ANALISIS KOMUNITAS BAKTERI SELAMA TAHAPAN PERKEMBANGAN LARVA UDANG PUTIH (Litopenaeus vannamei) ARTINI PANGASTUTI

Transkripsi

1 ANALISIS KOMUNITAS BAKTERI SELAMA TAHAPAN PERKEMBANGAN LARVA UDANG PUTIH (Litopenaeus vannamei) ARTINI PANGASTUTI SEKOLAH PASCA SARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2008

2 PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI DAN SUMBER INFORMASI Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi berjudul Analisis Komunitas Bakteri Selama Tahapan Perkembangan Larva Udang Putih (Litopenaeus vannamei) adalah karya saya sendiri dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi dimanapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka dalam disertasi ini. Bogor, November 2008 Artini Pangastuti G

3 RINGKASAN Udang putih (Litopenaeus vannamei) merupakan salah satu komoditas ekspor andalan Indonesia. Dalam budidaya udang, komunitas bakteri yang berasosiasi dengan udang telah diketahui memiliki peran penting bagi kelangsungan hidup inangnya. Selama ini, penelitian mengenai komunitas bakteri yang berasosiasi dengan udang masih menggunakan metode kultur. Dalam penelitian ini, metode berbasis molekular, yaitu Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism (T-RFLP) dan Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis (ARDRA) digunakan untuk memonitor keragaman bakteri yang berasosiasi dengan tahap-tahap perkembangan larva, struktur komunitasnya selama perkembangan larva, serta pembentukan komunitas bakteri ini.. Sampel untuk analisis diperoleh dari satu siklus produksi di hatchery berupa telur, nauplii, zoea, mysis, dan post larva. T-RFLP dan ARDRA menggunakan marker yang sama, yaitu gen 16S rrna, tetapi untuk T-RFLP amplifikasi dilakukan dengan primer forward yang dilabel pada ujung 5 sedangkan untuk ARDRA menggunakan primer yang tidak dilabel. Baik T-RFLP maupun ARDRA menunjukkan bahwa tiap tahapan perkembangan larva memiliki pola sidik ragam komunitas bakteri yang unik. Komunitas bakteri berubah secara dinamis mengikuti perkembangan larva, kecuali pada tahapan yang lebih akhir, di mana sistem imunitas dan pencernaan larva sudah berkembang lebih sempurna. Proses molting menyebabkan komunitas bakteri selalu berubah karena lapisan kitin saluran pencernaan ikut mengelupas dan lapisan yang baru bebas dari bakteri. Berdasarkan analisis keragaman, komunitas bakteri pada mysis atau post larva memiliki tingkat keragaman dan distribusi jenis yang paling tinggi dan merata, sementara komunitas bakteri pada zoea adalah yang terendah keragamannya dan tidak merata. Filotipe yang dominan pada masing-masing tahapan berbeda. Demikian juga terdapat perbedaan antara komunitas bakteri yang berasosiasi dengan larva dan komunitas bakteri di air pemeliharaannya. Jenis yang dominan pada air pemeliharaannya bukan merupakan jenis yang dominan berasosiasi dengan larva. Akan tetapi, beberapa filotipe dapat ditemukan pada keduanya, dan secara bersama-sama filotipe-filotipe ini dalam komunitas memiliki kemelimpahan relatif yang besar dan dominan. Selain air, kemungkinan pakan juga mempengaruhi komposisi komunitas bakteri yang berasosiasi dengan larva.

