KARAKTERISASI GENOM MlTOKONDRlA LABI-LABI, Dogania subplana (TRIONYCHIDAE, TESTUDINES, REPTILIA)

Transkripsi

1 KARAKTERISASI GENOM MlTOKONDRlA LABI-LABI, Dogania subplana (TRIONYCHIDAE, TESTUDINES, REPTILIA) ACHMAD FARAJALLAH PROGRAM PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2002

2 ABSTRAK ACHMAD FARAJALLAH (985098). Karakterisasi genorn rnitokondria labi-labi, Dogania subplana, (Trionychidae, Testudines, Reptilia). Komisi pernbirnbing: Prof.Dr. Nawangsari Sugiri, Prof. Osarnu Takenaka, D.Sc., Barnbang Suryobroto, D.Sc., dan Dr. M.F. Rahardjo. Runutan nukleotida lengkap genorn rnitokondria (rntdna) labi-labi, Dogania subplana, telah dilakukan. Ukuran rntdna labi-labi adalah bp. Organisasi, orientasi dan ukuran setiap gen dari 13 gen penyandi protein rntdna, 22 gen penyandi trna dan dua gen penyandi rrna serta daerah kontrol adalah serupa dengan yang telah diternukan pada vertebrata lainnya. Panjang daerah kontrol adalah 1820 bp, yang di dalarnnya bisa diternukan tiga motif runutan DNA berulang. Motif pertarna dan kedua berturut-turut adalah 15 bp dan 37 bp, yang keduanya berulang secara tandem sarnpai 728 bp. Motif ketiga adalah ruas TA berulang, yaitu (TA)n dan (ATAlT)n. Motif ketiga ini disebut rnikrosatelit rnitokondria. Analisis terhadap daerah kontrol rnenernukan adanya domain tengah yang stabil untuk sernua anggota Testudines, dan adanya tiga macarn Conserve Sequence Blocks yang hornolog dengan daerah kontrol rntdna vertebrata. Berdasarkan domain tengah daerah kontrol, keragarnan nukleotida D. subplana di lndonesia cukup tinggi (0.21%). Selain itu, penyebaran labi-labi di lndonesia rnengikuti penyebaran vikarian. Populasi 0. subplana Surnatera Bagian Selatan mernpunyai afinitas yang tinggi ke populasi Jawa dibanding ke populasi Bengkulu. Trionychidae merupakan kelornpok yang rnonofiletik berdasarkan analisis parsirnoni dan neighbourjoining rnenggunakan gabungan data runutan nukleotida Cyt b, trna Phe, trna Pro dan domain tengah daerah kontrol rntdna. Kata kunci: Labi-labi, Testudines, genorn rnitokondria, runutan DNA, keragarnan nukleotida, filogeni rnolekular

3 ABSTRACT ACHMAD FARAJALLAH (985098). Characterization of mitochondrial genome of the soft-shelled turtle, Dogania subplana, (Trionychidae; Testudines; Reptilia). Advisory committe: Prof.Dr. Nawangsari Sugiri, Prof. Osamu Takenaka, D.Sc., Bambang Suryobroto, D.Sc., and Dr. M.F. Rahardjo. Complete nucleotide sequence of Malayan soft-shelled turtle, Dogania subplana, mitochondrial genome (mtdna) was determined. The total length of the sequence was bp. The organization, orientation and individual gene size of 13 protein-coding genes, 22 trna genes, two rrna genes (1 2s and 16s rrna), and the control region were identical to the typical vertebrate arrangement. The control region is 1820 bp long that contains three repeat sequences. The first and the second repeated motifs were 15 bp and 37 bp long, repectively, and spanned 728 bp. The third repeat sequence consisted of two motifs which are (TA)n and (ATATT)n; they are named as mitochondrial microsatellites. Analysis of this control region permitted the identification of the middle conserved domain of all Testudines, and three types of Conserve Sequence Blocks, which have high homology to vertebrate mtdna. Nucleotide diversity of the middle conserved domain of D. subplana in Indonesia is relatively high (0.21%). Based on the nucleotide sequences, D. subplana is shown to be vicariantly distributed in Indonesia. D. subplana population of South Sumatra has high affinity to Java compared to Bengkulu. Trionychidae as a monophyletic group was supported by parsimony and neighbor joining analyses using combined sequence data of Cyt b, trna Phe, trna Pro, and the middle conserved domain of mtdna. Keyword: Softshelled turtle, Testudines, mitochondrial genome, DNA sequence, nucleotide diversity, molecular phylogeny

