METODE PENELITIAN Waktu dan Tempat Penelitian Alat dan Bahan Prosedur Penelitian

Transkripsi

1 METODE PENELITIAN Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Desember 2010 sampai dengan Mei 2011 di Laboratorium Kimia Organik, Departemen Kimia Institut Pertanian Bogor (IPB), Pusat Studi Biofarmaka (LPPM) IPB, dan Pusat Laboratorium Forensik Mabes POLRI Jakarta. Alat dan Bahan Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah pelat KLT silika gel GF 254, kolom kromatografi silika gel (Merck; mesh; 1 25 cm), Spektrofotometer UV-Vis merk U-2800, GC-MS merk Agilent Technologies, rotary evaporator, destilator, dan eksikator. Bahan yang digunakan adalah rimpang bangle hantu segar dan kering yang berasal dari Kebun Pusat Studi Biofarmaka Cikabayan Bogor, enzim lipase manusia dengan kode L units, buffer fosfat, minyak wijen ABC, pereaksi tembaga, kloroform, heptana, Xenical (orlistat), dan Na-dietilditiokarbamat. Prosedur Penelitian Sampel berupa rimpang bangle hantu diambil langsung dari Kebun Pusat Studi Biofarmaka Cikabayan Bogor. Sampel dideterminasi di LIPI Cibinong tujuannya untuk menghindari kesalahan dalam pemilihan sampel. Sampel dicuci sampai bersih untuk menghilangkan kotoran yang menempel, setelah itu dikeringkan dengan cara diangin-anginkan pada suhu ruangan, dan dibuat dalam bentuk serbuk. Sedangkan untuk sampel segar, bangle hantu setelah dicuci, diiris tipis, selanjutnya didestilasi untuk menghasilkan minyak atsiri. Penetapan kadar air ditunjukkan pada Lampiran 2, serbuk diekstraksi dan diuji fitokimia (Lampiran 4.), ekstrak diuji aktivitas inhibitor lipase pankreas in vitro (Lampiran 6). Ekstrak teraktif dipisahkan dengan kromatografi kolom silika gel dan diperoleh fraksi teraktif. Bagan alir penelitian ditunjukkan pada Gambar 4.

2 Ekstraksi Sebanyak 5 kg rimpang bangle hantu segar diiris kemudian dimasukkan ke dalam distilator secara bertahap, lalu ditambahkan akuades dengan perbandingan sampel:akuades (1:2), selanjutnya proses destilasi air dilakukan selama 4 jam pada suhu C. Destilat yang diperoleh kemudian didiamkan selama 24 jam, lalu minyak yang terdapat dalam destilat dipisahkan dari lapisan airnya dan disimpan pada suhu 4 C. Minyak yang diperoleh selanjutnya di uji inhibitor lipase pankreasnya dan di analisis dengan menggunakan GC-MS untuk mengetahui komponen senyawanya (Sabulal 2006). Ekstraksi sampel kering rimpang bangle hantu menggunakan metode maserasi untuk menghasilkan senyawa metabolit sekunder yang terdapat pada simplisia dengan menggunakan pelarut yang sesuai. Pelarut yang digunakan pada penelitian ini ada tiga macam, yaitu etanol, etil asetat, dan n-heksana yang mempunyai kepolaran berbeda dan dilakukan beberapa pengulangan secara berurutan. Pertama, sebanyak 900 g serbuk sampel direndam dalam n-heksana (1:4) sebanyak dua kali ulangan selama 24 jam lalu disaring untuk menghasilkan senyawa nonpolar. Kedua, residu hasil dari ekstraksi n-heksana direndam dalam pelarut etil asetat (1:4) untuk mengekstraksi senyawa yang lebih polar dari ekstrak pertama. Ketiga, maserasi residu hasil dari ekstraksi etil asetat menggunakan pelarut etanol (1:4) untuk mengekstraksi senyawa polar. Selanjutnya ekstrak n- heksan, etil asetat dan etanol dipekatkan dengan penguap putar vakum untuk menghilangkan pelarutnya. Ekstrak kental yang dihasilkan dari masing-masing pelarut kemudian di uji antiobesitas dengan menggunakan enzim lipase pankreas manusia. Ekstrak yang memiliki aktivitas tertinggi dianalisis menggunakan KLT yang berfungsi membantu menentukan pelarut terbaik apa yang akan digunakan sebagai fase gerak pada kromatografi kolom. Kromatografi Kolom Kromatografi kolom dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan campuran senyawa pada ekstrak kental yang memiliki aktivitas inhibitor lipase pankreas menjadi senyawa murninya dengan menggunakan fase diam berupa silika gel Merck ukuran mesh, dimensi 1 25 cm, dan fase geraknya berupa pelarut

