras protein yang termutasi ditemukan tinggi Inhibitor Ras farnesilasi merupakan agen antikanker Enzim yang mengandung Zn protein sitosolik heterodimer mengandung subunit dan yang memerlukan ion Zn dan Mg untuk aktivitas Pengembangan metode esai cepat enzim untuk penapisan bahan alam: Contoh Farnesiltransferase: subunit berikatan dengan farnesilpirofosfat dan dibagi ke enzim isoprenilasi yang berhubungan seperti geranilgeraniltransferase. Sub unit berikatan dengan. Perlu dicek tipe inhibitor apa yang ditentukan Inhibitor kompetitif ikatan farnesilpirofosfat tidak diharapkan karena akan juga menjadi inhibitor untuk geranilgeranil transferase selektivitasnya berkurang dan menyebabkan efek kebalikan. Yang dicari inhibitor pada subunit karena lebih selektif Perlu mencari sumber enzim farnesiltransferase yang cocok, otak tikus tidak cocok (50 otak tikus hanya untuk 100 assay plates) 14

15 Pengembangan metode esai cepat enzim untuk penapisan bahan alam: Contoh Farnesiltransferase: Metode radiometrik Tirosinase Eumelanogenesis Feomelanogenesis tirosin O TYR NH2 O TYR dopakuinon NH2 glutation atau sistein S NH2 dopa NH2 H2N sisteinildopa O O IQ DHI N H TYR N H O -CO2 - O dopakrom DHICA N H + TRP-2 N H O TRP-1 N H leukodopakrom O ICAQ N H N S HBTA feomelanin NH2 eumelanin campuran melanin 15

16 Metode Tirosinase mushroom Sampel atau pelarut L-tirosin L-DOPA () 5 min Kontrol positif: Asam kojat IC min Absorbans pada 490 nm Jerawat Acne is the most common skin disease characterized by pimples on the face, chest, and back. It occurs when the pores of the skin clogged with oil, dead skin cells, and bacteria (Propionibacterium acnes). bacteria antibacterial lipase triglycerides free fatty acids Lipase inhibitor bacteria grow antioxidant Inflammation ROS acne is formed 32 16

17 Lipase inhibitory assay DTNB PMSF BALB Crude lipase (e) Sample or solvent DTNB: 5,5 -dithiobis(2-nitrobenzoic acid) PMSF: phenylmethylsulphonyl fluoride BALB: dimercaptopropanol tributyrate 30 o C 5 min 30 o C 30 min Stopping reagent Positive controls: Tetracycline Chloramphenicol IPMP Absorbance at 414 nm IC 50 : concentration that can inhibit 50% lipase reaction 33 17