4 SURAT PERNYATAAN Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi yang berjudul: "Karakterisasi genom mitokondria iabi-labi, Dogania subplana (Trionychidae, Testudines, Reptilia)" adalah benar karya saya sendiri dan belum pernah dipublikasikan. Semua sumber data dan informasi yang digunakan telah dinyatakan secara jelas dan dapat diperiksa kebenarannya. Bo hfl or, Septe ber 02

5 KARAKTERISASI GENOM MlTOKONDRlA LABI-LAB1, Dogania subplana (TRIONYCHIDAE, TESTUDINES, REPTILIA) oleh ACHMAD FARAJALLAH Disertasi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Doktor pada Program Studi Biologi PROGRAM PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2002

6 n - &Ay?- *;i - -4-,..*- - s.d - 'em - - ;, Kamkterisasi Genorn Mtokondriabbbi4abi;-~~~ia aubp/ana, (Trionychibae; Testudines; Reptilia) Nama~ ' : Achmad Farajallah..,NRP- - : m, P: Studi: Bidogi ;.' Menyetujui, 1. Komisi Pembimbing,i -, Pmf. Dr. NdG;anasan ' -. --; 'L., - * - ' Suairi Prof. Osamu Takenak. D.Sc, Anggota Tanggal Lulus : 28 hi 2002

7 Nama : Achmad Farajallah Tempat, Tanggal Lahir : Sampang - Madura, 27 April 1965 Pekerjaan Alamat Kantor Status Perkawinan Riwayat Peke jaan sekarang Riwayat Pendidikan : Dosen di Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan IPA, lnstitut Pertanian Bogor : Laboratorium Zoologi Jurusan Biologi FMlPA IPB Gedung Zoologi dan Biokimia Lantai II Kampus Gunung Gede Jalan Raya Pajajaran Bogor : Kawin : Calon Pegawai Negeri di Jurusan Biologi, FMlPA IPB : Dosen di Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan IPA, IPB : SD, SMP dan SMA di Sampang Madura : Tingkat Persiapan Bersama IPB : S1, Program Studi Biologi, FMlPA IPB : S2, Program Studi Biologi Program Pascasa rjana IPB : S3, Program Studi Biologi Program Pascasarjana IPB

8 KATA PENGANTAR Tulisan ini berisi hasil penelitian tentang keragaman genetik labi-labi, Dogania subplana, di Indonesia berdasarkan runutan nukleotida genom mitokondria, dan filogeni anggota ordo Testudines. Penelitian dilaksanakan untuk menyusun disertasi sebagai syarat memperoleh gelar Doktor dalam bidang studi Biologi di Program Pascasarjana lnstitut Pertanian Bogor. Untuk itu, penulis sampaikan terima kasih yang mendalam kepada komisi pembimbing, yaitu Prof.Dr. Nawangsari Sugiri, Prof. Osamu Takenaka D.Sc., Bambang Suryobroto, D.Sc. dan Dr. M.F. Hahardjo atas segala kesabaran, ketelitian dan dukungannya selama penulis menempuh program doktor. Terima kasih khusus kepada Prof. Osamu Takenaka, D.Sc. yang telah memperkenalkan penulis ke pendekatan molekular terbaru untuk menganalisis biodiversitas hewan. Dalam kesempatan ini pula, penulis sampaikan terima kasih kepada Dr. Muladno dan Dr. Jatna Supriatna atas komentar dan koreksinya. Selain itu, penulis sampaikan terima kasih yang mendalam kepada Bapak. Go Bang, A Cun, Benny Prakasa Putra, Kasmirudin M.Si., Nasarudin M.Si, Qodri Madang M.Si., Dra. Titisari Puntorini dan Haerul Azhar atas kerjasama yang saling menguntungkan dalam menangkap dan memperoleh sampel labi-labi dan kura-kura. Penulis menikmati interaksi yang hangat dan saling mendukung dari rekan sejawat, staf teknisi, staf administrasi dan para mahasiswa di Department of Molecular and Cellular Biology, Primate Research Institute U niversitas Kyoto dan d i Laboratorium Zoologi FMlPA IPB, yang kalau disebutkan satu persatu terlalu banyak, terima kasih. dukungannya. Untuk isteri, anak-anak dan ibu, terima kasih atas kesabaran dan Akhimya, ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada lembaga yang memberi dukungan finansial atau fasilitas penelitian selama penulis menempuh program doktor, yaitu DlKTl melalui BPPS, PRI-Kyoto University, PPS IPB, FMlPA IPB dan JBA-MITI-BPPT Biodiversity Project.