3 yang memiliki spot terbanyak terbanyak dan terpisah dengan baik pada KLT. Hasil kromatografi kolom ditampung setiap 5 ml dan dianalisis menggunakan KLT, selanjutnya fraksi yang diperoleh di uji aktivitas enzim lipase pankreas secara in vitro. Uji In vitro Metode uji in vitro yang digunakan mengacu pada metode Han et al (2005) dengan beberapa modifikasi yaitu menggunakan substrat triolein, buffer N- tris-(hidroksimetil)-metil-2-aminoetana-asam sulfat pada ph 7, suhu 37 C dengan waktu inkubasi 30 menit, dan larutan pengompleks warna batokuproin dalam klo roform 0.05% (b/v). Metode uji yang digunakan yaitu menggunakan minyak wijen sebagai substrat dan pereaksi-pereaksi lain yang lebih sederhana. Sebanyak 15 µl substrat dan 100 µl ekstrak sampel dimasukkan ke dalam tabung reaksi lalu ditambah dengan 10 µl albumin 10% dan 1 ml larutan buffer ph 8. Setelah itu 100 μl enzim lipase pankreas dengan konsentrasi µg/µl dimasukkan ke dalam tabung tersebut dan diinkubasi selama 45 menit pada suhu 40 C, selanjutnya ditambahkan 3 ml kloroform. Larutan dalam tabung kemudian disentrifuse dengan kecepatan 1500 g selama 5 menit. Sebanyak 1 ml lapisan kloroform kemudian diambil dan ditambahkan 4 ml kloroform-heptena (1:1, v/v) lalu dikocok hingga homogen. Setelah itu larutan ditambahkan 2.5 ml pereaksi tembaga, dikocok 3 menit, dan disentrifuse kembali selama 10 menit. Lapisan kloroform kemudian diambil sebanyak 3 ml dan ditambahkan 0.25 ml larutan Na-dietilditiokarbamat, hingga berwarna kuning. Larutan kemudian diukur serapannya dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 435 nm. Nilai yang diperoleh kemudian dikonversi dengan perhitungan sehingga diperoleh nilai aktivitas enzim. Aktivitas enzim dinyatakan dalam µmol asam oleat/l.menit. Kontrol negatif dilakukan tanpa penambahan ekstrak, sedangkan untuk kontrol positif dilakukan dengan mengganti ekstrak dengan Xenikal (Pradono et al. 2005). Tahapan ini ditunjukkan pada Lampiran 6. Prosedur pembuatan pereaksi tembaga dan natrium dietilditiokarbamat ditunjukkan pada Lampiran 5. Perhitungan lipase pankreas ditunjukkan pada Lampiran 7.

4 Selanjutnya fraksi hasil kromatografi kolom yang menunjukkan daya hambat paling tinggi dibandingkan dengan daya hambat pada minyak atsiri dan kristal minyak atsiri bangle hantu untuk mengetahui daya hambat paling tinggi yang selanjutnya akan di analisis dengan GC-MS untuk mengetahui senyawa aktif yang terkandung di dalamnya.

5 Sampel segar Bangle Hantu Determinasi Ekstrak kasar Bangle Hantu Destilasi Maserasi bertingkat (n-heksan, etil asetat, etanol) Minyak atsiri Ekstrak n-heksana Ekstrak etil asetat Ekstrak etanol Uji fitokimia Uji inhibisi enzim Ekstrak terpilih Kromatografi kolom Uji fitokimia Uji inhibisi enzim Fraksi 1 Fraksi 2 Fraksi n Uji inhibisi enzim Fraksi teraktif Analisis Senyawa aktif Gambar 4 Diagram alir penelitian