4 T-RFLP dan ARDRA dapat menggambarkan keragaman dalam komunitas bakteri secara lebih baik dibandingkan teknik kultur, tetapi ARDRA menghasilkan pengukuran tingkat keragaman yang lebih tinggi dibandingkan analisis T-RFLP. Dengan teknik kultur didapatkan 7 isolat yang termasuk dalam 3 kelompok, yaitu Proteobacteria, Bacteroidetes, dan Firmicutes. Tidak satupun dari isolat-isolat ini yang muncul dalam hasil T-RFLP kecuali ada beberapa genus yang sama dalam jumlah minoritas. Kemungkinan sebagian besar bakteri yang berasosiasi dengan larva udang putih tidak dapat dikultur. Identifikasi TRF (Terminal Restriction Fragment) yang dominan untuk tiap tahapan adalah: Proteobacteria untuk telur, Bacteroidetes untuk nauplii, Cyanobacteria untuk zoea, dan Proteobacteria untuk mysis dan post larvae. Tipe ARDRA yang dominan diidentifikasi berdasarkan sekuens gen 16S rrna klon. Proteobacteria merupakan kelompok yang dominan dalam komunitas bakteri hampir di seluruh tahapan, tetapi terdapat perbedaan dengan hasil T-RFLP. Sementara itu tipe yang dominan pada tahap zoea memiliki kekerabatan paling dekat dengan suatu klon Chloroflexi. Semua sekuens hanya memiliki tingkat kesamaan 96% dengan kerabat terdekatnya di database, menunjukkan bahwa sebagian besar bakteri yang berasosiasi dengan larva udang putih adalah spesies yang baru. Kerabat terdekat dari sekuenssekuens tersebut sebagian besar merupakan jenis bakteri yang tidak dapat dikultur, menguatkan dugaan bahwa bakteri-bakteri dalam komunitas itu mayoritas tidak dapat dikultur. Dengan demikian, teknik yang berbasis kultur tidak dapat diandalkan untuk mengungkap keragaman pada komunitas bakteri ini. Teknik berbasis molekular lebih baik untuk diterapkan dalam monitoring komunitas bakteri sepanjang proses produksi benur di hatchery. Analisis T-RFLP dapat digunakan untuk memonitor perubahan sidik ragam komunitas bakteri akibat suatu perlakuan. Dengan teknik ini dapat ditunjukkan bahwa perlakuan perendaman dengan Povidone iodine pada telur dan nauplii dapat menurunkan kandungan total bakteri. Akan tetapi efeknya hanya bersifat sementara, jumlah bakteri kembali pulih pada tahapan lebih lanjut. Povidone iodine memiliki efek yang berbeda pada berbagai kelompok bakteri yang berasosiasi dengan larva udang putih. Oleh karena itu, perlakuan ini juga dapat mengubah profil komunitas bakteri yang berasosiasi dengan larva udang putih serta menurunkan tingkat keragamannya. Kemungkinan perlakuan ini

5 dapat berbalik menimbulkan efek negatif jika menyebabkan bakteri yang menguntungkan tertekan pertumbuhannya dan bakteri patogen menjadi lebih dominan. Untuk itu penggunaan disinfektan untuk mengendalikan jumlah kandungan bakteri perlu dipertimbangkan kembali dari segi keuntungan maupun kerugiannya dalam rangka perbaikan produksi akuakultur.

6 Hak Cipta milik IPB, tahun 2008 Hak Cipta dilindungi Undang-Undang 1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumber. a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah b. Pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB. 2. Dilarang mengumumkan atau memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

7 ABSTRACT ARTINI PANGASTUTI. Analyses of bacterial communities during developmental stages of white shrimp (Litopenaeus vannamei) larvae. Supervised by ANTONIUS SUWANTO (Major Advisor), YULIN LESTARI, MAGGY THENAWIDJAYA SUHARTONO (Co advisor) Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism (T-RFLP) and Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis (ARDRA) were used to monitor the population dynamics of bacterial communities associated with different developmental stages of white shrimp (Litopenaeus vannamei) larvae. Samples were collected from egg, nauplii, zoea, mysis, and post larvae stages in one cycle of production at hatchery. Either T- RFLP or ARDRA indicated that every stage of shrimp development had unique fingerprint pattern of microbial community. Diversity analyses showed that bacterial community of mysis or post larvae had the highest diversity and evenness, meanwhile bacterial community of zoea had the lowest diversity. There were differences between bacterial community of larvae and its rearing water for all stages, but some phylotypes were found either in larvae body or rearing water. Identification of most abundant TRF for each stage resulted in Proteobacteria for egg, Bacteroidetes for nauplii, Cyanobacteria for zoea, and Proteobacteria for mysis and post larvae. Bacterial community richness were higher using molecular-based techniques than culture, but ARDRA resulted in more diversity and evenness than T-RFLP analyses for almost all stages of larvae development. Dominant ARDRA types were identified based on the sequence of 16S rrna genes. Proteobacteria was dominant group in bacterial community for all stages except zoea. All sequences only had 96% similarity with closest relatives in database, suggesting that most bacteria associated with white shrimp larvae were novel species and might be unculturable. As shown by T-RFLP analysis, Povidone iodine treatment for eggs and nauplii caused temporal decrease in total bacterial load. The treatment also affected diversity and changed the profile of bacterial communities associated with white shrimp larvae throughout developmental stages.