9 DAFTAR IS1 RIWAYAT HlDUP KATA PENGANTAR DAFTAR IS1 DAFTAR TABEL DAFTAR GAMBAR DAFTAR LAMPIRAN DAFTAR SINGKATAN BAB 1. PENDAHULUAN UMUM Klasifikasi Kura-kura Labi-labi Posisi Filogeni Kura-kura dalam Amniota Distribusi, Filogeni dan Sistematika Kura-kura Karakteristik Genom DNA Mitokondria Vertebrata Tujuan Penelitian BAB 2. BAHAN DAN METODE Penentuan Runutan Lengkap Nukleotida mtdna D. subplana Keragaman Daerah Kontrol mtdna Labi-labi, D. subplana, di Indonesia Filogeni Kura-kura di lndonesia Berdasarkan Runutan Cyt b, trna Pro, trna Thr dan Domain Tengah dari Daerah Kontrol BAB 3. RUNUTAN NUKLEOTIDA LENGKAP GENOM MlTOKONDRlA LABI-LABI, DOGANIA SUBPLANA Pendahuluan Hasil Pembahasan Kesimpulan BAB 4. KERAGAMAN DNA DAERAH KONTROL LABI-LABI, DOGANIA SUBPLANA, Dl INDONESIA Pendahuluan Hasil

10 Pembahasan Kesimpulan BAB 5. FlLOGENl MOLEKULAR KURA-KURA, LABI-LAB1 DAN PENYU BERDASARKAN RUNUTAN DNA CYT B, trna THR, trna PRO DAN DOMAIN TENHA DAERAH KONTROL GENOM MlTOKONDRlA Pendahuluan Hasil Pembahasan Kesimpulan DAFTAR PUSTAKA LAMPIRAN

11 DAFTAR TABEL Nomor Te ks Halaman 1.1 Tabel 1.1. Klasifikasi kura-kura (Gaffney 1975; Hirayama 1984; Meylan Karakteristik mtdna labi-labi, D. subplana Komposisi nukleotida mtdna D. subplana (%) Jumlah penggunaan kodon (huruf cetak tegak) dan nilai indeks penggunaan kodon (huruf cetak miring) dalam mtdna D. subplana Sampel Labi-labi Dogania subplana dan haplotipe mtdna Jarak genetik antar haplotipe D. subplana berdasarkan domain tengah dari daerah kontrol mtdna (di bawah diagonal) dan standart error (di atas diagonal) yang diduga menggunakan metode bootstrap dengan 1000 ulangan Divergensi nukleotida dalam populasi (di diagonal), divergensi nukleotida antar populasi (di bawah diagonal) dan total divergensi nuleotida antar populasi (di atas diagonal) dari D. subplana Sampel spesies kura-kura dan ukuran produk PCR (bp) menggunakan primer (Cyt b - TAS), primer (TAS - CSBIII) dan primer Jarak genetik (di bawah diagonal) menggunakan metode 2 parameter Kimura dan rasio transisi terhadap transversi (di atas diagonal) berdasarkan kombinasi data dari nukleotida pertama dan kedua gen Cyt b, gen trna dan domain tergah daerah kontrol mtdna Jarak genetik (di bawah diagonal) menggunakan metode 2 parameter Kimura dan rasio transisi terhadap transversi (di atas diagonal) berdasarkan ketiga nukleotida setiap kodcn gen Cyt b ' 5.4 Jarak genetik (di bawah diagonal) menggunakan metode 2 parameter Kimura dan rasio transisi terhadap transversi (di atas diagonal) berdasarkan nukleotida pertama dan kedua setiap kodon gen Cyt b 95