8 ANALISIS KOMUNITAS BAKTERI SELAMA TAHAPAN PERKEMBANGAN LARVA UDANG PUTIH (Litopenaeus vannamei) ARTINI PANGASTUTI Disertasi Sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Doktor pada Program Studi Biologi SEKOLAH PASCA SARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2008

9 PRAKATA Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT atas berkah dan karunianya sehingga penulis dapat menyelesaikan penulisan disertasi dengan judul : Analisis Komunitas Bakteri Selama Tahapan Perkembangan Larva Udang Putih (Litopenaeus vannamei). Penelitian ini tidak akan terlaksana tanpa bantuan dari banyak pihak. Untuk itu penulis mengucapkan terima kasih kepada Prof. Dr. Antonius Suwanto, Dr. Ir. Yulin Lestari, serta Prof. Dr. Maggy T. Suhartono atas bimbingan dan arahan sebelum dan selama pelaksanaan pelitian serta penulisan naskah disertasi ini. Sungguh banyak masukan dan ilmu yang penulis dapatkan dari para pembimbing yang sangat berguna dalam kelanjutan karir penulis setelah ini. Sungguh suatu kehormatan bagi penulis untuk dapat bekerja sama dengan para pembimbing. Terima kasih juga kepada Dr. Aris Tri Wahyudi, Dr. Widanarni, dan Dr. Akhmaloka atas kesediaannya menguji dan memberi masukan bagi disertasi ini. Penulis juga mengucapkan terima kasih pada PT. Charoen Phokphand Indonesia atas dana dan fasilitas untuk penelitian yang telah diberikan, juga pada Marine Research Center PT. Central Pertiwi Bahari untuk fasilitas pemeliharaan larva udang. Terima kasih kepada seluruh staf peneliti dari R &D PT. CPI dan MRC PT. CPB atas segala bantuannya selama penulis melaksanakan penelitian ini. Untuk analisis bioinformatika, penulis mengucapkan terima kasih kepada Yepy Hardy Rustam dari PT. CPI atas bantuannya. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Dirjen DIKTI Depdiknas atas biaya studi S3 di Institut Pertanian Bogor melalui BPPS. Terakhir, penulis mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya untuk suami, anak-anak, dan segenap keluarga atas dukungan dan kesempatan yang selalu diberikan pada penulis selama menempuh pendidikan dalam 3 tahun ini. Bogor, November 2008 ARTINI PANGASTUTI

10 RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 31 Mei 1975 dari ayah Hadi Subroto dan ibu Budiarti Wirasmani. Pendidikan dasar dan menengah penulis tamatkan di Surakarta, yaitu SDN Cemara Dua tahun 1987, SMPN I tahun 1990, dan SMAN I tahun Tahun 1993 penulis diterima di Institut Pertanian Bogor melalui jalur USMI dan diterima di Jurusan Biologi FMIPA IPB tahun berikutnya. Gelar Sarjana Sains penulis dapatkan pada tahun 1998 dan langsung bekerja di FMIPA Universitas Sebelas Maret Surakarta. Pada tahun yang sama, melalui program DUE dari DIKTI, penulis melanjutkan studi S2 di Institut Pertanian Bogor dengan mengambil spesialisasi mikrobiologi. Gelar Magister Sains diterima pada tahun Kemudian pada 2005 penulis kembali ke Institut Pertanian Bogor untuk menempuh studi S3 dengan sponsor BPPS. Setelah diterima pada tahun 1998 di FMIPA UNS, penulis diangkat sebagai Pegawai Negeri Sipil pada tahun 2000 dan menjabat sebagai Asisten Ahli tahun Berturut-turut pada tahun 2004 dan 2005 penulis mendapatkan dana Penelitian Dosen Muda dari Dikti.

11 DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL... v DAFTAR GAMBAR... vi PENDAHULUAN... 1 TINJAUAN PUSTAKA... 4 Produksi dan Ekspor Udang Indonesia... 4 Perkembangan dan Siklus Hidup Udang Putih (Litopenaeus 5 vannamei)... Komunitas Bakteri pada Hewan Akuatik... 8 Pembentukan dan Dinamika Komunitas Bakteri pada Hewan Akuatik 9 Keragaman Komunitas Bakteri yang Berasosiasi dengan Hewan Akuatik Pengaruh Pakan pada Komposisi Mikrobiota Interaksi Mikrobiota dengan Inang Eksplorasi Komunitas Bakteri Berbasis Molekular BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian Pengambilan dan Penyiapan Sampel Ekstraksi DNA Amplifikasi Gen 16S rrna untuk T-RFLP Digesti Amplikon Analisis T-RFLP Penghitungan Jumlah Bakteri dan Isolasi Amplifikasi gen 16S rrna untuk ARDRA Kloning Produk PCR 16S rrna ARDRA Sekuensing Gen Penyandi 16S rrna Analisis Keragaman Diagram Alur Pekerjaan HASIL DAN PEMBAHASAN Penghitungan Jumlah dan Isolasi Bakteri yang Dapat Dikultur Analisis Komunitas Bakteri dengan T-RFLP Pembentukan Komunitas Bakteri yang Berasosiasi Dengan Larva Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis (ARDRA) 50 Perbandingan Teknik Berbasis Kultur dan Molekular Pengaruh Perlakuan Iodine terhadap Komunitas Bakteri... 60

12 KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan Saran DAFTAR PUSTAKA LAMPIRAN... 82

13 DAFTAR TABEL Halaman 1. Produksi udang Indonesia menurut spesies (dalam Ton) Tahapan perkembangan larva udang putih Hasil identifikasi isolat yang berasosiasi dengan telur/larva Perbandingan jumlah relatif (%) kelompok bakteri yang ditemukan pada tahapan perkembangan larva Filotipe yang berasosiasi dengan 3 atau lebih tahapan perkembangan larva udang putih Filotipe unik yang ditemukan pada tahapan perkembangan larva tertentu Keragaman bakteri pada tiap tahap perkembangan larva Filotipe yang kemungkinan berasal dari induk Keragaman komunitas pada tiap tahapan perkembangan larva dengan ARDRA Hasil analisis sekuens dari klon yang dominan pada tiap tahapan Perbandingan keragaman yang terukur dengan teknik T-RFLP dan ARDRA Perbandingan kelompok yang dominan pada tahap-tahap perkembangan larva dengan menggunakan teknik berbeda Keragaman komunitas bakteri yang berasosiasi dengan tahapan perkembangan larva udang putih tanpa dan dengan perlakuan iodine Filotipe yang sensitif terhadap iodine Filotipe yang resisten terhadap iodine... 69

14 DAFTAR GAMBAR Halaman 1. Siklus hidup Udang Putih (Litopenaeus vannamei) Prosedur dalam analisis T-RFLP Skema pengambilan sampel dalam satu siklus produksi benur di hatchery Jumlah CFU (Colony Forming Unit) bakteri dari air dan udang Jumlah CFU (Colony Forming Unit) untuk kelompok Vibrio dari air dan udang Komposisi isolat yang ditemukan pada tiap tahapan perkembangan larva Komposisi TRF Sau3A1 selama tahapan perkembangan larva Perkiraan jumlah bakteri berdasarkan luas Peak Area T-RFLP Perbandingan komposisi TRF Sau3A1 pada udang dengan air pemeliharaan selama tahapan perkembangan larva Grafik hubungan antara jumlah klon dan jumlah tipe yang ditemukan Hubungan kekerabatan klon yang dominan pada tiap tahapan perkembangan larva udang putih dengan beberapa bakteri yang memiliki kedekatan kekerabatan berdasar hasil analisis sekuensing Jumlah total bakteri pada udang tanpa dan dengan perlakuan iodine Jumlah total Vibrio pada udang dengan dan tanpa perlakuan iodine Komposisi komunitas bakteri yang berasosiasi dengan udang tanpa dan dengan perlakuan iodine Komposisi Vibrio yang berasosiasi dengan udang tanpa dan dengan perlakuan iodine Perkiraan jumlah total bakteri tanpa dan dengan perlakuan iodine berdasarkan total peak area TRF Perbandingan komposisi TRF Sau3A1 selama tahapan perkembangan larva tanpa dan dengan perlakuan iodine... 67

15 DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1. TRF hasil pemotongan dengan enzim Sau3A1 yang ditemukan pada tahaptahap perkembangan larva udang putih Elektroforegram analisis T-RFLP komunitas bakteri pada udang dan air pemeliharaannya... 85