12 DAFTAR GAMBAR Nomor Te ks Halaman 1.I Beberapa hipotesis hubungan filogeni testudines dan anggota amniota Peta pemotongan Mbol dan posisi penempelan primer (angka cetak tebal) dalam mtdna D. subplana Peta genetik mtdna D. subplana Runutan lengkap nukleotida dan karakteristik mtdna D. subplana Runutan nukleotida dan struktur sekunder gen-gen trna mtdna D. subplana Struktur batang dan gelung dari OnL (titik asal replikasi utas L) mtdna D. subplana Struktur batang dan gelung dari dua motif runutan DNA berulang di bagian ujung 5' daerah kontrol mtdna D. subplana Hubungan filogeni antar anggota amniota berdasarkan kombinasi runutan nukleotida dari gen-gen penyandi protein (kecuali gen-gen ND3, ND4L dan ND6), penyandi trna (kecuali gelung DHU dan Vc) Hubungan filogeni antar anggota amniota berdasarkan runutan asam amino yang ditranslasikan dari gen-gen penyandi protein (kecuali gen-gen ND3, ND4L dan ND6) Peta pengambilan sampel labi-labi D. subplana Posisi runutan nukleotida yang beragam antar haplotipe mtdna D. subplana Pohon filogeni Neighborjoining antar haplotipe D. subplana Pohon filogeni yang dihasilkan metode Minimum Evolution (A) dan UPGMA (B) antar haplotipe D. subplana Organisasi gen antara Cyt b dan daerah kontrol dalam mtdna Testudines Perbandingan runutan nukleotida gen Cyt b beberapa spesies kura-kura menggunakan ClustalW yang dibantu dengan hasil translasi ke asam aminonya Perbandingan runutan nukleotida gen-gen trna Thr dan trna Pro beberapa spesies kura-kura berdasarkan struktur sekundernya 100

13 5.4 Perbandingan runutan nukleotida domain tengah daerah kontrol dari mtdna beberapa spesies kura-kura menggunakan ClustalW Hubungan filogeni antar spesies kura-kura berdasarkan kombinasi data dari gen-gen Cyt b, trna Thr, trna Pro, dan domain tengah dari daerah kontrol 105

14 DAFTAR LAMPIRAN Halaman Lampiran 1 Daflar kura-kura yang ada di Indonesia 111 Lampiran 2 Peta penyebaran labi-labi, Dogania subplana, di 113 lndonesia Lampiran 3 Runutan dan perbandingan nukleotida domain tengah dari 114 daerah kontrol pada masing-masing haplotipe mtdna D. subplana yang diapit oleh primer 577 dan 578 Lampiran 4 Runutan nukleotida Cyt b, trna Thr, trna Pro, dan 121 domain tengah dari daerah kontrol genom mitokondria beberapa spesies kura-kura Lampiran 5 Daftar spesies yang digunakan dalam analisis filogeni 133 amniota bersama-sama dengan D. subplana

15 DAFTAR SINGKATAN 12Sr RNA 16Sr RNA ATPase 6 ATPase 8 COI COll COlll Cyt b NDI ND2 ND3 ND4 ND4L ND5 ND6 dloop trna - (J A G C T 12s ribosomal RNA 16s ribosomal RNA Adenosine triphosphatase sub unit 6 Adenosine triphosphatase sub unit 8 Cytochrome c oxidase sub unit 1 Cytochrome c oxidase sub unit I1 Cytochrome c oxidase sub unit 111 Cytochrome b apoenzyme Nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase sub unit 1 Nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase sub unit 2 Nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase sub unit 3 Nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase sub unit 4 Nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase sub unit 4L Nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase sub unit 5 Nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase sub unit 6 Displacement loop Transfer RNA three letter amino acid abbreviation (anticodon) Adenine Guanine Cytosine Timine